Aislamiento de células que contienen retinoides pulmonares mediante clasificación celular

El protocolo que se describe a continuación es una forma sencilla y eficaz de aislar células que contienen retinoides de poblaciones de células pulmonares muy heterogéneas mediante el uso de la autofluorescencia de retinoides específicos y el empleo de la clasificación de células activadas por fluorescentes.

Los retinoides (vitamina A y sus metabolitos) son un componente lipídico esencial del microambiente alveolar, y se requiere un metabolismo de retinoides específico del tipo celular para mantener la salud funcional de los pulmones en desarrollo y adultos. Las células pulmonares utilizan vías específicas, lo que permite la absorción eficiente de los retinoides circulantes de la sangre como retinol (ROH), seguido de la conversión escalonada intracelular de ROH en la especie de retinoide transcripcionalmente activa, ácido trans-retinoico (ATRA). La señalización mediada por ATRA (o mediada por retinoides) es crucial para regular la alveolarización pulmonar, la producción de surfactante, la angiogénesis, la permeabilidad y la inmunidad. Es importante destacar que las células pulmonares específicas, incluidos los fibroblastos, pueden acumular retinoides en forma de ésteres de retinilo (RE), que pueden almacenarse o movilizarse aún más como ROH para transferirlos a las células vecinas cuando sea necesario. Las células que contienen retinoides pulmonares pueden aislarse y recogerse de la suspensión unicelular de los pulmones digeridos mediante el uso de la autofluorescencia de retinoides (la emisión a 455 nm tras la excitación a 350 nm) y mediante el empleo de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). El marcaje in vivo adicional específico de células pulmonares con proteína fluorescente roja permite aislar y recolectar poblaciones específicas de células pulmonares que contienen retinoides. Las células recolectadas se pueden analizar o cultivar directamente para realizar análisis posteriores de la morfología celular, la expresión génica y la capacidad de respuesta a las manipulaciones farmacológicas. Esta técnica de aislamiento y aplicación es importante para los estudios de modelos animales de salud pulmonar y lesión pulmonar para obtener una comprensión más profunda de los aspectos celulares del metabolismo de los retinoides en los pulmones y las comunicaciones celulares mediadas por lípidos.

Los retinoides (vitamina A y sus metabolitos) son un componente lipídico esencial del microambiente alveolar, y el metabolismo y la señalización de los retinoides específicos del tipo celular son necesarios para mantener la salud funcional del pulmón en desarrollo y adulto 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ^,12,13,14. Las células pulmonares utilizan vías específicas, lo que permite la absorción eficiente de los retinoides circulantes derivados de la dieta de la sangre como retinol (ROH)15,16,17,18,19, seguido de la conversión escalonada intracelular de ROH en la especie de retinoide transcripcionalmente activa, ácido trans-retinoico (ATRA)²⁰. La señalización mediada por ATRA (o mediada por retinoides) se logra a través de la interacción de ATRA con sus tres receptores de hormonas nucleares afines distintos, los receptores de ácido retinoico (RARα, RARβ y RARγ^21,22), y es crucial para regular la alveolarización pulmonar 23,24,25,26,27,28,29, producción de surfactante^30,31,32,33,34,35, angiogénesis³⁶, permeabilidad³⁷ e inmunidad 38,39,40. Es importante destacar que las células pulmonares específicas, especialmente los fibroblastos pulmonares, pueden acumular retinoides en forma de ésteres de retinilo (RE), que pueden almacenarse o movilizarse posteriormente como ROH para transferirlos a las células vecinas cuando sea necesario¹.

La complejidad del metabolismo y la señalización de los retinoides, así como la complejidad celular del pulmón, hacen que los estudios destinados a explorar el metabolismo de los retinoides en el pulmón in vivo sean un desafío. Hemos esbozado un protocolo simple y robusto para aislar células que contienen retinoides (Figura 1) de poblaciones de células pulmonares altamente heterogéneas mediante el uso de la autofluorescencia retinoide específica (la emisión a 455 nm tras la excitación a 350 nm) y mediante el empleo de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). El protocolo no requiere marcaje celular adicional, excepto para la tinción de viabilidad si el objetivo del estudio es aislar y caracterizar células pulmonares vivas primarias en función de su capacidad para almacenar retinoides. Esto reduce significativamente el tiempo de preparación para la clasificación de células, elimina la necesidad de tinción adicional y permite aislar altos rendimientos de células primarias viables. Sin embargo, si el objetivo del estudio es aislar y caracterizar poblaciones específicas de células pulmonares (fibroblastos, células endoteliales, epiteliales o inmunitarias), se puede realizar una clasificación celular adicional después de etiquetar las células clasificadas que contienen retinoides con anticuerpos específicos de la célula.

La autofluorescencia de retinoides se ha utilizado en estudios publicados para establecer las identidades de las células que contienen retinoides y/o para cuantificar la abundancia de estas células en el hígado 41,42,43,44, el páncreas^45,46, los riñones^41,47 y el pulmón⁴¹. Además, varios grupos de investigación informaron sobre el uso de la fluorescencia de retinoides para aislar por FACS y estudiar células primarias que contienen retinoides de tejidos vivos, incluyendo el hígado 44,48,49,50,51,52,53 y el pulmón 1. En el protocolo actual, mostramos cómo se pueden etiquetar poblaciones celulares específicas in vivo antes de aislar células que contienen retinoides utilizando tdTomato (proteína fluorescente roja). Las características espectrales de tdTomato (la emisión a 581 nm tras la excitación a 554 nm⁵⁴) y el brillo no interfieren con la autofluorescencia de los retinoides y, por lo tanto, hacen que sea conveniente lograr la especificidad celular durante la clasificación. Dado el papel crítico del metabolismo de los retinoides no comprometidos y la señalización dentro del microambiente alveolar normal¹, la técnica descrita de aislamiento de células pulmonares es una herramienta útil en los estudios de modelos animales de salud y enfermedad pulmonar para obtener una comprensión más profunda de los aspectos celulares del metabolismo de los retinoides en los pulmones y las comunicaciones celulares mediadas por lípidos in vivo.

Todos los procedimientos y experimentos descritos con ratones se llevaron a cabo con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Rutgers (IACUC ID: PROTO202200111) de acuerdo con los criterios descritos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio elaborada por la Academia Nacional de Ciencias⁵⁵.

1. Consideraciones y preparativos para el experimento

1. Ganadería y manipulaciones
   NOTA: En los estudios se pueden utilizar ratones machos y hembras de tres meses de edad (10-12 semanas de edad). En los experimentos descritos se utilizaron ratones deficientes en lecitina:retinol aciltransferasa (Lrat-deficientes, Lrat^-/- ratones⁵⁶) con un fondo genético C57BL/6J y compañeros de camada de la misma edad (ratones de tipo salvaje, Lrat^+/+). Los ratones que expresan el gen tdTomato en fibroblastos (ratones F-tdT) se generaron cruzando ratones que albergaban un casete reportero tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J, Jackson Lab cepa #007914) con ratones Col1a2-CreER (B6. Cg-Tg (Col1a2-Cre / ERT, -ALPP) 7Cpd / 2J, cepa de Jackson Lab # 029567).
   1. Emplee el modelo de ratón que expresa Cre, una de las muchas opciones disponibles para etiquetar la población de células objetivo in vivo.
      NOTA: Dependiendo de la elección de la célula objetivo, la expresión de Cre, la eficiencia de la recombinación mediada por Cre y la especificidad de la célula, los investigadores pueden utilizar cualquier modelo de ratón fiable que exprese Cre.
   2. Utilice la expresión del transgén tdTomato (tras el tratamiento con tamoxifeno como se describe a continuación) para marcar los fibroblastos Col1a2⁺ , seguido de su aislamiento a partir de suspensiones unicelulares del pulmón digerido como se describe a continuación.
2. Recombinación mediada por Cre y activación de transgenes in vivo
   1. Inducir la expresión de Cre en ratones F-tdT mediante la inyección intraperitoneal (IP) de 2 mg de tamoxifeno una vez cada 24 h durante un total de 5 días consecutivos.
   2. Desinfecte el lugar de la inyección con etanol al 70% antes de la inyección. Utilice los ratones para experimentos 1 mes después de la última inyección de tamoxifeno.
   3. Comprobar la eficacia de la recombinación de Cre antes de los experimentos de clasificación. Confirmar la recombinación efectiva de Cre y la expresión de tdTomato aislando la población celular diana de fibroblastos pulmonares de los ratones F-tdT tratados con tamoxifeno utilizando perlas magnéticas anti-Pdgfrα y clasificación de células activadas magnéticamente (MACS).
3. Preparación de soluciones, plástico y cristalería
   NOTA: Se deben seguir técnicas asépticas para los procedimientos que se describen a continuación. Los procedimientos que involucran preparaciones de solución, digestión de tejidos y aislamiento celular deben realizarse bajo la cubierta laminar. Las soluciones deben esterilizarse por filtración con un filtro de 0,2 μm; Las herramientas quirúrgicas, así como el material de laboratorio, deben esterilizarse en autoclave.
   1. Bajo el capó laminar, prepare la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), libre de calcio y magnesio (HBSS sin Ca²⁺/Mg²⁺, que contiene 5,3 mM de KCl, 0,4 mM de KH₂PO₄, 4,2 mM de NaHCO₃, 137,9 mM de NaCl, 0,3 mM de Na₂HPO₄, 5,6 mM de D-glucosa) para la perfusión pulmonar (5 mL por ratón). Esterilice la solución con un filtro de 0,2 μm y llene la jeringa con la solución.
   2. Bajo la cubierta laminar, prepare la solución salina equilibrada de Hanks con calcio y magnesio (HBSS con Ca²⁺/Mg²⁺, que contiene 1,3 mM CaCl₂, 0,5 MgCl_2·6H₂O, 0,4 mM MgSO_4·7H₂O, 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 4,2 mM NaHCO₃, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na₂HPO₄, 5,6 mM D-Glucosa), que contiene 0,3 mg/mL de colagenasa tipo IV y 1 mg/mL de dispasa para la perfusión pulmonar (10 mL por ratón). Esterilice la solución con un filtro de 0,2 μm y llene la jeringa con la solución.
   3. Bajo la cubierta laminar, prepare HBSS con Ca²⁺/Mg²⁺, que contenga 0,3 mg/ml de colagenasa tipo IV, 1 mg/ml de dispasa y 5 mg/ml de DNasa I para la digestión pulmonar (10 ml por ratón). Esterilice la solución con un filtro de 0,2 μm y llene la jeringa con la solución.
   4. Bajo la cubierta laminar, llene una placa de cultivo celular (35 mm 10 mm, una placa por pulmón recolectado de un ratón) con 2 mL de HBSS estéril con Ca²⁺/Mg²⁺. Coloque los platos que contienen HBSS con Ca²⁺/Mg²⁺ en hielo.

2. Perfusión pulmonar, digestión y recolección de suspensión unicelular

1. Anestesiar al ratón administrando un cóctel de anestesia que contenga 10 mg/mL de ketamina y 2 mg/mL de xilacina a una dosis de 0,01 mL/g de peso corporal mediante inyección IP.
2. Asegúrese de que el ratón esté en un estado profundo de inconsciencia evaluando la respuesta de pellizco del dedo del pie. Retire el cabello suelto y la suciedad/residuos visibles del sitio quirúrgico, corte y limpie el sitio quirúrgico con alcohol al 70% para la desinfección.
3. Con el uso de herramientas quirúrgicas estériles, abra las cavidades abdominal y torácica. Corta las costillas y el diafragma para exponer los pulmones y el corazón.
   NOTA: Esto asegurará una muerte instantánea ya que la toracotomía provocará un cese de la respiración mientras el ratón está anestesiado; Si se realiza correctamente, esta parte del procedimiento tomará hasta 3 minutos desde el inicio del procedimiento hasta la toracotomía, seguida de la muerte del animal.
4. Corta la vena cava inferior y aplica una almohadilla absorbente para absorber la sangre liberada.
5. Perfundir los pulmones in situ a través del ventrículo derecho del corazón usando una jeringa de 10 mL con una aguja de 25 G X 1" llena con 5 mL de HBSS estéril sin Ca²⁺/Mg²⁺. Si la perfusión es exitosa, el tejido pulmonar se volverá blanco.
6. Perfundir los pulmones in situ utilizando una jeringa de 10 mL con una aguja de 25 G X 1" llena de 10 mL de HBSS estéril con Ca²⁺/Mg²⁺, que contiene colagenasa tipo IV (0,3 mg/mL) y dispasa (1 mg/mL).
7. Extraer los pulmones y transferirlos a una placa de cultivo celular (35 mm X 10 mm) con 2 mL de HBSS estéril con Ca²⁺/Mg²⁺.
8. Debajo de la capucha laminar, enjuague los pulmones y píquelos en pedazos pequeños con una cuchilla quirúrgica estéril (# 20, se adapta al mango # 4). Transfiera el pulmón picado a un tubo de 15 mL agregando los primeros 5 mL de HBSS con Ca²⁺/Mg²⁺ que contenga 0,3 mg/mL de colagenasa tipo IV, 1 mg/mL de dispasa y 5 mg/mL de DNasa I al tejido picado y transfiriéndolo usando una pipeta serológica de 10 mL. Recoja y transfiera los residuos restantes de tejido picado lavando la placa de cultivo celular con los 5 mL restantes de HBSS con Ca²⁺/Mg²⁺ que contiene 0,3 mg/mL de colagenasa tipo IV, 1 mg/mL de dispasa y 5 mg/mL de DNasa I.
9. Incubar el tejido pulmonar picado en HBSS con Ca²⁺/Mg²⁺ que contiene 0,3 mg/mL de colagenasa tipo IV, 1 mg/mL de dispasa y 5 mg/mL de DNasa I en un agitador giratorio mantenido a 37 °C durante 45 min. En cada uno de los tres intervalos de 15 minutos, bajo la cubierta laminar, se pasa el tejido picado 10 veces a través de una pipeta serológica de 10 mL para disociar mejor las células.
10. Pase la suspensión celular resultante a través de un colador de 100 μm para recolectar células individuales en un tubo de 50 mL que contiene 20 mL de solución de imágenes de células vivas frías (solución salina fisiológica que contiene 20 mM de HEPES, pH 7.4) que contiene menos del 5% de suero fetal bovino (FBS). Recoja las células por centrifugación a 500 g durante 10 min a 4 °C.
11. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 mL de tampón de lisado de glóbulos rojos y dejar el tubo durante 5 min a temperatura ambiente (RT) para eliminar los eritrocitos. Agregue 20 ml de solución fría para imágenes de células vivas que contenga menos del 5% de FBS. Recoja las células por centrifugación a 500 g durante 10 min a 4 °C.
12. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en 20 ml de solución de imágenes de células vivas frías que contenga menos del 5% de FBS. Pase la suspensión celular resultante a través de un filtro de 40 μm para recolectar células individuales en un tubo de 50 mL que contiene 20 mL de solución de imágenes de células vivas frías que contiene menos del 5% de FBS. Recoja las células por centrifugación a 500 g durante 10 min a 4 °C.
13. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en 10 ml de solución fría para imágenes de células vivas que contenga menos del 5% de FBS. Cuente las células y ajuste la concentración de células a ~5-10 x 10⁶ células/mL.

3. Aislamiento de células pulmonares que contienen retinoides mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)

1. Tome una alícuota de suspensión de celdas y déjela a un lado para usarla como un control de compuerta sin manchas. Añadir el colorante de viabilidad SYTOX Green a la suspensión celular restante (dilución 1:1000, concentración final 30 nM).
2. Pase las suspensiones celulares a través del filtro conectado al tubo colector de poliestireno de 5 mL (12 x 75 mm).
3. Proceda con el aislamiento de células FACS clasificando las células vivas que contienen retinoides individuales en función de su emisión a 455 nm. Realice la discriminación secuencial de singletes utilizando un gráfico para la dispersión directa (altura de dispersión directa/FSC-H frente a área de dispersión directa/FSC-A). Excluya las células muertas por características de dispersión (dispersión lateral) y tinción con SYTOX Green.
4. Detecte, clasifique y recoja células individuales, vivas y que contengan retinoides, utilizando la emisión a 455 nm tras la excitación a 350 nm.
   NOTA: Utilizando el procedimiento descrito, se pueden recolectar alrededor de 5'10^{5 células} pulmonares que contienen retinoides de un pulmón de ratón.
5. Realice análisis de datos FACS utilizando software de citometría de flujo.

Aislamiento de células pulmonares que contienen retinoides pulmonares
Los pulmones de ratón (de Lrat^+/+ y Lrat^-/-) se digierieron enzimáticamente, y las suspensiones unicelulares se prepararon y sometieron a FACS de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. La clasificación celular y la adquisición de datos se realizaron en un sistema clasificador de células Cytek Auro...

La capacidad de detección de vitamina A en tejidos humanos y animales y su visualización histológica mediante microscopía fluorescente se informó por primera vez en la década de 1940 ^59,60. El fenómeno de la autofluorescencia de los retinoides se aplicó con éxito a los estudios destinados a localizar altas concentraciones de vitamina A en los tejidos in vitro⁶¹ y a caracterizar la morfog?...

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue financiado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (a I.S.), un premio de desarrollo profesional (a I.S.) del Centro de Exposiciones y Enfermedades Ambientales de Rutgers financiado por los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental (NIH/NIEHS) P30 ES005022, y fondos de puesta en marcha de Rutgers, la Universidad Estatal de Nueva Jersey (a I.S.). Los autores desean agradecer al personal del Recurso Compartido de Monitoreo Inmunitario y Citometría de Flujo del Instituto Oncológico de Rutgers (financiado, en parte, con fondos del NCI-CCSG P30CA072770-5920) por sus contribuciones al trabajo presentado en este manuscrito.