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Method Article
Este artículo describe el proceso de preparación, configuración y obtención de imágenes de tendones mediante microscopía multifotónica. Además, cubre la aplicación de SHG para analizar la alineación de las fibrillas de colágeno y la creación de una representación 3D de los tendones. Esta metodología resulta muy valiosa en la caracterización de las células tendinosas y su MEC durante la lesión y el desarrollo.
La microscopía de dos fotones se ha convertido en una potente herramienta para evaluar las células de tejido profundo y caracterizar la alineación de la matriz extracelular (MEC) en varios sistemas biológicos. Esta técnica se basa en interacciones no lineales luz-materia para detectar dos señales distintas: la señal de difusión generada por el segundo armónico (SHG), que facilita la visualización de las fibras de colágeno y su orientación, y la señal de excitación del infrarrojo cercano para obtener imágenes de la autofluorescencia excitada por ultravioleta.
Las imágenes SHG resultan especialmente efectivas en la visualización de fibras de colágeno debido a la estructura cristalina no centrosimétrica del colágeno fibrilar I. Dado que los tendones son tejidos ricos en matriz con un número limitado de células, su alto contenido en colágeno los convierte en candidatos ideales para el análisis mediante microscopía de dos fotones. En consecuencia, la microscopía de dos fotones ofrece un medio valioso para analizar y caracterizar las anomalías del colágeno en los tendones. Su aplicación se extiende al estudio del desarrollo de los tendones, las lesiones, la curación y el envejecimiento, lo que permite la caracterización integral de las células del tendón y sus interacciones con la MEC en diversas condiciones utilizando herramientas de microscopía de dos fotones. Este protocolo describe el uso de la microscopía de dos fotones en la biología de los tendones y presenta una metodología adaptada para lograr imágenes y caracterizaciones efectivas de las células del tendón durante el desarrollo y después de la lesión. El método permite la utilización de secciones microscópicas delgadas para crear una imagen completa de la MEC dentro de los tendones y las células que interactúan con esta matriz. En particular, el artículo muestra una técnica para generar imágenes en 3D utilizando microscopía de dos fotones en modelos animales.
Para funcionar correctamente y transmitir la fuerza del músculo al hueso1, los tendones dependen de los enlaces intermoleculares e intramoleculares entre las fibras de colágeno. El intrincado autoensamblaje, la reticulación y la alineación de las fibras de colágeno dan como resultado el establecimiento de una matriz altamente organizada que contribuye a la resistencia biomecánica y la flexibilidad del tejido tendinoso 2,3,4. Aunque otras proteínas de la MEC también contribuyen a la estabilidad de la red fibrilar en los tendones5, la masa seca del tendón es aproximadamente un 86% de colágeno6, y el colágeno I constituye hasta el 96% del contenido total de colágeno 7,8. En última instancia, esto hace que la estructura del colágeno sea una salida clave de la salud y la función normales del tendón.
Algunas modalidades de imágenes clínicas utilizadas para los tendones son la resonancia magnética y/o la ecografía. Si bien la tecnología de ultrasonido proporciona imágenes de la estructura fascicular del tendón y revela parte de la estructura fibrilar en el tejido9, la resolución no es ideal para la cuantificación. La resonancia magnética tiene una mejor resolución espacial que la ecografía, pero sigue siendo limitada. Sin embargo, estos métodos también están limitados en su profundidad potencial de imagen a través de un tejido. En una escala más microscópica, la dispersión de luz de ángulo pequeño y gran angular y la microscopía confocal se pueden utilizar para evaluar la estructura de las fibrillas de colágeno y cualquier anomalía potencial.
Por el contrario, la microscopía de generación de segundos armónicos (SHG) difiere de otros métodos de imagen, ya que puede capturar la capa externa de las fibrillas de colágeno. Las fibrillas de colágeno I en los tendones se organizan de forma uniaxial paralela a través de la MEC del tendón y son de naturaleza no centrosimétrica 4,10. Estas propiedades se pueden aprovechar para obtener imágenes con un microscopio multifotónico, que puede producir imágenes claras que son hasta 2-3 veces más profundas que las imágenes confocales11. Esto también nos permite generar secciones ópticas del tendón de mejor calidad. Cuando la luz se proyecta en la muestra de interés, se produce una señal SHG y se puede capturar esta dispersión de la luz. En los tendones, esto produce una imagen de la estructura y alineación del colágeno, lo que nos permite evaluar las posibles consecuencias morfológicas y patológicas de tendinopatías, lesiones, etc.
Dado que el colágeno constituye la mayor parte de la masa seca del tendón y contribuye a la función del tendón 6,12, la alteración de la estructura del colágeno puede afectar las propiedades biomecánicas de los tendones. Por lo tanto, analizar su estructura puede ayudarnos a comprender mejor el impacto y la gravedad de las lesiones, así como a crear una métrica para la eficacia de la curación. En este trabajo se revisa un método que utiliza microscopía multifotónica y SHG para analizar cómo el desarrollo y las lesiones afectan a la estructura y alineación de las fibrillas de colágeno I y para generar imágenes 3D de la MEC tendinosa en modelos animales. Por lo tanto, nuestro método para obtener imágenes de los tendones puede ayudar a los investigadores a caracterizar las células del tendón y la MEC durante el desarrollo o después de una lesión.
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (Protocolo #2013N0000062) y las pautas de la AAALAC en el Hospital General de Massachusetts. BHLHE40 Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra heterocigotos o knockout nulos en un fondo Scx-GFP, con una edad de 30 días. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación y fijación de tejidos
2. Disección del tendón y preparación del tejido para la obtención de imágenes
3. Obtención de imágenes con un microscopio multifotónico
Este protocolo es útil para caracterizar las células tendinosas y su matriz extracelular (MEC) después de una lesión, durante el desarrollo o en una condición mutante. Con una disección y preparación cuidadosas de la muestra, se pueden generar videos z-stack a través del tejido en una orientación sagital (Video 1 y Video 2). Mediante el uso de ImageJ/FIJI para procesar y recortar las imágenes, se crea una vista transversal del tendón de Aquile...
Este artículo presenta un método para preparar, diseccionar e obtener imágenes del tendón de Aquiles del ratón, utilizando las propiedades cristalinas no centrosimétricas de la ECM del tendón. Los pasos clave en la preparación de tejidos incluyen la permeabilización para las contratinciones y la garantía de la colocación adecuada del tejido en una placa de Petri durante la obtención de imágenes. En lugar de Draq5, Hoechst 33258 se puede utilizar con una dilución 1:100.000
Los autores no tienen nada que revelar.
Los autores agradecen a Jenna Galloway y a los miembros de Galloway Lab por su apoyo y aliento en el desarrollo y la resolución de problemas de estos protocolos.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9262 | |
2 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1620-2700 | |
20 mL scintillation vial | Sigma-Aldrich | Z190527-1PAK | |
4% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Use PFA ampuole to create 4% PFA solution |
6 mm Biopsy Punch Tool | Ted Pella Inc. | 15111-60 | |
60 x 15 mm petri dish | |||
BHLHE40 null knockout or heterozygous mice in a Scx-GFP background | The Jackson Laboratory | JAX ID #029732 | MGI ID #3717419 |
Coverslips | Fisher | 12-544-F | Can use any coverslip that spans the area of the M20 washer |
dPBS | Gibco | 14190144 | |
Draq5 | ABCAM | ab108410 | |
Fine scissors 21 mm cutting edge | Fine Science Tools | 14060-10 | |
FVMPE-RS multiphoton laser scanning microscope | Olympus | ||
Gelfoam Sterile Sponge Size 50 | Pfizer | 00009-0323-01 | |
INSIGHT X3-OL IR pulsed laser | Olympus | ||
MaiTai HPDS-O IR pulsed laser | Olympus | ||
Phosphate-Buffered Saline (1x) | Invitrogen | AM9625 | Dilute 10x PBS in milli-Q water to get 1x solution |
Stainless steel M20 flat washer | McMaster-Carr | ||
Triton X-100 | MP Biomedicals | 807426 | Dilute Triton X-100 in dPBS to get 1% solution |
Vannas spring scissors 4 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15018-10 | |
XLPlan N 25X WMP Lens |
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