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Method Article
Este artigo descreve o processo de preparação, configuração e imagem de tendões usando microscopia multifotônica. Além disso, abrange a aplicação de SHG para analisar o alinhamento das fibrilas de colágeno e a criação de uma representação 3D dos tendões. Esta metodologia se mostra altamente valiosa na caracterização das células tendíneas e sua ECM durante a lesão e o desenvolvimento.
A microscopia de dois fótons surgiu como uma ferramenta potente para avaliar células de tecidos profundos e caracterizar o alinhamento da matriz extracelular (MEC) em vários sistemas biológicos. Essa técnica depende de interações não lineares luz-matéria para detectar dois sinais distintos: o sinal de difusão gerado pelo segundo harmônico (SHG), que facilita a visualização das fibras de colágeno e sua orientação, e o sinal de excitação do infravermelho próximo para imagens de autofluorescência excitada ultravioleta.
A imagem SHG mostra-se especialmente eficaz na visualização de fibras de colágeno devido à estrutura cristalina não centrossimétrica do colágeno fibrilar I. Dado que os tendões são tecidos ricos em matriz com um número limitado de células, seu alto teor de colágeno os torna candidatos ideais para análise usando microscopia de dois fótons. Consequentemente, a microscopia de dois fótons oferece um meio valioso para analisar e caracterizar anormalidades do colágeno nos tendões. Sua aplicação se estende ao estudo do desenvolvimento, lesões, cicatrização e envelhecimento do tendão, permitindo a caracterização abrangente das células tendíneas e suas interações com a ECM sob várias condições usando ferramentas de microscopia de dois fótons. Este protocolo descreve o uso da microscopia de dois fótons na biologia tendínea e apresenta uma metodologia adaptada para obter imagens e caracterização eficazes das células tendíneas durante o desenvolvimento e após a lesão. O método permite a utilização de cortes microscópicos finos para criar uma imagem abrangente da ECM dentro dos tendões e das células que interagem com essa matriz. Mais notavelmente, o artigo mostra uma técnica para gerar imagens 3D usando microscopia de dois fótons em modelos animais.
Para funcionar adequadamente e transmitir força do músculo para o osso1, os tendões dependem das ligações intermoleculares e intramoleculares entre as fibras de colágeno. A intrincada automontagem, reticulação e alinhamento das fibras colágenas resultam no estabelecimento de uma matriz altamente organizada que contribui para a resistência biomecânica e flexibilidade do tecido tendíneo 2,3,4. Embora outras proteínas da MEC também contribuam para a estabilidade da rede fibrilar nos tendões5, a massa seca do tendão é de aproximadamente 86% de colágeno6, sendo que o colágeno I representa 96% do conteúdo total de colágeno 7,8. Em última análise, isso torna a estrutura do colágeno uma saída chave da saúde e função normais do tendão.
Algumas modalidades de imagem clínica usadas para tendões são ressonância magnética e/ou ultrassom. Embora a tecnologia de ultrassom forneça imagens da estrutura fascicular do tendão e revele parte da estrutura fibrilar do tecido9, a resolução não é ideal para quantificação. A ressonância magnética tem melhor resolução espacial do que a imagem de ultrassom, mas ainda é limitada. No entanto, esses métodos também são limitados em sua profundidade potencial de imagem através de um tecido. Em uma escala mais micrométrica, a dispersão de luz de pequena e grande angular e a microscopia confocal podem ser usadas para avaliar a estrutura das fibrilas de colágeno e quaisquer anormalidades potenciais.
Em contraste, a microscopia de geração de segundo harmônico (SHG) difere de outros métodos de imagem, pois pode capturar a camada externa das fibrilas de colágeno. As fibrilas de colágeno I nos tendões são organizadas de forma paralela uniaxial através da MEC do tendão e são de natureza não centrossimétrica 4,10. Essas propriedades podem ser aproveitadas para imagens usando um microscópio multifotônico, que pode produzir imagens nítidas que são até 2-3 vezes mais profundas do que a imagem confocal11. Isso também nos permite gerar seções ópticas de melhor qualidade do tendão. Quando a luz é projetada na amostra de interesse, um sinal SHG é produzido e essa dispersão de luz pode ser capturada. Nos tendões, isso produz uma imagem da estrutura e alinhamento do colágeno, permitindo-nos avaliar possíveis consequências morfológicas e patológicas de tendinopatias, lesões, etc.
Como o colágeno compõe a maior parte da massa seca do tendão e contribui para a função do tendão 6,12, a ruptura da estrutura do colágeno pode afetar as propriedades biomecânicas dos tendões. Assim, analisar sua estrutura pode nos ajudar a entender melhor o impacto e a gravidade das lesões, além de criar uma métrica para a eficácia da cicatrização. Este artigo revisa um método que usa microscopia multifotônica e SHG para analisar como o desenvolvimento e as lesões afetam a estrutura e o alinhamento das fibrilas de colágeno I e para gerar imagens 3D da MEC do tendão em modelos animais. Portanto, nosso método para obter imagens de tendões pode ajudar os pesquisadores a caracterizar as células tendíneas e a ECM durante o desenvolvimento ou após a lesão.
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (Protocolo #2013N0000062) e as diretrizes da AAALAC no Massachusetts General Hospital. BHLHE40 camundongos fêmeas nocaute nulo ou heterozigotos em um fundo Scx-GFP, com idade de 30 dias, foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação e fixação de tecidos
2. Dissecção do tendão e preparação do tecido para a imagiologia
3. Imagem com um microscópio multifotônico
Este protocolo é útil para caracterizar as células tendíneas e sua matriz extracelular (MEC) após a lesão, durante o desenvolvimento ou em uma condição mutante. Com dissecção cuidadosa e preparação da amostra, vídeos z-stack podem ser gerados através do tecido em uma orientação sagital (Vídeo 1 e Vídeo 2). Usando o ImageJ/FIJI para processar e refatiar as imagens, uma visão transversal do tendão de Aquiles é criada (Vídeos 3...
Este artigo apresenta um método para preparar, dissecar e obter imagens do tendão de Aquiles de camundongo, utilizando as propriedades cristalinas não centrossimétricas da ECM do tendão. As principais etapas na preparação do tecido envolvem permeabilização para contracolorações e garantia da colocação adequada do tecido em uma placa de Petri durante a imagem. Em vez de Draq5, Hoechst 33258 pode ser usado em uma diluição de 1:100.00013, mas Draq5 é ...
Os autores não têm nada a divulgar.
Os autores agradecem a Jenna Galloway e aos membros do Galloway Lab por seu apoio e incentivo no desenvolvimento e solução de problemas desses protocolos.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9262 | |
2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | |
20 mL scintillation vial | Sigma-Aldrich | Z190527-1PAK | |
4% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Use PFA ampuole to create 4% PFA solution |
6 mm Biopsy Punch Tool | Ted Pella Inc. | 15111-60 | |
60 x 15 mm petri dish | |||
BHLHE40 null knockout or heterozygous mice in a Scx-GFP background | The Jackson Laboratory | JAX ID #029732 | MGI ID #3717419 |
Coverslips | Fisher | 12-544-F | Can use any coverslip that spans the area of the M20 washer |
dPBS | Gibco | 14190144 | |
Draq5 | ABCAM | ab108410 | |
Fine scissors 21 mm cutting edge | Fine Science Tools | 14060-10 | |
FVMPE-RS multiphoton laser scanning microscope | Olympus | ||
Gelfoam Sterile Sponge Size 50 | Pfizer | 00009-0323-01 | |
INSIGHT X3-OL IR pulsed laser | Olympus | ||
MaiTai HPDS-O IR pulsed laser | Olympus | ||
Phosphate-Buffered Saline (1x) | Invitrogen | AM9625 | Dilute 10x PBS in milli-Q water to get 1x solution |
Stainless steel M20 flat washer | McMaster-Carr | ||
Triton X-100 | MP Biomedicals | 807426 | Dilute Triton X-100 in dPBS to get 1% solution |
Vannas spring scissors 4 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15018-10 | |
XLPlan N 25X WMP Lens |
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