힘줄 연구를 위한 이광자 현미경 검사

이 기사에서는 다광자 현미경을 사용하여 힘줄을 준비, 설정 및 이미징하는 과정을 간략하게 설명합니다. 또한 콜라겐 원섬유 정렬을 분석하고 힘줄의 3D 표현을 생성하기 위한 SHG의 적용을 다룹니다. 이 방법론은 손상 및 발달 중에 힘줄 세포와 ECM을 특성화하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다.

이광자 현미경 검사는 심부 조직 세포를 평가하고 다양한 생물학적 시스템에서 세포외 기질(ECM)의 정렬을 특성화하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다. 이 기술은 비선형 광-물질 상호 작용에 의존하여 두 가지 별개의 신호, 즉 콜라겐 섬유와 그 방향의 시각화를 용이하게 하는 SHG(Second Harmonic Generated) 확산 신호와 자외선 여기 자가형광 이미징을 위한 근적외선 여기 신호입니다.

SHG 이미징은 섬유소 콜라겐 I의 비중심대칭 결정 구조로 인해 콜라겐 섬유를 시각화하는 데 특히 효과적인 것으로 입증되었습니다. 힘줄은 세포 수가 제한된 매트릭스가 풍부한 조직이라는 점을 감안할 때 콜라겐 함량이 높기 때문에 이광자 현미경을 사용한 분석에 이상적인 후보입니다. 결과적으로, 이광자 현미경 검사는 힘줄의 콜라겐 이상을 분석하고 특성화할 수 있는 유용한 수단을 제공합니다. 그 응용 분야는 힘줄 발달, 부상, 치유 및 노화 연구로 확장되어 이광자 현미경 도구를 사용하여 다양한 조건에서 힘줄 세포와 ECM과의 상호 작용을 포괄적으로 특성화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 힘줄 생물학에서 이광자 현미경의 사용을 간략하게 설명하고 발달 중 및 손상 후 힘줄 세포의 효과적인 이미징 및 특성화를 달성하기 위한 적응된 방법론을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 얇은 현미경 절편을 활용하여 힘줄 및 이 매트릭스와 상호 작용하는 세포 내의 ECM에 대한 포괄적인 이미지를 생성할 수 있습니다. 특히 이 기사는 동물 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 3D 이미지를 생성하는 기술을 보여줍니다.

근육에서 뼈로 힘을 전달하고 적절하게 기능하기 위해^힘줄은 1 콜라겐 섬유 사이의 분자간 및 분자 내 결합에 의존합니다. 콜라겐 섬유의 복잡한 자체 조립, 가교 결합 및 정렬은 힘줄 조직의 생체 역학적 강도와 유연성에 기여하는 고도로 조직화된 매트릭스의 형성을 초래합니다 ^2,3,4. 다른 ECM 단백질도 힘줄5의 섬유소 네트워크의 안정성에 기여^{하지만, 힘}줄 건조 덩어리는 약 86%가 콜라겐^6이며, 콜라겐 I은 총 콜라겐 함량 ^7,8의 최대 96%를 차지합니다. 이것은 궁극적으로 콜라겐 구조를 정상적인 힘줄 건강과 기능의 핵심 출력물로 만듭니다.

힘줄에 사용되는 일부 임상 영상 방식은 MRI 및/또는 초음파입니다. 초음파 기술은 힘줄의 근막 구조에 대한 이미지를 제공하고 조직

모든 동물 실험은 매사추세츠 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)(프로토콜 #2013N0000062) 및 AAALAC 지침에 따라 수행되었습니다. 본 연구에는 생후 30일의 Scx-GFP 배경에서 BHLHE40 null knockout 또는 이형접합 암컷 마우스가 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었습니다 ( 재료 표 참조).

1. 조직 준비 및 정착

1. 조직을 준비하기 위해 CO₂ 챔버에서 마우스를 안락사시킨 다음(기관에서 승인된 프로토콜에 따름) 자궁경부 탈구를 수행합니다.
2. 조직 샘플에 달라붙을 수 있는 털의 양을 줄이려면 털이 포화될 때까지 마우스에 70% EtOH를 뿌립니다. 뒷다리의 껍질을 벗긴 다음 가위를 사용하여 고관절을 잘라 두 개의 뒷다리를 제거합니다.
3. 두 개의 뒷다리를 20mL 섬광 바이알에 넣고 바이알이 채워지도록 4% PFA에 담급니다. 바이알을 4°C에서 밤새 저어줍니다.
4. 실온(RT)에서 10분 동안 교반하면서 1x PBS에 뒷다리를 씻고 총 3회 반복합니다. 뒷다리를 4°C에서 0.....

이 프로토콜은 손상 후, 발달 중 또는 돌연변이 상태에서 힘줄 세포와 그 세포외 기질(ECM)을 특성화하는 데 유용합니다. 샘플을 신중히 해부하고 준비하면 시상 방향으로 조직을 통해 z-stack 비디오를 생성할 수 있습니다(비디오 1 및 비디오 2). ImageJ/FIJI를 사용하여 이미지를 처리하고 다시 슬라이스하면 아킬레스건의 횡방향 보기가 생성됩니다(

이 기사에서는 힘줄 ECM의 비중심대칭 결정 특성을 활용하여 마우스 아킬레스건을 준비, 절제 및 이미지화하는 방법을 제시합니다. 조직 준비의 주요 단계에는 counterstain에 대한 투과화와 이미징 중 페트리 접시에 적절한 조직 배치를 확인하는 것이 포함됩니다. Draq5 대신 Hoechst 33258을 1:100,000 희석¹³으로 사용할 수 있지만 Draq5는 높은 투과성, 광안정성 및 .......

저자는 공개할 내용이 없습니다.

저자는 이러한 프로토콜의 개발 및 문제 해결에 대한 지원과 격려에 대해 Jenna Galloway와 Galloway Lab 구성원에게 감사드립니다.