الفحص المجهري ثنائي الفوتون لدراسة الأوتار

توضح هذه المقالة عملية تحضير الأوتار وإعدادها وتصويرها باستخدام الفحص المجهري متعدد الفوتونات. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يغطي تطبيق SHG لتحليل محاذاة ألياف الكولاجين وإنشاء تمثيل ثلاثي الأبعاد للأوتار. أثبتت هذه المنهجية أنها ذات قيمة عالية في توصيف خلايا الأوتار وECM الخاصة بها أثناء الإصابة والتطور.

ظهر الفحص المجهري ثنائي الفوتون كأداة قوية لتقييم خلايا الأنسجة العميقة وتوصيف محاذاة المصفوفة خارج الخلية (ECM) في أنظمة بيولوجية مختلفة. تعتمد هذه التقنية على التفاعلات غير الخطية للمادة الضوئية لاكتشاف إشارتين متميزتين: إشارة الانتشار التوافقية الثانية (SHG) ، والتي تسهل تصور ألياف الكولاجين واتجاهها ، وإشارة الإثارة القريبة من الأشعة تحت الحمراء لتصوير التألق الذاتي المتحمس بالأشعة فوق البنفسجية.

أثبت تصوير SHG فعاليته بشكل خاص في تصور ألياف الكولاجين بسبب التركيب البلوري غير المتماثل المركزي للكولاجين الليفي I. بالنظر إلى أن الأوتار عبارة عن أنسجة غنية بالمصفوفة مع عدد محدود من الخلايا ، فإن محتواها العالي من الكولاجين يجعلها مرشحة مثالية للتحليل باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون. وبالتالي ، يوفر الفحص المجهري ثنائي الفوتون وسيلة قيمة لتحليل وتوصيف تشوهات الكولاجين في الأوتار. يمتد تطبيقه إلى دراسة تطور الأوتار والإصابات والشفاء والشيخوخة ، مما يتيح التوصيف الشامل لخلايا الأوتار وتفاعلاتها مع ECM في ظل ظروف مختلفة باستخدام أدوات الفحص المجهري ثنائي الفوتون. يحدد هذا البروتوكول استخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون في بيولوجيا الأوتار ويقدم منهجية معدلة لتحقيق التصوير الفعال وتوصيف خلايا الأوتار أثناء التطور وبعد الإصابة. تسمح الطريقة باستخدام المقاطع المجهرية الرقيقة لإنشاء صورة شاملة ل ECM داخل الأوتار والخلايا التي تتفاعل مع هذه المصفوفة. والجدير بالذكر أن المقالة تعرض تقنية لإنشاء صور ثلاثية الأبعاد باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون في النماذج الحيوانية.

لتعمل بشكل صحيح ونقل القوة من العضلات إلى العظام¹ ، تعتمد الأوتار على الروابط بين الجزيئات وداخل الجزيئات بين ألياف الكولاجين. يؤدي التجميع الذاتي المعقد والتشابك والمحاذاة لألياف الكولاجين إلى إنشاء مصفوفة عالية التنظيم تساهم في القوة الميكانيكية الحيوية ومرونة أنسجة الأوتار^2،3،4. على الرغم من أن بروتينات ECM الأخرى تساهم أيضا في استقرار الشبكة الليفية في الأوتار⁵ ، إلا أن الكتلة الجافة للوتر تبلغ حوالي 86٪ كولاجين⁶ ، حيث يشكل الكولاجين الأول ما يصل إلى 96٪ من إجمالي محتوى الكولاجين ^7,8. هذا يجعل بنية الكولاجين في النهاية ناتجا رئيسيا لصحة الأوتار الطبيعية ووظيفتها.

بعض طرق التصوير السريري المستخدمة للأوتار هي التصوير بالرنين المغناطيسي و / أو الموجات فوق الصوتية. بينما توفر تقنية الموجات فوق الصوتية صورا للبنية اللبسيية للوتر وتكشف عن بعض البنية الليفية في الأنسجة⁹ ، فإن الدقة ليست مثالية للقياس الكمي. يتمتع التصوير بالرنين المغناطيسي بدقة مكانية أفضل من التصوير بالموجات فوق الصوتية ، لكنه لا يزال محدودا. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق محدودة أيضا في عمق التصوير المحتمل من خلال الأنسجة. على نطاق أكثر صغرية ، يمكن استخدام تشتت الضوء بزاوية صغيرة وعريضة والفحص المجهري متحد البؤر لتقييم بنية ألياف الكولاجين وأي تشوهات محتملة.

في المقابل ، يختلف الفحص المجهري للجيل الثاني التوافقي (SHG) عن طرق التصوير الأخرى لأنه يمكن أن يلتقط الغلاف الخارجي لألياف الكولاجين. يتم تنظيم ألياف الكولاجين I في الأوتار بطريقة متوازية أحادية المحور من خلال ECM للوتر وهي غير متماثلة مركزيا بطبيعتها^4،10. يمكن الاستفادة من هذه الخصائص للتصوير باستخدام مجهر متعدد الفوتون ، والذي يمكن أن ينتج صورا واضحة تصل إلى 2-3 مرات أعمق من التصوير متحد^{البؤر 11}. يتيح لنا هذا أيضا إنشاء أقسام بصرية ذات جودة أفضل من الوتر. عندما يتم إسقاط الضوء في العينة محل الاهتمام ، يتم إنتاج إشارة SHG ، ويمكن التقاط تشتت الضوء هذا. في الأوتار ، ينتج عن هذا صورة لبنية الكولاجين ومحاذاة الكولاجين ، مما يسمح لنا بتقييم العواقب المورفولوجية والمرضية المحتملة لاعتلال الأوتار والإصابات وما إلى ذلك.

نظرا لأن الكولاجين يشكل معظم كتلة الأوتار الجافة ويساهم في وظيفة^{الأوتار 6،12} ، فإن اضطراب بنية الكولاجين يمكن أن يؤثر على الخصائص الميكانيكية الحيوية للأوتار. وبالتالي ، فإن تحليل هيكلها يمكن أن يساعدنا في فهم تأثير وشدة الإصابات بشكل أفضل ، بالإضافة إلى إنشاء مقياس لفعالية الشفاء. تستعرض هذه الورقة طريقة تستخدم الفحص المجهري متعدد الفوتون و SHG لتحليل كيفية تأثير التطور والإصابات على بنية ومحاذاة ألياف الكولاجين I وتوليد صور ثلاثية الأبعاد لوحدة التحكم في الوتر في النماذج الحيوانية. لذلك ، قد تساعد طريقتنا في تصوير الأوتار الباحثين على توصيف خلايا الأوتار و ECM أثناء التطور أو بعد الإصابة.

تم إجراء جميع التجارب على وفقا للجنة رعاية المؤسسي واستخدامه (IACUC) (البروتوكول #2013N0000062) وإرشادات AAALAC في مستشفى ماساتشوستس العام. BHLHE40 تم استخدام إناث الفئران بالضربة القاضية الفارغة أو متغايرة الزيجوت في خلفية Scx-GFP ، بعمر 30 يوما ، في هذه الدراسة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. تحضير الأنسجة وتثبيتها

1. لتحضير الأنسجة ، قم بالقتل الرحيم للفئران في غرفة ثاني أكسيد الكربون₂ (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) متبوعا بخلع عنق الرحم.
2. للمساعدة في تقليل كمية الفراء التي قد تلتصق بعينة الأنسجة ، رش الفأر بنسبة 70٪ EtOH حتى يتشبع الفراء. جلد الأطراف الخلفية ، ثم باستخدام المقص ، قم بإزالة الطرفين الخلفيين عن طريق قطع مفصل الورك.
3. ضع الطرفين الخلفيين في قارورة تلألؤ سعة 20 مل ، واغمرهما في 4٪ PFA بحيث تمتلئ القارورة. ضع القوارير على حرارة 4 درجات مئوية مع التحريك طوال الليل.
4. اغسل الأطراف الخلفية في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة (RT) مع التحريك لمدة 10 دقائق وكرر ما مجموعه 3 مرات. اغمر الأطراف الخلفية في 0.5 متر EDTA (درجة الحموضة 8.0) عند 4 درجات مئوية مع التحريك لمدة تصل إلى أسبوعين ، واستبدلها ب EDTA الطازج كل 2-3 أيام.
5. اغسل الأطراف الخلفية في 1x PBS في RT مع التحريك لمدة 10 دقائق ، وكرر الغسيل ما مجموعه 3 مرات.
6. اغمر الأطراف في 1x PBS طازج وخزنها على حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامها للتصوير.

2. تشريح الأوتار وإعداد الأنسجة للتصوير

1. أثناء إمساك القدم بالملقط ، حرك أحد طرفي شفرة المقص الزنبركي (انظر جدول المواد) أسفل وتر العرقوب وتأكد من القطع بالقرب من التقاطع العضلي قدر الإمكان.
2. أمسك الطرف العضلي المقطوع للوتر بالملقط واستخدم مقص الزنبرك لقطع الوتر بالقرب من العظم قدر الإمكان.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر ، استخدم ملقطا للمساعدة في إبعاد وتر العرقوب عن بقية الطرف الخلفي أثناء القطع الأول. تأكد من عدم سحق الأنسجة أو إتلافها ، لأنها ستؤثر على محاذاة الكولاجين أثناء التصوير.
3. للتغلغل والحصول على بقعة نووية مضادة ، اغمر الوتر المقطوع في PBT (1٪ Triton-X في PBS) مع 0.1٪ Draq5 (تركيز المخزون ، 5 ملي مولار ، انظر جدول المواد). ضع الوتر في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل ، وأضف 1 ميكرولتر من Draq5 إلى 1 مل من PBT. احتضن بين عشية وضحاها في RT على هزاز. نظرا لأن Draq5 حساس للضوء ، قم بتغطية أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة بورق الألمنيوم وحماية العينات من الضوء.
4. قبل التصوير ، قم بإزالة محلول Draq5 واستبدله ب dPBS. تأكد من الاستمرار في حماية العينة من الضوء.
   تنبيه: يحتوي Draq5 على سمية من الفئة الثالثة ويعتبر خطيرا وفقا لمعيار اتصالات المخاطر OSHA. تجنب ملامسة وتخلص منها في حاوية نفايات موسمية.
5. باستخدام أداة ثقب الخزعة بقطر داخلي يبلغ 6 مم ، قم بقص قطعة من رغوة الجل (انظر جدول المواد) وضعها في طبق بتري صغير مقاس 60 × 15 مم. أضف ddH₂O إلى الطبق للسماح لرغوة الجل بالتمدد.
6. ضع وتر العرقوب المقطوع على رغوة الجل. باستخدام غطاء لاصق على الغسالة ، ضع الغسالة بحذر فوق الوتر حتى يتلامس الغطاء مع الأنسجة. لتجنب المشكلات عند التصوير ، تأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين العينة والغطاء. إذا لزم الأمر ، أضف المزيد من ddH₂O إلى الطبق لتغطية العينة والغسالة بالغطاء.

3. التصوير بمجهر متعدد الفوتون

1. باستخدام مجهر ليزر متعدد الفوتون FVMPE-RS ، هدف 25x يمكن غمره في الماء ، والليزر النبضي HPDS-O IR ، والليزر النبضي بالأشعة تحت الحمراء (انظر جدول المواد) ، حدد العينة ومنطقة الاهتمام التي سيتم تصويرها باستخدام مسار ضوء EPI. بمجرد تحديد موقع العينة ، اضبط الكاميرا على الطرف العضلي أو الطرف البطاني لوتر العرقوب.
2. قم بتبديل مسار الضوء إلى LSH ، واضبط إعداد ليزر الأشعة تحت الحمراء في Laser 2 على 840 نانومتر ، وقم بالمحاذاة بنشاط. اضبط قوة الجهد العالي لتتمكن من رؤية الأنسجة وإشارة SHG ، دون تجاوز 20٪. لا تضبط الكسب وحافظ على الإزاحة تساوي 0.
3. بعد ذلك، قم بتكوين معلمات z-stack للحصول على نماذج الصور. استخدم حجم مسح ضوئي 1024 × 1024 واضبط حجم الخطوة على 0.4 ميكرون. تتكون الأكوام Z ، في المتوسط حوالي 150 شريحة ، وتبدأ من الغلاف الخارجي وتتحرك نحو مركز الوتر حتى لا تكون إشارة SHG واضحة ، مما ينتج عنه أقسام بصرية سهمية¹³.
4. اضبط طاقة الليزر على وضع Bright Z للسماح بتوحيد الكشف عن الإشارة. بمجرد إنشاء معلمات بدء / إيقاف المكدس Z ، اضبط شدة الليزر من 4 في بداية التصوير و 6 في نهاية التصوير. يساعد هذا في الحفاظ على الاتساق في إشارات SHG حيث يصور النطاق بشكل أعمق في الأنسجة.
5. بمجرد إنشاء مكدسات z، قم بمعالجتها بشكل أكبر في ImageJ/FIJI لإنشاء فيلم من المقاطع البصرية في الاتجاه العرضي. للقيام بذلك ، افتح برنامج ImageJ / FIJI¹⁴ وانقر فوق Image > Stacks > Reslice. سيسمح لنا ذلك بالحصول على رؤية عرضية لوتر العرقوب ، مما يكشف عن التشكل النجمي لخلايا العرقوب واتجاهها في مصفوفة الكولاجين.

هذا البروتوكول مفيد لتوصيف خلايا الأوتار ومصفوفتها خارج الخلية (ECM) بعد الإصابة أو أثناء التطور أو في حالة طفرة. من خلال التشريح الدقيق وإعداد العينة ، يمكن إنشاء مقاطع فيديو z-stack من خلال الأنسجة في اتجاه سهمي (فيديو 1 وفيديو 2). باستخدام ImageJ / FIJI لمعالجة ا?...

تقدم هذه المقالة طريقة لتحضير وتشريح وتصوير وتر العرقوب للفأر ، باستخدام الخصائص البلورية غير المتماثلة المركزية لوتر ECM. تتضمن الخطوات الرئيسية في تحضير الأنسجة نفاذية البقع المضادة وضمان وضع الأنسجة بشكل صحيح في طبق بتري أثناء التصوير. بدلا من Draq5 ، يمكن استخدام Hoechst 33...

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

يشكر المؤلفون جينا غالواي وأعضاء مختبر غالواي على دعمهم وتشجيعهم في تطوير هذه البروتوكولات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.