Determinação das concentrações de proteína total e proteína bioativa no colostro bovino

O colostro bovino é uma fonte primária de nutrientes e suporte imunológico para o bezerro recém-nascido. O entendimento do nível de proteínas terapêuticas (lactoferrina e IgG) é importante para a dosagem e padronização do colostro bovino para consumo humano.

O colostro é um fluido biológico complexo produzido por mamíferos imediatamente após o parto. Atende a todos os requisitos nutricionais para neonatos como uma boa fonte de macro e micronutrientes, peptídeos bioativos e fatores de crescimento. O colostro bovino também é uma fonte potencial de nutrição e bioativo devido ao seu rico teor de proteínas que inclui imunoglobulina G (IgG) e lactoferrina. No entanto, o nível de lactoferrina e IgG no colostro bovino muda acentuadamente durante o período de lactação. Portanto, monitorar a concentração de IgG e lactoferrina para o uso de colostro bovino como fonte de proteína é uma questão importante a ser estudada. Os métodos neste artigo descrevem como determinar o teor de proteína, bem como concentrações específicas de lactoferrina e IgG. Esses métodos incluem as seguintes etapas: Isolamento de proteínas de colostro bovino, determinação da concentração de proteína via ensaio de ácido bicinconínico (BCA), visualização de proteínas via SDS-PAGE, determinação da concentração de lactoferrina e IgG usando um ensaio ELISA.

O colostro é a secreção inicial da glândula mamária produzida pelos mamíferos logo após o parto. O colostro é rico em macro e micronutrientes, peptídeos antimicrobianos e fatores de crescimento 1,2,3,4. A composição varia gradualmente ao longo do tempo durante a transição para o leite maduro ^5,6,7, mas mais significativamente dentro de 24 h após o parto⁸. A composição do colostro também é influenciada por fatores maternos, incluindo idade, paridade, raça, saúde e estado nutricional, bem como fatores extrínsecos, incluindo estação do ano, parto prematuro, lactação prematura, fatores de manuseio colostral (colostro acumulado e temperatura de armazenamento) e indução do parto ^9,10,11. Comparado com o leite maduro, o colostro contém menos lactose e mais gordura, proteína, peptídeos, nitrogênio não proteico, cinzas, hormônios, fatores de crescimento, citocinas, nucleotídeos, vitaminas e minerais¹². O colostro bovino contém uma ampla gama de proteínas, incluindo imunoglobulinas, lactoferrina, α-lactoalbumina (α-LA), β-lactoglobulina (β-Lg), lactoperoxidase e vários fatores de crescimento¹³. A concentração de proteína total do colostro bovino varia entre 11,26 mg/mL e 169,55 mg/mL¹⁴. O teor de proteína compreende soro de leite e caseína na concentração média de 124,00 mg/mL e 26,00 mg/mL, respectivamente¹⁵. A porção do soro de leite contém três tipos principais de imunoglobulinas (Igs) como IgG (85%-90%), IgM (7%) e IgA (5%)¹⁶. A principal Ig no colostro bovino é a IgG, que fornece imunidade passiva e modula os sistemas imunológico adaptativo e inato no bezerro¹⁷. A concentração inicial de Ig do colostro bovino de primeira ordenha pode variar de 20 a 200 mg/mL e diminuir para cerca de 0,4-1,0 mg/mL¹⁸. A concentração média de IgG é de aproximadamente 60 mg/mL e diminui constantemente para níveis abaixo de 1 mg/mL durante a transição para o leite maduro¹⁹.

Outra proteína bioativa importante no colostro é a lactoferrina, uma glicoproteína de ligação ao ferro com uma concentração de 1,5-5 mg/mL. As propriedades da lactoferrina incluem aumentar a absorção de ferro, bem como possuir atividade antimicrobiana^20,21, ligar lipopolissacarídeos, imunomodulação e estimular o crescimento de células epiteliais intestinais e fibroblastos²². O colostro bovino também contém α-lactoalbumina e β-lactoglobulina. Essas proteínas são fontes de aminoácidos essenciais e também possuem atividade bactericida 23,24,25. As concentrações médias de α-LA e β-Lg no colostro são em média de 2,77 mg/mL² e 11,5 mg/mL²⁶, respectivamente. Depois disso, essas concentrações diminuem para 1-1,5 mg/mL²⁷ e 4,8 mg/mL²⁶ no leite maduro. O colostro também contém uma quantidade significativa de lactoperoxidase (média de 22,8 μg/mL) e lisozima (média de 0,40 μg/mL)²⁶. A lactoperoxidase é uma glicoproteína que possui atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e negativas²⁸ por produzir espécies reativas de oxigênio. A lisozima funciona como um agente antimicrobiano, clivando o componente peptidoglicano das paredes celulares bacterianas, levando à morte celular^29,30.

Devido às suas propriedades, IgG e lactoferrina são processadas em diferentes produtos alimentícios para fortificar fórmulas infantis, suplementos alimentares, preparações ricas em proteínas para convalescentes e esportistas, bem como em farmacologia e cosmetologia 31,32,33. O colostro bovino representa uma importante fonte de IgG e lactoferrina. No entanto, a composição dessas proteínas bioativas no colostro bovino muda acentuadamente durante o período de lactação. Portanto, o monitoramento de mudanças na concentração dessas proteínas bioativas em amostras de colostro usadas para pesquisa e processamento de alimentos é fundamental. Este estudo tem como objetivo descrever os métodos de monitoramento da concentração e composição da proteína total, lactoferrina e IgG no colostro bovino durante os 6 dias após o parto.

Amostras de colostro foram coletadas por 6 dias após o parto ao meio-dia durante o período de julho a agosto, de 28 vacas leiteiras holandesas da Uluova Milk Trading Company em Çanakkale, Turquia, e ultracongeladas. As amostras coletadas no mesmo dia foram agrupadas de acordo com o dia de cada amostra e analisadas quanto às concentrações de proteína total, lactoferrina e IgG. Todas as amostras foram analisadas em duplicata.

1. Preparação da amostra

1. Misturar 200 μl de colostro bovino com 400 μl de dH₂O para obter uma amostra diluída para análise. Diluir todas as amostras em conformidade.
2. Centrifugar amostras diluídas e não diluídas a 4 °C, 1000 x g durante 30 min.
3. Separe a fase intermediária em um novo tubo devidamente rotulado. Repita a etapa 1.2. para obter uma fase intermediária clara. Armazenar toda a fase intermédia e as amostras diluídas a -20 °C, se não forem utilizadas imediatamente.
4. Use a fase intermediária obtida de amostras diluídas para ensaios de BCA, SDS-PAGE e lactoferrina. Colete a fase intermediária de amostras não diluídas para o ensaio de IgG.
5. Prepare diluições de amostra para cada amostra para garantir que as leituras estejam dentro da faixa de curva padrão. Dilua cada fase intermediária obtida das amostras diluídas para 1:300 para o ensaio BCA e 1:30.000 para o ensaio de lactoferrina e dilua cada fase intermediária obtida de amostras não diluídas para 1:400.000 para o ensaio IgG.
   NOTA: Os fatores de diluição são determinados com base no valor de absorbância e na curva padrão.

2. Determine a concentração de proteína usando o kit de ensaio de proteína BCA

1. Preparação de padrões e reagentes
   1. Use os reagentes fornecidos no kit disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) a serem usados para o ensaio: reagente BCA A, contendo carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, ácido bicinconínico e tartarato de sódio em hidróxido de sódio 0,1 M. O reagente B do BCA contém 4% de sulfato cúprico. Albumina (BSA), contém albumina de soro bovino a 2,0 mg/mL em solução salina a 0,9% e azida sódica a 0,05%.
   2. Equilibre todas as amostras e padrões de proteína à temperatura ambiente (RT).
   3. Preparar volumes suficientes de reagente de trabalho (WR) misturando a proporção de 50:1 do reagente A:B. São necessários 200 μL de WR para cada amostra e padrão.
   4. Preparar padrões de albumina diluída (BSA) de acordo com o seguinte esquema de diluição (Tabela 1), que apresenta uma faixa de trabalho entre 20-2.000 μg/mL de concentração final de BSA. Utilizar dH₂O como diluente.

Tabela 1: Esquema de diluição das normas BSA.

2. Procedimento de ensaio BCA
   1. Transfira 25 μL de cada padrão ou amostra de BCA para uma placa de 96 poços. Adicione 200 μL do WR a cada padrão ou amostra que contenha o poço. Misture bem o prato em uma coqueteleira por 30 s.
   2. Cubra a placa com um selador de placas e incube a 37 °C por 30 min. Após a incubação, deixe as reações se equilibrarem ao RT por cerca de 10 min. Leia cada placa a 562 nm usando um leitor de microplacas com seu software associado.
3. Gerando curva padrão e determinando resultados
   1. Registar os valores de absorvância para os padrões e amostras. Ver quadro 1 para a série de diluições. Subtraia os valores de absorbância do branco padrão de cada valor de absorbância de padrões e amostra. Calcule a média das leituras duplicadas para cada padrão e amostra para estimar a concentração total de proteína.
   2. Construa uma curva padrão traçando a absorbância média corrigida para cada padrão no eixo x e a concentração no eixo y. Desenhe uma curva linear com o software apropriado capaz de ajustar a curva de quatro parâmetros.
   3. Utilizar a curva-padrão para determinar a concentração de cada amostra, interpolando a sua resposta à concentração. Multiplicar com o factor de diluição (passo 1.5) para obter a concentração real da amostra.

3. Visualização da proteína usando o ensaio SDS-PAGE

1. Preparação de amostras e soluções
   1. Prepare soluções de estoque
      1. Prepare 10% (p / v) SDS, 1,5 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (p / v) solução de persulfato de amônio (APS) (prepare fresco).
      2. (w / v) SDS: Pesar 1 g de SDS e adicionar 10 mL de dH₂O.
      3. M Tris-HCl pH 8,8: Pesar 18,15 g de Tris e dissolver com ~ 60 mL de dH₂O. Ajustar para pH 8,8 com HCl. Adicionar dH₂O para trazer o volume para 100 mL.
      4. M Tris-HCl pH 6,8: Pesar 6,00 g de Tris e dissolver com ~ 60 mL de dH₂O. Ajustar para pH 6,8 com HCl. Adicionar dH₂O para trazer o volume para 100 mL.
      5. APS: Pesar 15 mg de APS e adicionar 150 μL de dH₂O.
         CUIDADO: A acrilamida e o SDS são tóxicos e prejudiciais. Use luvas de proteção e trabalhe sob um capuz.
   2. Prepare o tampão de amostra adicionando 50 μL de β-mercaptoetanol em 950 μL de tampão de amostra 2x SDS-PAGE.
      CUIDADO: β-mercaptoetanol é tóxico se inalado. Use luvas de proteção e trabalhe sob um capuz.
   3. Prepare o tampão de corrida misturando 100 mL de 10x Tris-glicina SDS Running Buffer com 900 mL de dH₂O.
   4. Prepare a solução de coloração (45% dH₂O, 45% Metanol, 10% ácido acético glacial, 2 g de Coomassie Brilliant Blue R).
   5. Preparar a solução de descoloração (50% dH₂O, 40% Metanol, 10% ácido acético glacial).
2. Preparação de gel
   1. Prepare o equipamento da unidade de eletroforese, incluindo de gel, fontes de alimentação, eletrodos e cabos para o ensaio. Limpe as placas de vidro com etanol e monte o sanduíche. Certifique-se de que as bordas inferiores das placas de vidro e espaçadores estejam bem alinhadas.
   2. Prepare a mistura de gel de separação contendo 3,5 mL de dH₂O, 2,4 mL de 40% de acrilamida/metileno bis acrilamida, 2 mL de Tris-HCl 1,5M, 100 μL de SDS a 10% (p / v), 80 μL de 10% APS, 8 μL de N, N, N ', N '-Tetrametiletilenodiamina (TEMED).
      CUIDADO: TEMED é tóxico e/ou irritante. Use luvas de proteção e trabalhe sob um capuz.
   3. Despeje a mistura de gel de separação nas placas de gel a um nível aproximadamente 1-1.5 cm abaixo do topo da placa mais curta.
   4. Coloque a parte superior do gel de separação com isopropanol para remover as bolhas na parte superior do gel e evitar que o gel polimerizado seque.
   5. Despeje isopropanol em cima do gel de separação após a polimerização do gel de separação por pelo menos 15 min.
   6. Prepare a mistura de gel de empilhamento contendo 1.92 mL de dH₂O, 300 μL de 40% de acrilamida/metileno bis acrilamida, 750 μL de 0.5M Tris-HCl, 100 μL de 10% (p/v) SDS, 30 μL de 10% APS e 3 μL de TEMED.
   7. Despeje a solução de gel de empilhamento em cima do gel de separação para que as placas de gel sejam preenchidas. Insira o pente na parte superior dos espaçadores.
   8. Deixe o gel de empilhamento polimerizar em temperatura ambiente por aproximadamente 15 min.
3. Executando o gel
   1. Prenda o gel ao conjunto do eletrodo. Adicione 1x Tris-glicina SDS Running Buffer recém-preparado em ambas as câmaras do aparelho.
   2. Retire o pente.
   3. Carregue 5 μL da escada (10-250 kDa) e 8 μL da fase intermediária de amostras diluídas nos poços do gel. Execute o gel a 80 V até que o corante migre para o gel de separação e aumente para 120 V até que o corante atinja o fundo do gel. Desligue a potência aplicada depois que o corante atingir o fundo do gel.
4. Coloração e descoloração do gel
   1. Remova o gel do aparelho assim que a corrida estiver concluída e remova os espaçadores e placas de vidro. Coloque o gel em uma pequena bandeja.
   2. Manchar o gel adicionando solução de coloração (passo 3.1.4) durante 30 min com agitação suave a 55 rpm.
   3. Despeje a solução de coloração do gel. Enxágue o gel com uma pequena quantidade de solução descolorante e descarte o corante.
   4. Adicione um volume suficiente de solução de descoloração para cobrir o gel e despiste com agitação suave por ~ 1 h até que as bandas estejam visíveis.

4. Concentração de lactoferrina usando um ELISA de lactoferrina bovina

1. Preparação de padrões e reagentes
   1. Use o kit ELISA LF / LTF / lactoferrina bovina disponível comercialmente para este ensaio.
   2. Equilibre todas as amostras e padrões para RT.
   3. Preparar volumes suficientes de solução de trabalho dos reagentes de detecção A e B responsáveis pela ligação ao antigénio capturado.
   4. Diluir os reagentes de detecção A e B até uma proporção de 1:100 usando os diluentes de ensaio A e B, respectivamente.
   5. Prepare um tampão de lavagem de trabalho 1x diluindo o concentrado de tampão de lavagem 30x com dH₂O.
   6. Coloque uma quantidade suficiente de solução de substrato de 3,3',5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) em um microtubo estéril.
   7. Ressuspenda um tubo de padrão liofilizado (100 ng/mL) com 0,5 mL do diluente da amostra e incube em RT por 10 min com agitação suave. Gire o frasco para garantir que todo o sanple liofilizado seja coletado no fundo.
   8. Preparar uma série de diluições-padrão de acordo com o esquema de diluição a seguir indicado (quadro 2).

Tabela 2: Esquema de diluição dos padrões de lactoferrina bovina.

2. Medição da concentração de lactoferrina bovina
   1. Pipetar 100 μL de cada padrão ou amostra de lactoferrina na placa de tira de 96 poços revestida. Cubra a placa com um selador de placas para evitar a evaporação. Incubar a 37 °C durante 1 h.
   2. Aspire o líquido de cada poço. Adicione 100 μL do reagente de detecção A solução de trabalho a cada poço. Cubra com um selador de placas e agite suavemente para garantir uma mistura completa. Incubar a 37 °C durante 1 h.
   3. Lave três vezes adicionando aproximadamente 350 μL de 1x tampão de lavagem após aspirar o líquido de cada poço. Deixe cada lavagem descansar por 1-2 minutos antes de aspirar completamente. Após a última lavagem, aspire para remover qualquer tampão de lavagem restante, inverta a placa e bata contra um papel absorvente limpo.
   4. Adicione 100 μL da solução de trabalho do reagente de detecção B a cada poço. Cubra com um novo selador de placas. Incubar a 37 °C durante 30 min. Aspirar o líquido de cada alvéolo e lavá-lo cinco vezes, conforme descrito no passo 4.2.3. Coloque 90 μL de solução de substrato TMB em cada poço e cubra com um novo selador de placas.
   5. Incubar a 37 °C durante 10-20 minutos de distância da luz. Verifique a cor ideal monitorando periodicamente. Observe que a cor azul intensa no poço inclui lactoferrina de alto concentrado.
   6. Adicione 50 μL de solução de parada a cada poço. A cor mudará de azul para amarelo. Meça a absorbância de cada poço imediatamente a 450 nm usando um leitor de microplacas com seu software associado.
      NOTA: Bata suavemente na placa para garantir uma mistura completa até que a mudança de cor seja uniforme.
3. Gerando curva padrão e determinando resultados
   1. Siga a etapa 2.3.1 para geração de dados para estimar a concentração de lactoferrina.
   2. Construa uma curva padrão traçando a absorbância média corrigida para cada padrão, conforme descrito na etapa 2.3.2, mas desenhando uma curva polinomial com software apropriado capaz de ajustar a curva de quatro parâmetros.
   3. Calcular o teor de lactoferrina de cada amostra interpolando o valor de absorção na equação gerada, conforme descrito no passo 2.3.3.

5. Determinação da concentração de IgG de amostras usando ELISA de IgG bovina

1. Preparação de padrões e reagentes
   1. Use os itens exigidos entre os fornecidos no Kit ELISA IgG Bovino.
   2. Equilibre todas as amostras e padrões para RT.
   3. Prepare volumes suficientes de solução de conjugado enzima-anticorpo diluindo 10 μL de concentrado de peroxidase de rábano (HRP)-avidina (100x) com 990 μL de diluente conjugado enzima-anticorpo.
   4. Prepare volumes suficientes de 1x tampão de lavagem diluindo 20x concentrado de tampão de lavagem com dH₂O.
   5. Prepare volumes suficientes da solução diluente 1x diluindo o concentrado diluente 20x com dH₂O.
   6. Adicionar 1,0 ml de dH₂O ao calibrador de IgG bovino e misturar delicadamente até dissolver. A concentração final do calibrador é de 123.000 ng/mL.
   7. Preparar séries de diluição-padrão de acordo com o esquema de diluição descrito no quadro 3.

Tabela 3: Esquema de diluição dos padrões de IgG bovina.

2. Procedimento de ensaio ELISA de IgG bovina
   1. Pipetar 100 μL de cada padrão de IgG ou amostra na placa de tira de 96 poços revestida. Cubra a placa com um selador de placas e incube em RT por 30 min. Aspire o líquido de cada poço.
   2. Lave quatro vezes enchendo os poços com 1x tampão de lavagem e aspire. Após a última lavagem, aspire para remover qualquer tampão de lavagem residual, depois inverta a placa e bata contra o papel absorvente limpo. Adicione 100 μL de conjugado enzima-anticorpo adequadamente diluído a cada poço. Cubra com um selador de placas e agite suavemente para garantir uma mistura completa.
   3. Incubar em RT por 10 min. Lave e remova o tampão de lavagem residual dos poços conforme descrito na etapa 5.2.2. Adicione 100 μL de substrato TMB a cada poço; Cubra com um novo selador de placas.
   4. Incube em RT por precisamente 10 minutos longe da luz. Pare a reação adicionando 100 μL de solução de parada a cada poço. Leia cada placa a 450 nm usando um leitor de microplacas com seu software associado.
3. Gerando curva padrão e determinando resultados
   1. Siga a etapa 2.3.1 para a edição de dados para estimar a concentração de IgG.
   2. Construa uma curva padrão traçando a concentração no eixo x e a absorbância média corrigida para cada padrão no eixo y. Desenhe uma curva polinomial com o software apropriado capaz de ajustar a curva de quatro parâmetros.
   3. Calcular o teor de IgG de cada amostra interpolando o valor de absorção na equação gerada, conforme descrito no passo 2.3.3.

Seguindo o protocolo, as amostras de colostro bovino foram analisadas para determinar a concentração de proteína, lactoferrina e IgG. Os resultados das análises de proteína, lactoferrina e IgG do colostro bovino são apresentados na Tabela 4.

Tabela 4: Concentração de proteína, lactoferrina e IgG de colostro bovino.

Este estudo fornece informações sobre mudanças consideráveis nas concentrações de proteína, lactoferrina e IgG no colostro durante a transição para o leite maduro. A detecção de alterações na concentração de lactoferrina e IgG foi realizada por ELISA sanduíche, e a concentração de proteína total foi analisada pelo ensaio de BCA. Os resultados indicam que o colostro precoce tem a maior concentração de proteína, lactoferrina e IgG, que posteriormente diminuiu nos 3 di...

Os autores não têm nada a divulgar.

Este estudo é apoiado pela Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.). RMD e BMH são funcionários da Evolve BioSystems, uma empresa focada na restauração do microbioma infantil.