Isolement de cellules contenant des rétinoïdes pulmonaires par tri cellulaire

Le protocole décrit ci-dessous est un moyen simple et efficace d’isoler des cellules contenant des rétinoïdes dans des populations de cellules pulmonaires très hétérogènes en utilisant l’autofluorescence rétinoïde spécifique et en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.

Les rétinoïdes (vitamine A et ses métabolites) sont un composant lipidique essentiel du microenvironnement alvéolaire, et le métabolisme des rétinoïdes spécifique au type cellulaire est nécessaire pour maintenir la santé fonctionnelle des poumons en développement et adultes. Les cellules pulmonaires utilisent des voies spécifiques, permettant l’absorption efficace des rétinoïdes circulants du sang sous forme de rétinol (ROH), suivie d’une conversion intracellulaire par étapes du ROH en l’espèce de rétinoïde transcriptionnellement active, l’acide tout-trans-rétinoïque (ATRA). La signalisation médiée par l’ATRA (ou médiée par les rétinoïdes) est cruciale pour réguler l’alvéolarisation pulmonaire, la production de surfactant, l’angiogenèse, la perméabilité et l’immunité. Il est important de noter que des cellules pulmonaires spécifiques, y compris les fibroblastes, peuvent accumuler des rétinoïdes sous forme d’esters de rétinyle (RE), qui peuvent être stockés ou mobilisés sous forme de ROH pour être transférés aux cellules voisines si nécessaire. Les cellules contenant des rétinoïdes pulmonaires peuvent être isolées et collectées à partir de la suspension unicellulaire de poumons digérés en utilisant l’autofluorescence rétinoïde (l’émission à 455 nm lors de l’excitation à 350 nm) et en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Un marquage in vivo supplémentaire spécifique des cellules pulmonaires avec une protéine fluorescente rouge permet d’isoler et de collecter des populations spécifiques de cellules pulmonaires contenant des rétinoïdes. Les cellules collectées peuvent être directement analysées ou cultivées pour des analyses plus approfondies de la morphologie cellulaire, de l’expression des gènes et de la réponse aux manipulations pharmacologiques. Cette technique d’isolement et d’application est importante pour les études sur des modèles animaux de la santé pulmonaire et des lésions pulmonaires afin de mieux comprendre les aspects cellulaires du métabolisme des rétinoïdes dans les poumons et les communications cellulaires à médiation lipidique.

Les rétinoïdes (vitamine A et ses métabolites) sont un composant lipidique essentiel du microenvironnement alvéolaire, et le métabolisme et la signalisation des rétinoïdes spécifiques au type de cellule sont nécessaires pour maintenir la santé fonctionnelle des poumons en développement et adultes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ^,12,13,14. Les cellules pulmonaires utilisent des voies spécifiques, permettant l’absorption efficace des rétinoïdes circulants dérivés de l’alimentation à partir du sang sous forme de rétinol (ROH)15,16,17,18,19, suivie d’une conversion intracellulaire par étapes du ROH en l’espèce de rétinoïde transcriptionnellement active, l’acide tout-trans-rétinoïque (ATRA)²⁰. La signalisation médiée par l’ATRA (ou médiée par les rétinoïdes) est obtenue par l’interaction de l’ATRA avec ses trois récepteurs hormonaux nucléaires apparentés distincts, les récepteurs de l’acide rétinoïque (RARα, RARβ et RARγ^21,22), et est cruciale pour la régulation de l’alvéolarisation pulmonaire 23,24,25,26,27,28,29, la production de tensioactifs ^30,31,32,33,34,35, angiogenèse³⁶, perméabilité ³⁷ et immunité 38,39,40. Il est important de noter que des cellules pulmonaires spécifiques, en particulier les fibroblastes pulmonaires, peuvent accumuler des rétinoïdes sous forme d’esters de rétinyle (RE), qui peuvent être stockés ou mobilisés sous forme de ROH pour être transférés aux cellules voisines si nécessaire¹.

La complexité du métabolisme et de la signalisation des rétinoïdes, ainsi que la complexité cellulaire du poumon, rendent difficiles les études visant à explorer le métabolisme des rétinoïdes dans le poumon in vivo . Nous avons décrit un protocole simple et robuste pour isoler les cellules contenant des rétinoïdes (Figure 1) à partir de populations de cellules pulmonaires très hétérogènes en utilisant l’autofluorescence spécifique des rétinoïdes (l’émission à 455 nm lors de l’excitation à 350 nm) et en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Le protocole ne nécessite pas de marquage cellulaire supplémentaire, sauf pour la coloration de viabilité si le but de l’étude est d’isoler et de caractériser des cellules pulmonaires vivantes primaires en fonction de leur capacité à stocker des rétinoïdes. Cela réduit considérablement le temps de préparation pour le tri des cellules, élimine le besoin de coloration supplémentaire et permet d’isoler des rendements élevés de cellules primaires viables. Cependant, si le but de l’étude est d’isoler et de caractériser des populations spécifiques de cellules pulmonaires (fibroblastes, cellules endothéliales, épithéliales ou immunitaires), un tri cellulaire supplémentaire peut être effectué après avoir marqué les cellules contenant des rétinoïdes triées avec des anticorps spécifiques aux cellules.

L’autofluorescence rétinoïde a été utilisée dans des études publiées pour établir l’identité des cellules contenant des rétinoïdes et/ou pour quantifier l’abondance de ces cellules dans le foie 41,42,43,44, le pancréas ^45,46, les reins^41,47 et les poumons⁴¹. De plus, plusieurs groupes de recherche ont rapporté l’utilisation de la fluorescence rétinoïde pour isoler par FACS et étudier les cellules primaires contenant des rétinoïdes dans des tissus vivants, y compris le foie 44,48,49,50,51,52,53 et le poumon 1. Dans le protocole actuel, nous montrons comment des populations cellulaires spécifiques peuvent être marquées in vivo avant d’isoler des cellules contenant des rétinoïdes à l’aide de tdTomato (protéine fluorescente rouge). Les caractéristiques spectrales de tdTomato (l’émission à 581 nm lors de l’excitation à 554 nm⁵⁴) et la luminosité n’interfèrent pas avec l’autofluorescence des rétinoïdes et, par conséquent, permettent d’obtenir facilement la spécificité cellulaire lors du tri. Compte tenu du rôle essentiel du métabolisme et de la signalisation des rétinoïdes non compromis dans le microenvironnement alvéolaire normal¹, la technique décrite d’isolement des cellules pulmonaires est un outil utile dans les études de modèles animaux de la santé et des maladies pulmonaires pour mieux comprendre les aspects cellulaires du métabolisme des rétinoïdes dans les poumons et les communications cellulaires à médiation lipidique in vivo.

Toutes les procédures et expériences décrites sur des souris ont été réalisées avec l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Rutgers (IACUC ID : PROTO202200111) selon les critères décrits dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire préparé par l’Académie nationale des sciences⁵⁵.

1. Considérations et préparations de l’expérience

1. Élevage et manipulations animales
   REMARQUE : Des souris mâles et femelles âgées de trois mois (10 à 12 semaines) peuvent être utilisées dans les études. Des souris déficientes en lécithine :rétinol acyltransférase (souris déficientes en Lrat, souris Lrat^{-/- 56}) sur un fond génétique C57BL/6J et des compagnons de portée du même âge (souris de type sauvage, Lrat^+/+) ont été utilisés dans les expériences décrites. Des souris exprimant le gène tdTomato dans des fibroblastes (souris F-tdT) ont été générées par le croisement de souris hébergeant une cassette rapporteure tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J, souche Jackson Lab #007914) avec des souris Col1a2-CreER (B6. Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, souche Jackson Lab #029567).
   1. Utiliser le modèle murin exprimant Cre, l’une des nombreuses options disponibles pour marquer la population cellulaire cible in vivo.
      REMARQUE : En fonction du choix de la cellule cible, de l’expression de Cre, de l’efficacité de la recombinaison médiée par Cre et de la spécificité cellulaire, les chercheurs peuvent utiliser n’importe quel modèle de souris fiable exprimant Cre.
   2. Utilisez l’expression du transgène tdTomato (lors d’un traitement au tamoxifène comme décrit ci-dessous) pour marquer les fibroblastes Col1a2⁺ , suivie de leur isolement à partir de suspensions unicellulaires du poumon digéré comme décrit ci-dessous.
2. Recombinaison médiée par la création et activation du transgène in vivo
   1. Induire l’expression de Cre chez les souris F-tdT par injection intrapéritonéale (IP) de 2 mg de tamoxifène une fois toutes les 24 h pendant un total de 5 jours consécutifs.
   2. Désinfectez le site d’injection avec de l’éthanol à 70 % avant l’injection. Utilisez les souris pour des expériences 1 mois après l’injection finale de tamoxifène.
   3. Vérifiez l’efficacité de la recombinaison Cre avant les expériences de tri. Confirmer l’efficacité de la recombinaison Cre et de l’expression de tdTomato en isolant la population cellulaire cible de fibroblastes pulmonaires à partir de souris F-tdT traitées au tamoxifène à l’aide de billes magnétiques anti-Pdgfrα et d’un tri cellulaire activé magnétiquement (MACS).
3. Préparation de solutions, plastique et verrerie
   REMARQUE : Des techniques d’asepsie doivent être suivies pour les procédures décrites ci-dessous. Les procédures impliquant la préparation de la solution, la digestion des tissus et l’isolement cellulaire doivent être effectuées sous le capuchon laminaire. Les solutions doivent être stérilisées par filtration à l’aide d’un filtre de 0,2 μm ; Les outils chirurgicaux ainsi que le matériel de laboratoire doivent être stérilisés par autoclavage.
   1. Sous le capot laminaire, préparez la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), sans calcium ni magnésium (HBSS sans Ca²⁺/Mg²⁺, contenant 5,3 mM de KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 4,2 mM de NaHCO₃, 137,9 mM de NaCl, 0,3 mM de Na₂HPO₄, 5,6 mM de D-Glucose) pour la perfusion pulmonaire (5 mL par souris). Stérilisez la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm et remplissez la seringue avec la solution.
   2. Sous le capot laminaire, préparez la solution saline équilibrée de Hanks avec du calcium et du magnésium (HBSS avec Ca²⁺/Mg²⁺, contenant 1,3 mM de CaCl₂, 0,5 MgCl_2·6H₂O, 0,4 mM MgSO_4·7H₂O, 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 4,2 mM NaHCO₃, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na₂HPO₄, 5,6 mM D-Glucose), contenant 0,3 mg/mL de collagénase de type IV et 1 mg/mL de dispase pour la perfusion pulmonaire (10 mL par souris). Stérilisez la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm et remplissez la seringue avec la solution.
   3. Sous le capot laminaire, préparer le HBSS avec du Ca²⁺/Mg²⁺, contenant 0,3 mg/mL de collagénase de type IV, 1 mg/mL de dispase et 5 mg/mL de DNase I pour la digestion pulmonaire (10 mL par souris). Stérilisez la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm et remplissez la seringue avec la solution.
   4. Sous le capot laminaire, remplissez une boîte de culture cellulaire (35 mm 10 mm, une boîte par poumon prélevé chez une souris) avec 2 mL de HBSS stérile avec Ca²⁺/Mg²⁺. Placez le(s) plat(s) contenant du HBSS avec Ca²⁺/Mg²⁺ sur de la glace.

2. Perfusion pulmonaire, digestion et collecte de suspension unicellulaire

1. Anesthésier la souris en lui administrant un cocktail d’anesthésie contenant 10 mg/mL de kétamine et 2 mg/mL de xylazine à une dose de 0,01 mL/g de poids corporel par injection IP.
2. Assurez-vous que la souris est dans un état d’inconscience profonde en évaluant une réponse de pincement des orteils. Retirez les cheveux lâches et la saleté/débris visible du site chirurgical, coupez et essuyez le site chirurgical avec de l’alcool à 70 % pour la désinfection.
3. À l’aide d’outils chirurgicaux stériles, ouvrez les cavités abdominales et thoraciques. Coupez les côtes et le diaphragme pour exposer les poumons et le cœur.
   REMARQUE : Cela assurera une mort instantanée car la thoracotomie provoquera un arrêt de la respiration pendant que la souris est anesthésiée ; Si elle est correctement effectuée, cette partie de la procédure prendra jusqu’à 3 minutes entre le début de la procédure et la thoracotomie, suivie de la mort de l’animal.
4. Coupez la veine cave inférieure et appliquez un tampon absorbant pour absorber le sang libéré.
5. Perfuser les poumons in situ à travers le ventricule droit du cœur à l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille de 25 G X 1 po remplie de 5 mL de HBSS stérile sans Ca²⁺/Mg²⁺. Si la perfusion réussit, le tissu pulmonaire deviendra blanc.
6. Perfuser les poumons in situ à l’aide d’une seringue de 10 mL munie d’une aiguille de 25 g x 1 po remplie de 10 mL de HBSS stérile contenant du Ca²⁺/Mg²⁺, contenant de la collagénase de type IV (0,3 mg/mL) et de la dispase (1 mg/mL).
7. Retirer les poumons et les transférer dans une boîte de culture cellulaire (35 mm X 10 mm) avec 2 mL de HBSS stérile avec Ca²⁺/Mg²⁺.
8. Sous le capuchon laminaire, rincez les poumons et coupez-les en petits morceaux à l’aide d’une lame chirurgicale stérile (#20, s’adapte à la poignée #4). Transvasez le poumon haché dans un tube de 15 mL en ajoutant les premiers 5 mL de HBSS avec du Ca²⁺/Mg²⁺ contenant 0,3 mg/mL de collagénase de type IV, 1 mg/mL de dispase et 5 mg/mL de DNase I dans le tissu haché et en le transférant à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Prélever et transférer les résidus de tissus hachés restants en lavant la boîte de culture cellulaire avec les 5 mL restants de HBSS avec du Ca²⁺/Mg²⁺ contenant 0,3 mg/mL de collagénase de type IV, 1 mg/mL de dispase et 5 mg/mL de DNase I.
9. Incuber le tissu pulmonaire haché dans HBSS avec du Ca²⁺/Mg²⁺ contenant 0,3 mg/mL de collagénase de type IV, 1 mg/mL de dispase et 5 mg/mL de DNase I sur un agitateur rotatif maintenu à 37 °C pendant 45 min. À chacun des trois intervalles de 15 minutes, sous le capuchon laminaire, passez 10 fois le tissu haché dans une pipette sérologique de 10 mL pour mieux dissocier les cellules.
10. Passer la suspension cellulaire résultante à travers une passoire de 100 μm pour recueillir les cellules individuelles dans un tube de 50 mL contenant 20 mL de solution d’imagerie froide de cellules vivantes (solution saline physiologique contenant 20 mM d’HEPES, pH 7,4) contenant moins de 5 % de sérum fœtal bovin (FBS). Recueillir les cellules par centrifugation à 500 g pendant 10 min à 4 °C.
11. Aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges et laissez le tube pendant 5 min à température ambiante (RT) pour éliminer les érythrocytes. Ajouter 20 mL de solution froide d’imagerie de cellules vivantes contenant moins de 5 % de FBS. Recueillir les cellules par centrifugation à 500 g pendant 10 min à 4 °C.
12. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 20 mL de solution froide d’imagerie de cellules vivantes contenant moins de 5 % de FBS. Passer la suspension cellulaire résultante dans une crépine de 40 μm pour recueillir les cellules individuelles dans un tube de 50 mL contenant 20 mL de solution d’imagerie froide de cellules vivantes contenant moins de 5 % de FBS. Recueillir les cellules par centrifugation à 500 g pendant 10 min à 4 °C.
13. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de solution froide d’imagerie de cellules vivantes contenant moins de 5 % de FBS. Comptez les cellules et ajustez la concentration cellulaire à ~5-10 x 10⁶ cellules/ml.

3. Isolement de cellules pulmonaires contenant des rétinoïdes à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

1. Prenez une aliquote de suspension cellulaire et mettez-la de côté pour l’utiliser comme contrôle de porte non coloré. Ajouter le colorant de viabilité SYTOX Green à la suspension cellulaire restante (dilution 1:1000, concentration finale 30 nM).
2. Faites passer les suspensions cellulaires à travers le filtre fixé au tube collecteur en polystyrène de 5 mL (12 x 75 mm).
3. Procéder à l’isolement des cellules FACS en triant les cellules vivantes contenant des rétinoïdes en fonction de leur émission à 455 nm. Effectuez une discrimination séquentielle singulet à l’aide d’un tracé de diffusion vers l’avant (hauteur de diffusion vers l’avant/FSC-H par rapport aire de diffusion vers l’avant/FSC-A). Exclure les cellules mortes par les caractéristiques de diffusion (diffusion latérale) et la coloration avec SYTOX Green.
4. Détection, tri et collecte des cellules uniques, vivantes, contenant des rétinoïdes en utilisant l’émission à 455 nm lors de l’excitation à 350 nm.
   REMARQUE : En utilisant la procédure décrite, environ 5,10⁵ cellules pulmonaires contenant des rétinoïdes peuvent être prélevées dans un poumon de souris.
5. Effectuer l’analyse des données FACS à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux.

Isolement de cellules contenant des rétinoïdes pulmonaires
Des poumons de souris (de souris Lrat^+/+ et Lrat^-/-) ont été digérés par voie enzymatique, et des suspensions unicellulaires ont été préparées et soumises au FACS selon la procédure décrite ci-dessus. Le tri des cellules et l’acquisition des données ont été effectués sur un système de tri de cellules Cytek Au...

La capacité de détection de la vitamine A dans les tissus humains et animaux et sa visualisation histologique à l’aide de la microscopie fluorescente ont été signalées pour la première fois dès les années 1940^59,60. Le phénomène d’autofluorescence rétinoïde a ensuite été appliqué avec succès à des études visant à localiser des concentrations élevées de vitamine A dans les tissus in vitro

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce travail a été financé par une subvention des National Institutes of Health/National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (à I.S.), une bourse de développement de carrière (à I.S) du Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease financée par les National Institutes of Health/National Institute of Environmental Health Sciences (NIH/NIEHS) P30 ES005022, et des fonds de démarrage de Rutgers, de l’Université d’État du New Jersey (à I.S.). Les auteurs tiennent à remercier le personnel de la ressource partagée de surveillance immunitaire et de cytométrie en flux du Rutgers Cancer Institute (soutenue, en partie, par le financement du NCI-CCSG P30CA072770-5920) pour leurs contributions aux travaux présentés dans ce manuscrit.