تحديد إجمالي تركيزات البروتين والبروتين النشط بيولوجيا في اللبأ البقري

Ayşenur Arslan; Hatice Duman; Merve Kaplan; Hasan Uzkuç; Ayşe Bayraktar; Melih Ertürk; Merve Alkan; Steven A. Frese; Rebbeca M. Duar; Bethany M. Henrick; Sercan Karav

doi:10.3791/63001

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

اللبأ البقري هو مصدر أساسي للعناصر الغذائية والدعم المناعي للعجل حديثي الولادة. يعد فهم مستوى البروتينات العلاجية (اللاكتوفيرين و IgG) أمرا مهما لجرعات اللبأ البقري وتوحيد الاستهلاك البشري.

Abstract

اللبأ هو سائل بيولوجي معقد تنتجه الثدييات مباشرة بعد الولادة. يلبي جميع المتطلبات الغذائية لحديثي الولادة كمصدر جيد للمغذيات الكبيرة والصغرى والببتيدات النشطة بيولوجيا وعوامل النمو. اللبأ البقري هو أيضا مصدر محتمل للتغذية والنشط بيولوجيا بسبب محتواه الغني من البروتين الذي يحتوي على الغلوبولين المناعي G (IgG) واللاكتوفيرين. ومع ذلك ، فإن مستوى اللاكتوفيرين و IgG في اللبأ البقري يتغير بشكل ملحوظ خلال فترة الرضاعة. لذلك ، فإن مراقبة تركيز IgG واللاكتوفيرين لاستخدام اللبأ البقري كمصدر للبروتين هو سؤال مهم يجب دراسته تصف الطرق الواردة في هذه المقالة كيفية تحديد محتوى البروتين ، بالإضافة إلى تركيزات محددة من اللاكتوفيرين و IgG. تتضمن هذه الطرق الخطوات التالية: عزل بروتينات اللبأ البقري ، وتحديد تركيز البروتين عن طريق مقايسة حمض البيسنكونينيك (BCA) ، وتصور البروتينات عبر SDS-PAGE ، وتحديد اللاكتوفيرين ، وتركيز IgG باستخدام اختبار ELISA.

Introduction

اللبأ هو الإفراز الأولي للغدة الثديية التي تنتجها الثدييات بعد فترة وجيزة من الولادة. اللبأ غني بالمغذيات الكبيرة والصغرى والببتيدات المضادة للميكروبات وعوامل النمو¹^،²^،³^،⁴. تختلف التركيبة تدريجيا بمرور الوقت من خلال الانتقال إلى الحليب الناضج⁵^،⁶^،⁷ ولكن الأهم في غضون 24 ساعة بعد الولادة⁸. يتأثر تكوين اللبأ أيضا بعوامل الأم ، بما في ذلك العمر والتكافؤ والسلالة والصحة والحالة الغذائية ، بالإضافة إلى العوامل الخارجية ، بما في ذلك الموسم ، والولادة المبكرة ، والرضاعة المبكرة ، وعوامل المناولة القولونية (تجميع اللبأ ودرجة حرارة التخزين) ، وتحريض الولادة⁹ ^، ¹⁰ ^، ¹¹. بالمقارنة مع الحليب الناضج ، يحتوي اللبأ على كمية أقل من اللاكتوز والمزيد من الدهون والبروتين والببتيدات والنيتروجين غير البروتيني والرماد والهرمونات وعوامل النمو والسيتوكينات والنيوكليوتيدات والفيتامينات والمعادن¹². يحتوي اللبأ البقري على مجموعة واسعة من البروتينات ، بما في ذلك الغلوبولين المناعي ، واللاكتوفيرين ، و α-لاكتالبومين (α-LA) ، و β-lactoglobulin (β-Lg) ، و lactoperoxidase ، والعديد من عوامل النمو¹³. يتراوح إجمالي تركيز البروتين في اللبأ البقري بين 11.26 مجم / مل و 169.55 مجم / مل¹⁴. يتكون محتوى البروتين من مصل اللبن والكازين بمتوسط تركيز 124.00 مجم / مل و 26.00 مجم / مل ، على التوالي¹⁵. يحتوي جزء مصل اللبن على ثلاثة أنواع رئيسية من الغلوبولين المناعي (Igs) مثل IgG (85٪ -90٪) و IgM (7٪) و IgA (5٪) ¹⁶. Ig الرئيسي في اللبأ البقري هو IgG ، والذي يوفر مناعة سلبية وينظم أجهزة المناعة التكيفية والفطرية في العجل¹⁷. يمكن أن يتراوح تركيز Ig الأولي لأول لبأ بقري حلب من 20 إلى 200 مجم / مل وينخفض إلى حوالي 0.4-1.0 مجم / مل¹⁸. يبلغ متوسط تركيز IgG حوالي 60 مجم / مل وينخفض بشكل مطرد إلى المستويات التي تقل عن 1 مجم / مل طوال فترة الانتقال إلى الحليب الناضج¹⁹.

بروتين حيوي مهم آخر في اللبأ هو اللاكتوفيرين ، وهو بروتين سكري مرتبط بالحديد بتركيز 1.5-5 مجم / مل. تشمل خصائص اللاكتوفيرين تعزيز امتصاص الحديد بالإضافة إلى امتلاك نشاط مضاد للميكروبات²⁰^،²¹ ، وعديدات السكاريد الدهنية الملزمة ، وتعديل المناعة ، وتحفيز نمو الخلايا الظهارية المعوية والخلايا الليفية²². يحتوي اللبأ البقري أيضا على α-لاكتالبومين و β-لاكتوغلوبولين. هذه البروتينات هي مصادر للأحماض الأمينية الأساسية ولها أيضا نشاط مبيد للجراثيم²³^،²⁴^،²⁵. متوسط تركيزات α-LA و β-LG في اللبأ 2.77 مجم / مل² ، و 11.5 مجم / مل²⁶ ، على التوالي. بعد ذلك ، تنخفض هذه التركيزات إلى 1-1.5 مجم / مل²⁷ ، و 4.8 مجم / مل²⁶ في الحليب الناضج. يحتوي اللبأ أيضا على كمية كبيرة من اللاكتوبيروكسيداز (متوسط 22.8 ميكروغرام / مل) والليزوزيم (متوسط 0.40 ميكروغرام / مل)²⁶. Lactoperoxidase هو بروتين سكري يمتلك نشاطا مضادا للميكروبات ضد البكتيريا موجبة الجرام والسالبة²⁸ عن طريق إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية. يعمل الليزوزيم كعامل مضاد للميكروبات عن طريق شق مكون الببتيدوغليكان لجدران الخلايا البكتيرية ، مما يؤدي إلى موت الخلايا²⁹^،³⁰.

نظرا لخصائصها ، تتم معالجة IgG واللاكتوفيرين في منتجات غذائية مختلفة لتقوية تركيبات الأطفال والمكملات الغذائية والمستحضرات الغنية بالبروتين للنقاهة والرياضيين وكذلك في علم الأدوية والتجميل³¹^،³²^،³³. يمثل اللبأ البقري مصدرا مهما ل IgG واللاكتوفيرين. ومع ذلك ، فإن تكوين هذه البروتينات النشطة بيولوجيا في اللبأ البقري يتغير بشكل ملحوظ خلال فترة الرضاعة. لذلك ، فإن مراقبة التغيرات في تركيز هذه البروتينات النشطة بيولوجيا في عينات اللبأ المستخدمة في البحث وتجهيز الأغذية أمر بالغ الأهمية. تهدف هذه الدراسة إلى وصف طرق مراقبة تركيز وتركيبات البروتين الكلي واللاكتوفيرين و IgG في اللبأ البقري خلال 6 أيام بعد الولادة.

Protocol

تم جمع عينات اللبأ لمدة 6 أيام بعد الولادة في الظهيرة خلال الفترة من يوليو إلى أغسطس ، من 28 بقرة حلوب هولشتاين من شركة أولوفا لتجارة الحليب في جناق قلعة ، تركيا ، وتم تجميدها بعمق. تم تجميع العينات التي تم جمعها في نفس اليوم وفقا ليوم كل عينة وتحليلها من أجل تركيزات البروتين واللاكتوفيرين وIgG. تم فحص جميع العينات في نسختين.

1. تحضير العينة

امزج 200 ميكرولتر من اللبأ البقري مع 400 ميكرولتر من dH₂O للحصول على عينة مخففة للتحليل. تمييع جميع العينات وفقا لذلك.
عينات من أجهزة الطرد المركزي المخففة وغير المخففة عند 4 درجات مئوية ، 1000 × جم لمدة 30 دقيقة.
افصل المرحلة الوسطى عن أنبوب جديد مسمى بشكل مناسب. كرر الخطوة 1.2. للحصول على مرحلة متوسطة واضحة. قم بتخزين المرحلة الوسطى بأكملها والعينات المخففة عند -20 درجة مئوية ، إذا لم يتم استخدامها على الفور.
استخدم المرحلة الوسطى التي تم الحصول عليها من العينات المخففة لمقايسات BCA و SDS-PAGE و Lactoferrin. جمع المرحلة الوسطى من العينات غير المخففة لمقايسة IgG.
قم بإعداد تخفيفات العينة لكل عينة للتأكد من أن القراءات ضمن نطاق المنحنى القياسي. قم بتخفيف كل مرحلة متوسطة تم الحصول عليها من العينات المخففة إلى 1: 300 لمقايسة BCA ، و 1: 30،000 لمقايسة اللاكتوفيرين ، وتخفيف كل مرحلة متوسطة تم الحصول عليها من العينات غير المخففة إلى 1: 400،000 لمقايسة IgG.
ملاحظة: يتم تحديد عوامل التخفيف بناء على قيمة الامتصاص والمنحنى القياسي.

2. تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA

إعداد المعايير والكواشف
1. استخدم الكواشف المتوفرة في المجموعة المتوفرة تجاريا (انظر جدول المواد) لاستخدامها في الفحص: كاشف BCA A ، الذي يحتوي على كربونات الصوديوم ، وبيكربونات الصوديوم ، وحمض البيسنجونينيك ، وطرطرات الصوديوم في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم. يحتوي كاشف BCA B على 4٪ كبريتات نحاسية. يحتوي الألبومين (BSA) على ألبومين مصل الأبقار بمعدل 2.0 مجم / مل في محلول ملحي 0.9٪ و 0.05٪ أزيد الصوديوم.
2. موازنة جميع العينات ومعايير البروتين مع درجة حرارة الغرفة (RT).
3. قم بإعداد كميات كافية من كاشف العمل (WR) عن طريق خلط نسبة 50: 1 من الكاشف A: B. مطلوب 200 ميكرولتر من WR لكل عينة ومعيار.
4. إعداد معايير الألبومين المخفف (BSA) وفقا لمخطط التخفيف التالي (الجدول 1) ، والذي يقدم نطاق عمل يتراوح بين 20-2,000 ميكروغرام / مل تركيز BSA النهائي. استخدم dH₂O كمخفف.

الجدول 1: مخطط التخفيف لمعايير BSA.

قارورة	حجم المخفف (ميكرولتر)	حجم ومصدر BSA (ميكرولتر)	تركيز BSA النهائي (ميكروغرام / مل)
A	0	300 ميكرولتر من المخزون	2000
B	125	375 ميكرولتر من المخزون	1500
C	325	325 ميكرولتر من المخزون	1000
D	175	175 من قارورة B المخففة	750
E	325	325 من القارورة C التخفيف	500
F	325	325 من القارورة التخفيف E	250
G	325	325 من تخفيف قارورة F	125
H	400	100 من تخفيف قارورة G	25
أنا	400	0	0 = فارغة

إجراء فحص BCA
1. انقل 25 ميكرولتر من كل معيار أو عينة BCA إلى صفيحة سعة 96 بئرا. أضف 200 ميكرولتر من WR إلى كل معيار أو عينة تحتوي على بئر. امزج الطبق جيدا على شاكر الطبق لمدة 30 ثانية.
2. قم بتغطية اللوحة بمادة مانعة للتسرب واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اترك التفاعلات تتوازن مع RT لمدة 10 دقائق تقريبا. اقرأ كل لوحة بسرعة 562 نانومتر باستخدام قارئ لوحة دقيقة مع البرنامج المرتبط بها.
توليد منحنى قياسي وتحديد النتائج
1. سجل قيم الامتصاص للمعايير والعينات. يرجى الاطلاع على الجدول 1 لسلسلة التخفيف. اطرح قيم امتصاص الفراغ القياسي من كل قيمة امتصاص للمعايير والعينة. متوسط القراءات المكررة لكل معيار وعينة لتقدير إجمالي تركيز البروتين.
2. قم ببناء منحنى قياسي عن طريق رسم متوسط الامتصاص المصحح لكل معيار على المحور x والتركيز على المحور y. ارسم منحنى خطيا باستخدام برنامج مناسب قادر على ملاءمة منحنى المعلمات الأربعة.
3. استخدم المنحنى القياسي لتحديد تركيز كل عينة عن طريق استيفاء استجابتها للتركيز. اضرب في عامل التخفيف (الخطوة 1.5) للحصول على التركيز الفعلي للعينة.

3. تصور البروتين باستخدام مقايسة SDS-PAGE

تحضير العينة والحلول
1. تحضير حلول المخزون
  1. تحضير 10٪ (وزن / حجم) SDS ، 1.5 M Tris-HCl درجة الحموضة 8.3 ، 0.5 M Tris-HCl درجة الحموضة 6.8 ، 10٪ (وزن / حجم) محلول بيرسلفات الأمونيوم (APS) (تحضير طازج).
  2. (وزن / حجم) SDS: تزن 1 جم من SDS وأضف 10 مل من dH₂O.
  3. M Tris-HCl درجة الحموضة 8.8: تزن 18.15 جم من Tris وتذوب مع ~ 60 مل من dH₂O. اضبط على الرقم الهيدروجيني 8.8 مع حمض الهيدروكلوريك أضف dH₂O ليصل الحجم إلى 100 مل.
  4. M Tris-HCl درجة الحموضة 6.8: تزن 6.00 جم من Tris وتذوب مع ~ 60 مل من dH₂O. اضبط على درجة الحموضة 6.8 مع حمض الهيدروكلوريك أضف dH₂O ليصل الحجم إلى 100 مل.
  5. APS: يزن 15 مجم من APS وأضف 150 ميكرولتر من dH₂O.
    تنبيه: مادة الأكريلاميد و SDS سامة وضارة. ارتد قفازات واقية واعمل تحت غطاء المحرك.
2. قم بإعداد المخزن المؤقت للعينة عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من β-Mercaptoethanol إلى 950 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة 2x SDS-PAGE.
  تنبيه: β-mercaptoethanol سام إذا تم استنشاقه ارتد قفازات واقية واعمل تحت غطاء المحرك.
3. قم بإعداد المخزن المؤقت للتشغيل عن طريق خلط 100 مل من 10x Tris-glycine SDS Running Buffer مع 900 مل من dH₂O.
4. تحضير محلول التلوين (45٪ dH₂O ، 45٪ ميثانول ، 10٪ حمض الخليك الجليدي ، 2 جم من Coomassie Brilliant Blue R).
5. تحضير محلول إزالة البقع (50٪ dH₂O ، 40٪ ميثانول ، 10٪ حمض الخليك الجليدي).
تحضير الجل
1. قم بإعداد معدات وحدة الرحلان الكهربائي ، بما في ذلك كاسيت الجل وإمدادات الطاقة والأقطاب الكهربائية والكابلات للمقايس. نظف الألواح الزجاجية بالإيثانول وقم بتجميع الساندويتش. تأكد من محاذاة الحواف السفلية للألواح الزجاجية والفواصل بشكل جيد.
2. تحضير خليط الجل المنفصل الذي يحتوي على 3.5 مل من dH₂O ، 2.4 مل من 40٪ أكريلاميد / ميثيلين مكرر أكريلاميد ، 2 مل من 1.5M Tris-HCl ، 100 ميكرولتر من 10٪ (وزن / حجم) SDS ، 80 ميكرولتر من 10٪ APS ، 8 ميكرولتر من N ، N ، N ′ ، N ′ - رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED).
  تنبيه: TEMED سام و / أو مهيج. ارتد قفازات واقية واعمل تحت غطاء المحرك.
3. صب خليط الجل المنفصل في ألواح الجل إلى مستوى حوالي 1-1.5 سم تحت الجزء العلوي من اللوحة الأقصر.
4. ضع طبقة من الجزء العلوي من الجل المنفصل بالأيزوبروبانول لإزالة الفقاعات الموجودة في الجزء العلوي من الجل ومنع الجل المبلمر من الجفاف.
5. صب الأيزوبروبانول فوق الجل المنفصل بعد بلمرة الجل المنفصل لمدة 15 دقيقة على الأقل.
6. تحضير خليط هلام التكديس الذي يحتوي على 1.92 مل من الديساهرتز₂O ، و 300 ميكرولتر من 40٪ أكريلاميد / الميثيلين مكرر أكريلاميد ، و 750 ميكرولتر من 0.5M Tris-HCl ، و 100 ميكرولتر من 10٪ (وزن / حجم) SDS ، و 30 ميكرولتر من 10٪ APS ، و 3 ميكرولتر من TEMED.
7. صب محلول جل التكديس فوق الجل المنفصل بحيث تمتلئ ألواح الجل. أدخل المشط في الجزء العلوي من الفواصل.
8. دع جل التكديس يتبلمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة تقريبا.
تشغيل الجل
1. اربط الجل بمجموعة القطب. أضف 1x Tris-glycine SDS Running Buffer المحضر حديثا إلى كلتا حجرتي الجهاز.
2. قم بإزالة المشط.
3. قم بتحميل 5 ميكرولتر من السلم (10-250 كيلو دالتون) و 8 ميكرولتر من المرحلة الوسطى من العينات المخففة في آبار الجل. قم بتشغيل الجل على حرارة 80 فولت حتى تنتقل الصبغة إلى الجل الفاصل وزدها إلى 120 فولت حتى تصل الصبغة إلى قاع الجل. قم بإيقاف تشغيل الطاقة المطبقة بعد وصول الصبغة إلى قاع الجل.
تلطيخ الجل وإزالة البقع
1. قم بإزالة الجل من الجهاز بمجرد اكتمال التشغيل وقم بإزالة الفواصل والألواح الزجاجية. ضع الجل في صينية صغيرة.
2. قم بتلطيخ الجل بإضافة محلول تلطيخ (الخطوة 3.1.4) لمدة 30 دقيقة مع رج لطيف عند 55 دورة في الدقيقة.
3. اسكب محلول التلوين من الجل. اشطف الجل بكمية قليلة من محلول إزالة البقع وتخلص من الصبغة.
4. أضف حجما كافيا من محلول إزالة البقع لتغطية الجل وقم بإزالة البقع مع الرج اللطيف لمدة ~ 1 ساعة حتى تظهر العصابات.

4. تركيز اللاكتوفيرين باستخدام لاكتوفيرين البقر ELISA

إعداد المعايير والكواشف
1. استخدم مجموعة Bovine LF / LTF / Lactoferrin ELISA المتوفرة تجاريا لهذا الفحص.
2. موازنة جميع العينات والمعايير مع RT.
3. قم بإعداد كميات كافية من كاشف الكشف A و B محلول العمل المسؤول عن الارتباط بالمستضد الذي تم التقاطه.
4. قم بتخفيف كواشف الكشف A و B إلى نسبة 1: 100 باستخدام مخففات الفحص A و B ، على التوالي.
5. قم بإعداد مخزن مؤقت للغسيل 1x عن طريق تخفيف تركيز مخزن الغسيل 30x مع dH₂O.
6. ضع كمية كافية من محلول الركيزة 3،3 ′ ، 5،5 ′-Tetramethylbenzidine (TMB) في أنبوب دقيق معقم.
7. أعد تعليق أنبوب واحد من المعيار المجفف بالتجميد (100 نانوغرام / مل) مع 0.5 مل من مخفف العينة واحتضانه في RT لمدة 10 دقائق مع تحريض لطيف. قم بتدوير القارورة للتأكد من جمع كل السانبل المجفف بالتجميد في الأسفل.
8. قم بإعداد سلسلة تخفيف قياسية وفقا لمخطط التخفيف التالي (الجدول 2).

الجدول 2: مخطط التخفيف لمعايير اللاكتوفيرين البقري.

قارورة	حجم المخفف (ميكرولتر)	حجم ومصدر Lf (ميكرولتر)	تركيز Lf النهائي (نانوغرام / مل)
د1	0	500 ميكرولتر من المخزون	100
د2	250	250 من القارورة D1 التخفيف	50
د3	250	250 من القارورة D2 التخفيف	25
د4	250	250 من القارورة D3 التخفيف	12.5
د5	250	250 من تخفيف قارورة D4	6.25
د6	250	250 من القارورة D5 التخفيف	3,125
د7	250	250 من تخفيف قارورة D6	1,563
د8	250	0	0 = فارغة

قياس تركيز لاكتوفيرين البقري
1. ماصة 100 ميكرولتر من كل معيار لاكتوفيرين قياسي أو عينة في صفيحة الشريط المطلية المكونة من 96 بئر. قم بتغطية اللوحة بمادة مانعة للتسرب لتجنب التبخر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
2. استنشق سائل كل بئر. أضف 100 ميكرولتر من كاشف الكشف محلول عملي لكل بئر. قم بتغطيتها بمادة مانعة للتسرب وحركها برفق لضمان الخلط الشامل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
3. اغسل ثلاث مرات بإضافة ما يقرب من 350 ميكرولتر من محلول غسيل 1x بعد شفط السائل من كل بئر. اترك كل غسلة لمدة 1-2 دقيقة قبل الشفط الكامل. بعد الغسيل الأخير ، استنشق لإزالة أي مخزن مؤقت متبقي للغسيل ، ثم اقلب اللوحة واضغط على ورق ماص نظيف.
4. أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل كاشف الكشف B إلى كل بئر. غطيها بمادة مانعة للتسرب جديدة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بشفط السائل من كل بئر واغسله خمس مرات كما هو موضح في الخطوة 4.2.3. ضع 90 ميكرولتر من محلول الركيزة TMB في كل بئر ، وقم بتغطيته بمادة مانعة للتسرب جديدة.
5. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة بعيدا عن الضوء. تحقق من اللون الأمثل من خلال المراقبة بشكل دوري. لاحظ أن اللون الأزرق الكثيف في البئر يحتوي على اللاكتوفيرين عالي التركيز.
6. أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف لكل بئر. سيتغير اللون من الأزرق إلى الأصفر. قم بقياس امتصاص كل بئر على الفور عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة مع البرنامج المرتبط به.
  ملاحظة: اضغط على اللوحة برفق لضمان الخلط الشامل حتى يصبح تغيير اللون موحدا.
توليد منحنى قياسي وتحديد النتائج
1. اتبع الخطوة 2.3.1 لتوليد البيانات لتقدير تركيز اللاكتوفيرين.
2. قم ببناء منحنى قياسي عن طريق رسم متوسط الامتصاص المصحح لكل معيار كما هو موضح في الخطوة 2.3.2 مع رسم منحنى متعدد الحدود باستخدام برنامج مناسب قادر على ملاءمة منحنى المعلمات الأربعة.
3. احسب محتوى اللاكتوفيرين لكل عينة عن طريق استيفاء قيمة الامتصاص على المعادلة التي تم إنشاؤها كما هو موضح في الخطوة 2.3.3.

5. تحديد تركيز IgG للعينات باستخدام IgG ELISA البقري

إعداد المعايير والكواشف
1. استخدم العناصر المطلوبة من العناصر المتوفرة في مجموعة IgG ELISA البقرية.
2. موازنة جميع العينات والمعايير مع RT.
3. قم بإعداد كميات كافية من محلول إنزيم الأجسام المضادة العامل عن طريق تخفيف 10 ميكرولتر من بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) - مركز أفيدين (100x) مع 990 ميكرولتر من المخفف المترافق بالإنزيم والأجسام المضادة.
4. قم بإعداد كميات كافية من 1x المخزن المؤقت للغسيل عن طريق تخفيف تركيز عازلة الغسيل 20x مع dH₂O.
5. قم بإعداد كميات كافية من المحلول المخفف 1x عن طريق تخفيف تركيز المخفف 20x مع dH₂O.
6. أضف 1.0 مل من dH₂O إلى معاير IgG البقري واخلطه برفق حتى يذوب. التركيز النهائي للمعاير هو 123.000 نانوغرام / مل.
7. قم بإعداد سلسلة التخفيف القياسية وفقا لمخطط التخفيف الموضح في الجدول 3.

الجدول 3: مخطط التخفيف لمعايير IgG البقرية.

قارورة	حجم المخفف (ميكرولتر)	حجم ومصدر IgG (ميكرولتر)	تركيز IgG النهائي (نانوغرام / مل)
د1	900	100 ميكرولتر من المخزون	12300
د2	900	100 من القارورة D1 التخفيف	1230
د3	178	122 من تخفيف قارورة D2	500
د4	150	50 من القارورة D3 التخفيف	250
د5	150	150 من تخفيف قارورة D4	125
د6	100	100 من القارورة D5 التخفيف	62.5
د7	100	100 من القارورة D6 التخفيف	31.25
د8	100	100 من تخفيف قارورة D7	15,625
د9	100	100 من القارورة D8 التخفيف	7,813
د10	100	0	0 = فارغة

إجراء فحص IgG ELISA البقري
1. ماصة 100 ميكرولتر من كل معيار IgG أو عينة في لوحة الشريط المطلية المكونة من 96 بئر. قم بتغطية اللوحة بمادة مانعة للتسرب واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة. استنشق السائل من كل بئر.
2. اغسل أربع مرات عن طريق ملء الآبار بمخزن مؤقت غسيل 1x والشفاط. بعد الغسيل الأخير ، قم بالشفيق لإزالة أي مخزن مؤقت للغسيل المتبقي ، ثم اقلب اللوحة واضغط على ورق ماص نظيف. أضف 100 ميكرولتر من اقتران الإنزيم والأجسام المضادة المخفف بشكل مناسب لكل بئر. قم بتغطيتها بمادة مانعة للتسرب وحركها برفق لضمان الخلط الشامل.
3. احتضن في RT لمدة 10 دقائق. اغسل وقم بإزالة عازلة الغسيل المتبقية من الآبار كما هو موضح في الخطوة 5.2.2. أضف 100 ميكرولتر من ركيزة TMB إلى كل بئر ؛ قم بتغطيتها بمادة مانعة للتسرب جديدة.
4. احتضن في RT لمدة 10 دقائق بالضبط بعيدا عن الضوء. أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من محلول التوقف لكل بئر. اقرأ كل لوحة عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الألواح الدقيقة مع البرنامج المرتبط بها.
توليد منحنى قياسي وتحديد النتائج
1. اتبع الخطوة 2.3.1 لإصدار البيانات لتقدير تركيز IgG.
2. قم ببناء منحنى قياسي عن طريق رسم التركيز على المحور x ومتوسط الامتصاص المصحح لكل معيار على المحور y. ارسم منحنى متعدد الحدود باستخدام برنامج مناسب قادر على ملاءمة المنحنى المكون من أربع معلمات.
3. احسب محتوى IgG لكل عينة عن طريق استيفاء قيمة الامتصاص على المعادلة التي تم إنشاؤها كما هو موضح في الخطوة 2.3.3.

النتائج

باتباع البروتوكول ، تم تحليل عينات اللبأ البقري لتحديد تركيز البروتين واللاكتوفيرين و IgG. تظهر نتائج تحليلات البروتين واللاكتوفيرين و IgG لبأ البقر في الجدول 4.

الجدول 4: تركيز البروتين واللاكتوفيرين و IgG من اللبأ البقري.<...

Discussion

توفر هذه الدراسة معلومات حول التغيرات الكبيرة في تركيزات البروتين واللاكتوفيرين و IgG في اللبأ طوال فترة الانتقال إلى الحليب الناضج. تم الكشف عن التغيرات في تركيز اللاكتوفيرين و IgG بواسطة شطيرة ELISA ، وتم تحليل تركيز البروتين الكلي بواسطة مقايسة BCA. تشير النتائج إلى أن اللب...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

هذه الدراسة مدعومة من قبل شركة Uluova Süt Ticaret A.Ş (شركة Uluova لتجارة الألبان). RMD و BMH موظفان في Evolve BioSystems ، وهي شركة تركز على استعادة ميكروبيوم الرضع.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Running Buffer (Tris-Glycine-SDS)	ClearBand	TGS10	SDS-Page analysis
2-mercaptoethanol	gibco	31350-010	SDS-Page analysis
Acetic Acid GLACIAL	Isolab	901,013,2500	SDS-Page analysis
Bovine IgG ELISA Kit	Aviva Systems Biology	OKIA00005	Determination of IgG concentration
Bovine LF / LTF / Lactoferrin ELISA Kit	LSBio Lifespan Biosciences	LS-F4884	Determinaton of lactoferrin concentration
Coomassie Brillant Blue R 250	amresco	0472-25G	SDS-Page analysis
Hydrochloric Acid Fuming 37%	Isolab	932,103,2501	SDS-Page analysis
Isopropanol	Isolab	961,023,2500	SDS-Page analysis
Laemmli Sample Buffer (2X)	ClearBand	LSB-2x	SDS-Page analysis
Methanol	Isolab	947,046,2500	SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder 10 to 250	Thermo Scientific	26619	SDS-Page analysis
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Determination of protein concentration
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	BioShop	SDS001.500	SDS-Page analysis
SureCast Acrylamide Solution 40% (w/v)	Invitrogen	HC2040	SDS-Page analysis
SureCast Ammonium persulfate (APS)	Thermo Scientific	17874	SDS-Page analysis
SureCast Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Invitrogen	HC2006	SDS-Page analysis
TECAN Infinite M200 Plate Reader	Tecan	30035094	Measurement of absorbance
Tris base	BioShop	TRS001.1	SDS-Page analysis

References

Kehoe, S. I., Jayarao, B. M., Heinrichs, A. J. A survey of bovine colostrum composition and colostrum management practices on Pennsylvania dairy farms. Journal of Dairy Science. 90 (9), 4108-4116 (2007).
Levieux, D., Ollier, A. Bovine immunoglobulin G, β-lactoglobulin, α-lactalbumin and serum albumin in colostrum and milk during the early post partum period. Journal of Dairy Research. 66 (3), 421-430 (1999).
Elfstrand, L., Lindmark-Månsson, H., Paulsson, M., Nyberg, L., Åkesson, B. Immunoglobulins, growth factors and growth hormone in bovine colostrum and the effects of processing. International Dairy Journal. 12 (11), 879-887 (2002).
Strekozov, N. I., Motova, E. N., Fedorov, Y. N. Evaluation of the chemical composition and immunological properties of colostrum of cows' first milk yield. Russian Agricultural Sciences. 34 (4), 259-260 (2008).
Playford, R. J., Weiser, M. J. Bovine colostrum: Its constituents and uses. Nutrients. 13 (1), 265 (2021).
Godhia, M., Patel, N. Colostrum - Its composition, benefits as a nutraceutical: A review. Current Research in Nutrition and Food Science Journal. 1 (1), 37-47 (2013).
Nakamura, T., et al. Concentrations of sialyloligosaccharides in bovine colostrum and milk during the prepartum and early lactation. Journal of Dairy Science. 86 (4), 1315-1320 (2003).
Arain, H. H., Khaskheli, M., Arain, M. A., Soomro, A. H., Nizamani, A. H. Heat stability and quality characteristics of postpartum buffalo milk. Pakistan Journal of Nutrition. 7 (2), 303-307 (2008).
Maunsell, F. P., et al. Effects of mastitis on the volume and composition of colostrum produced by Holstein cows. Journal of Dairy Science. 81 (5), 1291-1299 (1998).
Tittle, D. J. Factors affecting colostrum quality. Cattle Practice. 10 (2), 131-136 (2002).
Zarcula, S., et al. Influence of breed, parity and food intake on chemical composition of first colostrum in cow. Animal Science and Biotechnology. 43 (1), 43 (2010).
McGrath, B. A., Fox, P. F., McSweeney, P. L. H., Kelly, A. L. Composition and properties of bovine colostrum: a review. Dairy Science and Technology. 96 (2), 133-158 (2016).
Bastian, S. E. P., Dunbar, A. J., Priebe, I. K., Owens, P. C., Goddard, C. Measurement of betacellulin levels in bovine serum, colostrum and milk. Journal of Endocrinology. 168 (1), 203-212 (2001).
Zhang, L., et al. Bovine milk proteome in the first 9 days: Protein interactions in maturation of the immune and digestive system of the newborn. PloS One. 10 (2), 0116710 (2015).
Godden, S. Colostrum management for dairy calves. The Veterinary clinics of North America. Food Animal Practice. 24 (1), 19-39 (2008).
Larson, B. L., Heary, H. L., Devery, J. E. Immunoglobulin production and transport by the mammary gland. Journal of Dairy Science. 63 (4), 665-671 (1980).
Ulfman, L. H., Leusen, J. H. W., Savelkoul, H. F. J., Warner, J. O., van Neerven, R. J. J. Effects of bovine immunoglobulins on immune function, allergy, and infection. Frontiers in Nutrition. 5, 52 (2018).
El-Loly, M. M. Bovine milk immunoglobulins in relation to human health. International Journal of Dairy Science. 2 (3), 183-195 (2007).
Korhonen, H., Marnila, P., Gill, H. S. Milk immunoglobulins and complement factors. British Journal of Nutrition. 84 (1), 75-80 (2000).
Arnold, R. R., Brewer, M., Gauthier, J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin: Sensitivity of a variety of microorganisms. Infection and Immunity. 28 (3), 893-898 (1980).
Aisen, P., Listowsky, I. Iron transport and storage proteins. Annual Review of Biochemistry. 49 (1), 357-393 (1980).
Zhao, X., et al. The in vitro protective role of bovine lactoferrin on intestinal epithelial barrier. Molecules. 24 (1), 148 (2019).
Chatterton, D. E. W., Smithers, G., Roupas, P., Brodkorb, A. Bioactivity of β-lactoglobulin and α-lactalbumin-Technological implications for processing. International Dairy Journal. 16 (11), 1229-1240 (2006).
Pellegrini, A., Dettling, C., Thomas, U., Hunziker, P. Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1526 (2), 131-140 (2001).
Brück, W. M., et al. rRNA probes used to quantify the effects of glycomacropeptide and α-lactalbumin supplementation on the predominant groups of intestinal bacteria of infant rhesus monkeys challenged with enteropathogenic Escherichia coli. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 37 (3), 273-280 (2003).
Indyk, H. E., Hart, S., Meerkerk, T., Gill, B. D., Woollard, D. C. The β-lactoglobulin content of bovine milk: Development and application of a biosensor immunoassay. International Dairy Journal. 73, 68-73 (2017).
Swaisgood, H. E. Protein and amino acid composition of bovine milk. Handbook of Milk Composition. , 464-468 (1995).
Seifu, E., Buys, E. M., Donkin, E. F. Significance of the lactoperoxidase system in the dairy industry and its potential applications: A review. Trends in Food Science and Technology. 16 (4), 137-154 (2005).
Wheeler, T. T., Hodgkinson, A. J., Prosser, C. G., Davis, S. R. Immune components of colostrum and milk-A historical perspective. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 12 (4), 237-247 (2007).
Clare, D., Catignani, G., Swaisgood, H. Biodefense properties of milk: The role of antimicrobial proteins and peptides. Current Pharmaceutical Design. 9 (16), 1239-1255 (2003).
Mehra, R., Marnila, P., Korhonen, H. Milk immunoglobulins for health promotion. International Dairy Journal. 16 (11), 1262-1271 (2006).
Gapper, L. W., Copestake, D. E. J., Otter, D. E., Indyk, H. E. Analysis of bovine immunoglobulin G in milk, colostrum and dietary supplements: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (1), 93-109 (2007).
Mettler, A. E. Utilization of whey by-products for infant feeding. International Journal of Dairy Technology. 33 (2), 67-72 (1980).
Zenker, H. E., Raupbach, J., Boeren, S., Wichers, H. J., Hettinga, K. A. The effect of low vs. high temperature dry heating on solubility and digestibility of cow's milk protein. Food Hydrocolloids. 109, 106098 (2020).
Costa, F. F., et al. Microfluidic chip electrophoresis investigation of major milk proteins: Study of buffer effects and quantitative approaching. Analytical Methods. 6 (6), 1666-1673 (2014).
Lönnerdal, B., Du, X., Jiang, R. Biological activities of commercial bovine lactoferrin sources. Biochemistry and Cell Biology. 99 (1), 35-46 (2021).
Belanger, L., Sylvestre, C., Dufour, D. Enzyme-linked immunoassay for alpha-fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta. 48 (1), 15-18 (1973).
Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
Engvall, E. The ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay. Clinical Chemistry. 56 (2), 319-320 (2010).
Kohl, T. O., Ascoli, C. A. Immunometric double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (6), (2017).
Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77 (7), 98-101 (2016).
Abd El-Fattah, A. M., Abd Rabo, F. H. R., EL-Dieb, S. M., El-Kashef, H. A. Changes in composition of colostrum of Egyptian buffaloes and Holstein cows. BMC Veterinary Research. 8 (1), 19 (2012).
Newby, T. J., Stokes, C. R., Bourne, F. J. Immunological activities of milk. Veterinary Immunology and Immunopathology. 3 (1-2), 67-94 (1982).
Chigerwe, M., et al. Comparison of four methods to assess colostral IgG concentration in dairy cows. Journal of the American Veterinary Medical Association. 233 (5), 761-766 (2008).
Foley, J. A., Otterby, D. E. Availability, storage, treatment, composition, and feeding value of surplus colostrum: A review. Journal of Dairy Science. 61 (8), 1033-1060 (1978).
Mechor, G. D., Gröhn, Y. T., McDowell, L. R., Van Saun, R. J. Specific gravity of bovine colostrum immunoglobulins as affected by temperature and colostrum components. Journal of Dairy Science. 75 (11), 3131-3135 (1992).
Pritchett, L. C., Gay, C. C., Besser, T. E., Hancock, D. D. Management and production factors influencing immunoglobulin G1 concentration in colostrum from Holstein cows. Journal of Dairy Science. 74 (7), 2336-2341 (1991).
Quigley, J. D., Martin, K. R., Dowlen, H. H. Concentrations of trypsin inhibitor and immunoglobulins in colostrum of Jersey cows. Journal of Dairy Science. 78 (7), 1573-1577 (1995).
Bielmann, V., et al. An evaluation of Brix refractometry instruments for measurement of colostrum quality in dairy cattle. Journal of Dairy Science. 93 (8), 3713-3721 (2010).
A Ayar, A., Sıçramaz, H., Çetin, I. The effect of bovine colostrum on the lactic flora of yogurt and kefir. JSM Biotechnology and Biomedical Engineering. 3, 3-8 (2016).
Sobaih, A., Zaki, D. A. Production of novel functional yoghurt fortified with bovine colostrum and date syrup for children. Alexandria Science Exchange Journal. 39, 651-662 (2018).
Saalfeld, M. H., et al. Colostro: a redescoberta de um alimento saudável, nutritivo e com potencial probiótico. Agroecologia e Desenvolvimento Rural Sustentável. 5 (2), 18-24 (2012).
Mouton, E., Aryana, K. J. Influence of colostrum on the characteristics of ice cream. Food and Nutrition Sciences. 06 (05), 480-484 (2015).
Nazir, T., Pal, M. A., Manzoor, A. Effect of admixing varying levels of whole milk to the colostrum on the sensory quality of fermented colostrum product. International Journal of Advanced Research in Science, Engineering and Technology. 7 (4), 156-161 (2018).
Korhonen, H. J. Bioactive milk proteins, peptides and lipids and other functional components derived from milk and bovine colostrum. Functional Foods. , 471-511 (2011).
Cortés-Ríos, J., et al. Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times. Analytical Biochemistry. 608, 113904 (2020).
Johnson, M. Protein quantitation. Materials and Methods. 2, 115 (2012).
Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).
Wang, R., et al. Sensitive immunoassays based on specific monoclonal IgG for determination of bovine lactoferrin in cow milk samples. Food Chemistry. 338, 127820 (2021).
Kazemi, M. G., Feizy, J. Overview of the important of ELISA technique and application in food industry. Analyzing Microbes. 4 (4), 19-25 (2020).
Verma, J., Saxena, S., Babu, S. G. ELISA-based identification and detection of microbes. Analyzing Microbes. , 169-186 (2013).
Minic, R., Zivkovic, I. Optimization, validation and standardization of ELISA. Norovirus. , (2020).
Drijvers, J. M., Awan, I. M., Perugino, C. A., Rosenberg, I. M., Pillai, S. The enzyme-linked immunosorbent assay. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 119-133 (2017).
Walker, A. Breast milk as the gold standard for protective nutrients. The Journal of Pediatrics. 156 (2), 3-7 (2010).
Patel, K., Rana, R. Pedimune in recurrent respiratory infection and diarrhoea-The Indian experience-The PRIDE study. The Indian Journal of Pediatrics. 73 (7), 585-591 (2006).
Saad, K., et al. Effects of bovine colostrum on recurrent respiratory tract infections and diarrhea in children. Medicine. 95 (37), 4560 (2016).
Buckley, J. D., Brinkworth, G. D., Abbott, M. J. Effect of bovine colostrum on anaerobic exercise performance and plasma insulin-like growth factor I. Journal of Sports Sciences. 21 (7), 577-588 (2003).
Kotsis, Y., et al. A low-dose, 6-week bovine colostrum supplementation maintains performance and attenuates inflammatory indices following a Loughborough Intermittent Shuttle Test in soccer players. European Journal of Nutrition. 57 (3), 1181-1195 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

G IgG SDS PAGE ELISA ASSAY

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: