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Method Article
In diesem Artikel wird der Prozess der Vorbereitung, Einrichtung und Bildgebung von Sehnen mithilfe der Multiphotonenmikroskopie beschrieben. Darüber hinaus wird die Anwendung von SHG zur Analyse der Kollagenfibrillenausrichtung und die Erstellung einer 3D-Darstellung von Sehnen behandelt. Diese Methodik erweist sich als sehr wertvoll für die Charakterisierung von Sehnenzellen und ihrer EZM während der Verletzung und Entwicklung.
Die Zwei-Photonen-Mikroskopie hat sich als leistungsfähiges Werkzeug für die Bewertung tiefer Gewebezellen und die Charakterisierung der Ausrichtung der extrazellulären Matrix (EZM) in verschiedenen biologischen Systemen erwiesen. Diese Technik stützt sich auf nichtlineare Licht-Materie-Wechselwirkungen, um zwei unterschiedliche Signale zu detektieren: das zweite harmonisch erzeugte (SHG) Diffusionssignal, das die Visualisierung von Kollagenfasern und ihrer Ausrichtung erleichtert, und das Nahinfrarot-Anregungssignal zur Abbildung der ultraviolett angeregten Autofluoreszenz.
Die SHG-Bildgebung erweist sich aufgrund der nicht-zentrosymmetrischen kristallinen Struktur von fibrillärem Kollagen I als besonders effektiv bei der Visualisierung von Kollagenfasern. Da es sich bei Sehnen um matrixreiches Gewebe mit einer begrenzten Anzahl von Zellen handelt, sind sie aufgrund ihres hohen Kollagengehalts ideale Kandidaten für die Analyse mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Daher bietet die Zwei-Photonen-Mikroskopie ein wertvolles Mittel, um Kollagenanomalien in Sehnen zu analysieren und zu charakterisieren. Seine Anwendung erstreckt sich auf die Untersuchung der Sehnenentwicklung, von Verletzungen, Heilung und Alterung und ermöglicht die umfassende Charakterisierung von Sehnenzellen und ihrer Wechselwirkungen mit der EZM unter verschiedenen Bedingungen unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie-Werkzeugen. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz der Zwei-Photonen-Mikroskopie in der Sehnenbiologie und stellt eine angepasste Methodik vor, um eine effektive Bildgebung und Charakterisierung von Sehnenzellen während der Entwicklung und nach Verletzungen zu erreichen. Die Methode ermöglicht die Verwendung dünner mikroskopischer Schnitte, um ein umfassendes Bild der EZM in Sehnen und den Zellen, die mit dieser Matrix interagieren, zu erstellen. Vor allem wird in dem Artikel eine Technik zur Erzeugung von 3D-Bildern mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in Tiermodellen vorgestellt.
Um richtig zu funktionieren und die Kraft vom Muskel auf den Knochenzu übertragen 1, sind Sehnen auf die intermolekularen und intramolekularen Bindungen zwischen den Kollagenfasern angewiesen. Die komplizierte Selbstorganisation, Vernetzung und Ausrichtung der Kollagenfasern führt zur Etablierung einer hochorganisierten Matrix, die zur biomechanischen Festigkeit und Flexibilität des Sehnengewebes beiträgt 2,3,4. Obwohl auch andere EZM-Proteine zur Stabilität des fibrillären Netzwerks in den Sehnenbeitragen 5, besteht die Trockenmasse der Sehne zu etwa 86 % aus Kollagen6, wobei Kollagen I bis zu 96 % des Gesamtkollagengehalts ausmacht 7,8. Dies macht die Kollagenstruktur letztendlich zu einem wichtigen Ergebnis für die normale Gesundheit und Funktion der Sehnen.
Einige klinische Bildgebungsverfahren, die für Sehnen verwendet werden, sind MRT und/oder Ultraschall. Während die Ultraschalltechnologie Bilder der faszikulären Struktur der Sehne liefert und einen Teil der fibrillären Struktur im Gewebe sichtbar macht9, ist die Auflösung für die Quantifizierung nicht ideal. Die MRT hat eine bessere räumliche Auflösung als die Ultraschallbildgebung, ist aber immer noch begrenzt. Allerdings sind diese Verfahren auch in ihrer potentiellen Bildgebungstiefe durch ein Gewebe begrenzt. Auf der Mikroskala können Klein- und Weitwinkel-Lichtstreuung und konfokale Mikroskopie verwendet werden, um die Struktur der Kollagenfibrillen und mögliche Anomalien zu beurteilen.
Im Gegensatz dazu unterscheidet sich die SHG-Mikroskopie (Second-Harmonic Generation) von anderen bildgebenden Verfahren dadurch, dass sie die äußere Hülle der Kollagenfibrillen erfassen kann. Kollagen-I-Fibrillen in Sehnen sind einachsig parallel durch die Sehnen-ECM organisiert und von Natur aus nicht-zentrosymmetrisch 4,10. Diese Eigenschaften können für die Bildgebung mit einem Multiphotonenmikroskop genutzt werden, das klare Bilder erzeugen kann, die bis zu 2-3 Mal tiefer sind als die konfokale Bildgebung11. Dies ermöglicht es uns auch, optische Abschnitte der Sehne in besserer Qualität zu erzeugen. Wenn Licht in die interessierende Probe projiziert wird, wird ein SHG-Signal erzeugt, und diese Lichtstreuung kann erfasst werden. In den Sehnen entsteht so ein Bild der Kollagenstruktur und -ausrichtung, das es uns ermöglicht, mögliche morphologische und pathologische Folgen von Tendinopathien, Verletzungen usw. zu bewerten.
Da Kollagen den größten Teil der Trockenmasse der Sehnen ausmacht und zur Sehnenfunktion beiträgt 6,12, kann eine Störung der Kollagenstruktur die biomechanischen Eigenschaften der Sehnen beeinträchtigen. Die Analyse seiner Struktur kann uns also helfen, die Auswirkungen und die Schwere von Verletzungen besser zu verstehen und eine Metrik für die Heilungswirksamkeit zu erstellen. In diesem Artikel wird eine Methode vorgestellt, die Multiphotonen- und SHG-Mikroskopie verwendet, um zu analysieren, wie sich Entwicklung und Verletzungen auf die Struktur und Ausrichtung von Kollagen-I-Fibrillen auswirken, und um 3D-Bilder der Sehnen-ECM in Tiermodellen zu erstellen. Daher kann unsere Methode zur Abbildung von Sehnen Forschern helfen, Sehnenzellen und EZM während der Entwicklung oder nach Verletzungen zu charakterisieren.
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Protokoll #2013N0000062) und den AAALAC-Richtlinien am Massachusetts General Hospital durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden BHLHE40 null-Knockout- oder heterozygote weibliche Mäuse im Alter von 30 Tagen in einem Scx-GFP-Hintergrund verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Gewebevorbereitung und -fixierung
2. Dissektion der Sehne und Vorbereitung des Gewebes für die Bildgebung
3. Bildgebung mit einem Multiphotonenmikroskop
Dieses Protokoll ist nützlich für die Charakterisierung von Sehnenzellen und ihrer extrazellulären Matrix (EZM) nach einer Verletzung, während der Entwicklung oder in einem mutierten Zustand. Bei sorgfältiger Dissektion und Aufbereitung der Probe können Z-Stack-Videos durch das Gewebe in sagittaler Ausrichtung erzeugt werden (Video 1 und Video 2). Durch die Verwendung von ImageJ/FIJI zur Verarbeitung und Neuschichtung der Bilder entsteht eine Quera...
In diesem Artikel wird eine Methode zur Präparation, Präparierung und Abbildung der Achillessehne der Maus vorgestellt, wobei die nicht-zentrosymmetrischen kristallinen Eigenschaften der Sehnen-ECM genutzt werden. Zu den wichtigsten Schritten bei der Gewebevorbereitung gehören die Permeabilisierung für Gegenfärbungen und die Sicherstellung der korrekten Gewebeplatzierung in einer Petrischale während der Bildgebung. Anstelle von Draq5 kann Hoechst 33258 in einer Verdünnung von 1:10...
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Die Autoren danken Jenna Galloway und den Mitgliedern des Galloway Lab für ihre Unterstützung und Ermutigung bei der Entwicklung und Fehlerbehebung dieser Protokolle.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9262 | |
2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | |
20 mL scintillation vial | Sigma-Aldrich | Z190527-1PAK | |
4% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Use PFA ampuole to create 4% PFA solution |
6 mm Biopsy Punch Tool | Ted Pella Inc. | 15111-60 | |
60 x 15 mm petri dish | |||
BHLHE40 null knockout or heterozygous mice in a Scx-GFP background | The Jackson Laboratory | JAX ID #029732 | MGI ID #3717419 |
Coverslips | Fisher | 12-544-F | Can use any coverslip that spans the area of the M20 washer |
dPBS | Gibco | 14190144 | |
Draq5 | ABCAM | ab108410 | |
Fine scissors 21 mm cutting edge | Fine Science Tools | 14060-10 | |
FVMPE-RS multiphoton laser scanning microscope | Olympus | ||
Gelfoam Sterile Sponge Size 50 | Pfizer | 00009-0323-01 | |
INSIGHT X3-OL IR pulsed laser | Olympus | ||
MaiTai HPDS-O IR pulsed laser | Olympus | ||
Phosphate-Buffered Saline (1x) | Invitrogen | AM9625 | Dilute 10x PBS in milli-Q water to get 1x solution |
Stainless steel M20 flat washer | McMaster-Carr | ||
Triton X-100 | MP Biomedicals | 807426 | Dilute Triton X-100 in dPBS to get 1% solution |
Vannas spring scissors 4 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15018-10 | |
XLPlan N 25X WMP Lens |
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