세포 분류에 의한 폐 레티노이드 함유 세포의 분리

아래에 설명된 프로토콜은 특이적 레티노이드 자가형광을 사용하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 매우 이질적인 폐 세포 집단에서 레티노이드 함유 세포를 분리하는 간단하고 효과적인 방법입니다.

레티노이드(비타민 A 및 그 대사 산물)는 폐포 미세환경의 필수 지질 구성 요소이며, 발달 중인 폐와 성인 폐의 기능적 건강을 유지하기 위해서는 세포형 특이적 레티노이드 대사가 필요합니다. 폐 세포는 특정 경로를 활용하여 혈액에서 순환하는 레티노이드를 레티놀(ROH)로 효율적으로 흡수한 다음 세포 내에서 ROH를 전사 활성 레티노이드 종인 all-trans-retinoic acid(ATRA)로 단계적으로 변환합니다. ATRA 매개 (또는 레티노이드 매개 신호전달)는 폐포형성, 계면활성제 생성, 혈관신생, 투과성 및 면역을 조절하는 데 중요합니다. 중요한 것은 섬유아세포를 포함한 특정 폐 세포가 레티닐 에스테르(RE) 형태로 레티노이드를 축적할 수 있으며, 이는 필요할 때 인접 세포로 전달하기 위해 ROH로 저장하거나 추가로 동원할 수 있다는 것입니다. 폐 레티노이드 함유 세포는 레티노이드 자가형광(350nm에서 여기 시 455nm에서 방출)을 사용하고 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 분해된 폐의 단일 세포 현탁액에서 분리 및 수집할 수 있습니다. 적색 형광 단백질이 있는 폐 세포의 추가적인 세포 특이적 in vivo 라벨링을 통해 특정 레티노이드 함유 폐 세포 집단을 분리하고 수집할 수 있습니다. 수집된 세포는 세포 형태, 유전자 발현 및 약리학적 조작에 대한 반응성에 대한 추가 분석을 위해 직접 분석하거나 배양할 수 있습니다. 이 분리 및 적용 기법은 폐 건강 및 폐 손상에 대한 동물 모델 연구를 통해 폐 내 레티노이드 대사의 세포 측면과 지질 매개 세포 통신에 대한 더 깊은 통찰력을 얻는 데 중요합니다.

레티노이드(비타민 A 및 그 대사 산물)는 폐포 미세환경의 필수 지질 구성 요소이며, 발달 중인 성인 폐의 기능적 건강을 유지하기 위해서는 세포형 특이적 레티노이드 대사 및 신호 전달이 필요합니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ^,12,13,14. 폐 세포는 특정 경로를 활용하여 혈액에서 순환하는 식이 유래 레티노이드를 레티놀(ROH)15,16,17,18,19로 효율적으로 흡수한 다음, 세포 내에서 ROH가 전사 활성 레티노이드 종인 전-트랜스 레티노이드산(ATRA)으로 단계적으로 전환됩니다²⁰. ATRA 매개 (또는 레티노이드 매개 신호전달)는 3개의 서로 다른 동족 핵 호르몬 수용체인 레티노산 수용체(RARα, RARβ 및 RARγ^21,22)와의 ATRA 상호작용을 통해 이루어지며, 폐포 정화^조절 23,24,25,26,27,28,29, 계면활성제 생성^30, 31,32,33,34,35, 혈관신생³⁶, 투과성 ³⁷, 면역 38,39,40. 중요한 것은 특정 폐 세포, 특히 폐 섬유아세포(lung fibroblast)가 레티닐 에스테르(retinyl ester, RE) 형태로 레티노이드를 축적할 수 있으며, 이는 필요할 때 인접 세포로 전달하기 위해 ROH로 저장되거나 추가로 동원될 수 있다는 것입니다¹.

레티노이드 대사 및 신호 전달의 복잡성과 폐의 세포 복잡성으로 인해 in vivo 에서 폐의 레티노이드 대사를 탐구하는 것을 목표로 하는 연구가 어렵습니다. 당사는 특정 레티노이드 자가형광(350nm에서 여기 시 455nm에서 방출)을 사용하고 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 매우 이질적인 폐 세포 집단에서 레티노이드 함유 세포(그림 1)를 분리하기 위한 간단하고 강력한 프로토콜을 설명했습니다. 이 프로토콜은 연구의 목표가 레티노이드를 저장하는 능력을 기반으로 1차 살아있는 폐 세포를 분리하고 특성화하는 것인 경우 생존능 염색을 제외하고는 추가 세포 라벨링을 요구하지 않습니다. 이를 통해 세포 분류를 위한 준비 시간이 크게 단축되고, 추가 염색의 필요성이 제거되며, 생존 가능한 일차 세포를 높은 수율로 분리할 수 있습니다. 그러나 연구의 목표가 특정 폐 세포 집단(섬유아세포, 내피세포, 상피 세포 또는 면역 세포)을 분리하고 특성화하는 것인 경우, 분류된 레티노이드 함유 세포를 세포 특이적 항체로 라벨링한 후 추가 세포 분류를 수행할 수 있습니다.

레티노이드 자가형광은 레티노이드 함유 세포의 정체를 규명하거나 간^41,42,43,44, 췌장^45,46, 신장 41,47 및 폐 ⁴¹에서 이러한 세포의 풍부함을 정량화하기 위해 발표된 연구에서 사용되었습니다. 또한, 여러 연구 그룹은 레티노이드 형광을 사용하여 FACS로 분리하고 간 44,48,49,50,51,52,53 및 폐 1을 포함한 살아있는 조직에서 1차 레티노이드 함유 세포를 연구했다고 보고했습니다. 현재 프로토콜에서는 tdTomato(적색 형광 단백질)를 사용하여 레티노이드 함유 세포를 분리하기 전에 in vivo에서 특정 세포 집단을 표지할 수 있는 방법을 보여줍니다. tdTomato의 스펙트럼 특성(554nm^에서 여기 시 581nm에서 방출) 및 밝기는 레티노이드 자가형광을 방해하지 않으므로 분류 중에 세포 특이성을 달성하는 것이 편리합니다. 정상적인 폐포 미세환경¹ 내에서 손상되지 않은 레티노이드 대사 및 신호 전달의 중요한 역할을 감안할 때, 설명된 폐 세포 분리 기술은 폐 건강 및 질병에 대한 동물 모델 연구에서 폐 내 레티노이드 대사의 세포 측면과 생체 내 지질 매개 세포 통신에 대한 더 깊은 통찰력을 얻는 데 유용한 도구입니다.

마우스와 관련하여 설명된 모든 절차 및 실험은 미국 국립과학원(National Academy of Sciences)⁵⁵에서 준비한 실험용 동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 요약된 기준에 따라 Rutgers University(IACUC ID: PROTO202200111)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다.

1. 실험을 위한 고려 사항 및 준비 사항

1. 축산과 조작
   참고 : 3 개월 된 (10-12 주령) 수컷 및 암컷 마우스를 연구에 사용할 수 있습니다. C57BL/6J 유전자 배경에 있는 레시틴:레티놀 아실트랜스퍼라제-결핍 마우스(Lrat-deficient, Lrat^-/- 마우스⁵⁶) 및 연령 일치 리터메이트(야생형, Lrat^+/+ 마우스)를 기술된 실험에 사용하였다. 섬유아세포에서 tdTomato 유전자를 발현하는 마우스(F-tdT 마우스)는 tdTomato 리포터 카세트(B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J, Jackson Lab 균주 #007914)과 Col1a2-CreER 마우스(B6. Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, Jackson Lab 균주 #029567).
   1. in vivo에서 타겟 세포 집단을 라벨링하기 위해 사용할 수 있는 많은 옵션 중 하나인 Cre-expressing mouse model을 사용합니다.
      참고: 표적 세포의 선택, Cre 발현, Cre 매개 재조합의 효율성 및 세포 특이성에 따라 연구자는 신뢰할 수 있는 Cre 발현 마우스 모델을 활용할 수 있습니다.
   2. tdTomato transgene 발현(아래 설명 및 타목시펜 처리 시)을 사용하여 Col1a2⁺ 섬유아세포를 라벨링한 다음 아래와 같이 소화된 폐의 단세포 현탁액에서 분리합니다.
2. CRE 매개 재조합 및 in vivo 전이유전자 활성화
   1. 총 5일 동안 연속 24시간마다 한 번씩 2mg의 타목시펜을 복강내(IP) 주입하여 F-tdT 마우스에서 Cre 발현을 유도합니다.
   2. 주사 전에 70% 에탄올로 주사 부위를 소독하십시오. 최종 타목시펜 주사 후 1개월 후에 실험에 마우스를 사용합니다.
   3. 선별 실험에 앞서 Cre-recombination의 효과를 확인합니다. anti-Pdgfrα magnetic beads 및 magnetic-activated cell sorting (MACS)를 사용하여 tamoxifen 처리된 F-tdT 마우스에서 폐 섬유아세포의 타겟 세포 집단을 분리하여 효과적인 Cre 재조합 및 tdTomato 발현을 확인합니다.
3. 용액, 플라스틱 및 유리 제품의 준비
   알림: 아래 설명된 절차에 대해 무균 기술을 따라야 합니다. 용액 준비, 조직 소화 및 세포 분리와 관련된 절차는 층판 후드 아래에서 수행되어야 합니다. 용액은 0.2μm 필터를 사용하여 여과하여 멸균해야 합니다. 수술 도구와 실험기구는 고압증기멸균으로 멸균해야 합니다.
   1. 층류 후드 아래에서 폐 관류(마우스당 5mL)를 위해 칼슘 및 마그네슘이 없는 행크스의 균형 잡힌 염 용액(HBSS, Ca²⁺/Mg²⁺가 없는 HBSS, 5.3mM KCl, 0.4mM KH₂PO₄, 4.2 mM NaHCO₃, 137.9 mM NaCl, 0.3 mM Na₂HPO₄, 5.6 mM D-Glucose 포함)을 준비합니다. 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 멸균하고 주사기에 용액을 채웁니다.
   2. 층류 후드 아래에서 칼슘 및 마그네슘이 포함된 Hanks의 균형 잡힌 소금 용액을 준비합니다(Ca²⁺/Mg²⁺를 함유한 HBSS, 1.3mM CaCl₂, 0.5 MgCl_2·6H₂O, 0.4 mM MgSO_4·7H₂O, 5.3 mM KCl, 0.4 mM KH₂PO₄, 4.2 mM NaHCO₃, 137.9 mM NaCl, 0.3 mM Na₂HPO₄, 5.6 mM D-Glucose), 폐 관류를 위한 0.3 mg/mL의 IV 콜라겐 분해효소 및 1 mg/mL의 dispase를 함유(마우스당 10 mL). 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 멸균하고 주사기에 용액을 채웁니다.
   3. 층류 후드 아래에서 폐 소화를 위해 0.3mg/mL의 IV형 콜라겐분해효소, 1mg/mL의 디스파제, 5mg/mL의 DNase I을 함유한 Ca²⁺/Mg²⁺로 HBSS를 준비합니다(마우스당 10mL). 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 멸균하고 주사기에 용액을 채웁니다.
   4. 층류 후드 아래에서 세포 배양 접시(35mm 10mm, 마우스 1마리에서 채취한 폐당 접시 1개)에 Ca²⁺/Mg²⁺가 함유된 멸균 HBSS 2mL를 채웁니다. Ca²⁺/Mg²⁺ 가 든 HBSS가 들어있는 접시를 얼음 위에 놓습니다.

2. 폐 관류, 소화 및 단세포 현탁액의 수집

1. IP 주사를 통해 10mg/mL 케타민과 2mg/mL 자일라진을 함유한 마취 칵테일을 체중 0.01mL/g의 용량으로 투여하여 마우스를 마취합니다.
2. 발가락 꼬집음 반응을 평가하여 마우스가 깊은 무의식 상태에 있는지 확인하십시오. 수술 부위에서 느슨한 머리카락과 눈에 보이는 먼지/부스러기를 제거하고 소독을 위해 70% 알코올을 사용하여 수술 부위를 클립으로 닦아 깨끗이 닦습니다.
3. 멸균 수술 도구를 사용하여 복강과 흉강을 엽니다. 갈비뼈와 횡격막을 잘라 폐와 심장을 노출시킵니다.
   알림: 이것은 개흉술이 마우스가 마취되는 동안 호흡을 멈추게 하므로 즉각적인 죽음을 보장합니다. 적절하게 수행되면 절차의 이 부분은 절차 시작부터 개흉술이 시행될 때까지 최대 3분이 소요되며 그 후 동물이 사망합니다.
4. 하대정맥을 절개하고 흡수 패드를 바르면 방출된 혈액을 흡수할 수 있습니다.
5. Ca²⁺/Mg²⁺가 없는 멸균 HBSS 5mL로 채워진 25G X 1" 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 심장의 우심실을 통해 폐를 제자리에서 관류합니다. 관류가 성공하면 폐 조직이 하얗게 됩니다.
6. IV형 콜라겐분해효소(0.3mg/mL) 및 디스크아제(1mg/mL)를 함유한 Ca²⁺/Mg²⁺의 멸균 HBSS 10mL로 채워진 25G X 1" 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 폐를 현장에서 관류합니다.
7. 폐를 제거하고 Ca²⁺/Mg²+가 함유된 멸균 HBSS 2mL가 있는 세포 배양 접시(35mm X 10mm)로 옮깁니다.
8. 층판 후드 아래에서 폐를 헹구고 멸균 수술용 칼날(#20, 핸들 #4에 맞음)을 사용하여 작은 조각으로 다집니다. 다진 조직에 0.3mg/mL의 IV형 콜라겐분해효소, 1mg/mL의 디스파제, 5mg/mL의 DNase I을 포함하는 Ca²⁺/Mg²⁺ 가 포함된 HBSS의 첫 번째 5mL를 다진 조직에 첨가하고 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 이식하여 다진 폐를 15mL 튜브로 옮깁니다. 0.3mg/mL의 IV형 콜라겐분해효소, 1mg/mL의 디스파제, 5mg/mL의 DNase I을 함유한 Ca²⁺/Mg²⁺ 가 함유된 HBSS의 나머지 5mL와 함께 세포 배양 접시를 세척하여 남은 다진 조직 잔류물을 수집하고 전달합니다.
9. 37°C에서 45분 동안 유지되는 회전 셰이커에서 0.3mg/mL의 IV형 콜라겐분해효소, 1mg/mL의 디스파제, 5mg/mL의 DNase I을 포함하는 Ca²⁺/Mg²⁺ 와 함께 HBSS의 다진 폐 조직을 배양합니다. 15분씩 3회 간격으로 층판 후드 아래에 다진 조직을 10회 10회 통과시켜 세포를 더 잘 해리시킵니다.
10. 생성된 세포 현탁액을 100μm 스트레이너에 통과시켜 단일 세포를 5% 미만의 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 20mL의 저온 생세포 이미징 용액(20mM HEPES를 함유하는 생리적 식염수, pH 7.4)이 들어 있는 50mL 튜브에 단일 세포를 수집합니다. 500g에서 4°C에서 10분 동안 원 심분리하여 세포를 수집합니다.
11. 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 적혈구 용해 완충액 1mL에 재현탁시키고 튜브를 실온(RT)에서 5분 동안 방치하여 적혈구를 제거합니다. FBS가 5% 미만인 저온 살아있는 세포 이미징 용액 20mL를 추가합니다. 500g에서 4°C에서 10분 동안 원 심분리하여 세포를 수집합니다.
12. 상등액을 흡인하고 FBS가 5% 미만인 20mL의 저온 라이브 세포 이미징 용액에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 생성된 세포 현탁액을 40μm 스트레이너에 통과시켜 FBS가 5% 미만인 20mL의 저온 살아있는 세포 이미징 솔루션이 들어 있는 50mL 튜브에 단일 세포를 수집합니다. 500g에서 4°C에서 10분 동안 원 심분리하여 세포를 수집합니다.
13. 상층액을 흡인하고 FBS가 5% 미만인 10mL의 저온 살아있는 세포 이미징 용액에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 세포를 세고 세포 농도를 ~5-10 x 10⁶ cells/mL로 조정합니다.

3. FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)를 사용한 레티노이드 함유 폐 세포 분리

1. 세포 현탁액의 부분 표본을 채취하여 염색되지 않은 게이팅 대조제로 사용하기 위해 따로 보관합니다. 나머지 세포 현탁액에 생존도 염료 SYTOX Green을 추가합니다(1:1000 희석, 최종 농도 30nM).
2. 폴리스티렌 5mL(12 x 75mm) 수집 튜브에 부착된 필터를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다.
3. 455nm에서의 방출을 기준으로 살아있는 개별 레티노이드 함유 세포를 분류하여 FACS 세포 분리를 진행합니다. 전방 산란(전방 산란 높이/FSC-H 대 전방 산란 영역/FSC-A)에 대한 플롯을 사용하여 순차적으로 단일항 구별을 수행합니다. 산란 특성(측면 산란)과 SYTOX Green으로 염색하여 죽은 세포를 제외합니다.
4. 350nm에서 여기(excitation) 시 455nm에서 방출(emission at 455 nm)을 사용하여 살아 있는 레티노이드(retinoid)를 함유한 단일 세포를 게이트, 분류 및 수집합니다.
   참고: 설명된 절차를 사용하여 하나의 마우스 폐에서 약 5·10⁵ 개의 레티노이드 함유 폐 세포를 수집할 수 있습니다.
5. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 FACS 데이터 분석을 수행합니다.

폐 레티노이드 함유 세포의 분리
마우스 폐(Lrat^+/+ 및 Lrat^-/-에서) 마우스를 효소로 소화하고, 단세포 현탁액을 제조하고 위에서 설명한 절차에 따라 FACS를 실시했습니다. 세포 분류 및 데이터 수집은 100μm 노즐과 15psi 압력을 사용하여 SpectroFlo CS 소프트웨어 버전 1.3.0으로 작동하는 Cytek Aurora™ Cel...

형광성 현미경 검사법을 사용하여 인간과 동물성 조직 및 그것의 조직학적인 구상에 있는 비타민 A 탐지의 기능은 1940년대^59,60 일찌감치 처음으로 보고되었다. 그런 다음 레티노이드 자가형광 현상을 시험관 내 조직에서 고농도의 비타민 A를 찾아내고(⁶¹) 형광 현미경을 사용하여 동물 배아 조직

저자는 공개할 내용이 없습니다.

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)/국립심장폐혈액연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute, NIH/NHLBI) R01 HL171112(I.S.)의 보조금, 미국 국립보건원(National Institutes of Health)/국립환경보건과학연구소(NIH/NIEHS)의 자금 지원을 받는 Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease(환경노출 및 질병)의 경력 개발상(I.S)의 보조금으로 지원되었으며, P30 ES005022, Rutgers, The State University of New Jersey (to I.S.)의 창업 자금. 저자는 이 원고에 제시된 작업에 기여한 Rutgers Cancer Institute의 Immune Monitoring and Flow Cytometry Shared Resource(NCI-CCSG P30CA072770-5920의 일부 자금 지원) 직원에게 감사의 뜻을 전합니다.