JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

קולוסטרום בקר הוא גם מקור עיקרי לחומרים מזינים וגם תמיכה חיסונית לעגל שזה עתה נולד. הבנת רמת החלבונים הטיפוליים (לקטופרין ו-IgG) חשובה למינון קולוסטרום בקר ולסטנדרטיזציה של מאכל אדם.

Abstract

קולוסטרום הוא נוזל ביולוגי מורכב המיוצר על ידי יונקים מיד לאחר הלידה. הוא עונה על כל הדרישות התזונתיות של יילודים כמקור טוב למאקרו ומיקרו-נוטריינטים, פפטידים ביו-אקטיביים וגורמי גדילה. קולוסטרום בקר הוא גם מקור פוטנציאלי לתזונה וביו-אקטיבי בגלל תכולת החלבון העשירה שלו הכוללת אימונוגלובולין G (IgG) ולקטופרין. עם זאת, רמת הלקטופרין וה-IgG בקולוסטרום בקר משתנה באופן ניכר במהלך תקופת ההנקה. לכן, ניטור ריכוז ה-IgG והלקטופרין לשימוש בקולוסטרום בקר כמקור חלבון הוא שאלה חשובה שיש לחקור. השיטות במאמר זה מתארות כיצד לקבוע את תכולת החלבון, כמו גם ריכוזים ספציפיים של לקטופרין ו-IgG. שיטות אלה כוללות את השלבים הבאים: בידוד חלבוני קולוסטרום בקר, קביעת ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA), הדמיה של חלבונים באמצעות SDS-PAGE, קביעת ריכוז לקטופרין ו-IgG באמצעות בדיקת ELISA.

Introduction

קולוסטרום הוא ההפרשה הראשונית של בלוטת החלב המיוצרת על ידי יונקים זמן קצר לאחר הלידה. קולוסטרום עשיר במאקרו-נוטריינטים ומיקרו-נוטריינטים, פפטידים אנטי-מיקרוביאליים וגורמי גדילה 1,2,3,4. ההרכב משתנה בהדרגה עם הזמן באמצעות המעבר לחלב בוגר 5,6,7 אך באופן משמעותי ביותר תוך 24 שעות לאחר הלידה8. הרכב הקולוסטרום מושפע גם מגורמים אימהיים, כולל גיל, זוגיות, גזע, בריאות ומצב תזונתי, כמו גם מגורמים חיצוניים, כולל עונה, לידה מוקדמת, הנקה מוקדמת, גורמי טיפול בקולוסטרל (איגום קולוסטרום וטמפרטורת אחסון), והשראת לידה 9,10,11. בהשוואה לחלב בוגר, קולוסטרום מכיל פחות לקטוז ויותר שומן, חלבון, פפטידים, חנקן שאינו חלבון, אפר, הורמונים, גורמי גדילה, ציטוקינים, נוקלאוטידים, ויטמינים ומינרלים12. קולוסטרום בקר מכיל מגוון רחב של חלבונים, כולל אימונוגלובולינים, לקטופרין, α-לקטאלבומין (α-LA), β-לקטוגלובולין (β-Lg), לקטופרוקסידאז ומספר גורמי גדילה13. ריכוז החלבון הכולל של קולוסטרום בקר נע בין 11.26 מ"ג/מ"ל ל-169.55 מ"ג/מ"ל14. תכולת החלבון כוללת מי גבינה וקזאין בריכוז ממוצע של 124.00 מ"ג/מ"ל ו-26.00 מ"ג/מ"ל, בהתאמה. החלק של מי גבינה מכיל שלושה סוגים עיקריים של אימונוגלובולינים (Igs) כ-IgG (85%-90%), IgM (7%) ו-IgA (5%)16. ה-Ig העיקרי בקולוסטרום בקר הוא IgG, המספק חסינות פסיבית ומווסת את מערכת החיסון הנרכשת והמולדת בעגל17. ריכוז ה-Ig הראשוני של קולוסטרום בקר החולב הראשון יכול לנוע בין 20 ל-200 מ"ג/מ"ל ולרדת לסביבות 0.4-1.0 מ"ג/מ"ל18. ריכוז ה-IgG הממוצע הוא כ-60 מ"ג/מ"ל ויורד בהתמדה לרמות מתחת ל-1 מ"ג/מ"ל לאורך המעבר לחלב בוגר19.

חלבון ביו-אקטיבי חשוב נוסף בקולוסטרום הוא לקטופרין, גליקופרוטאין קושר ברזל בריכוז של 1.5-5 מ"ג/מ"ל. בין המאפיינים של לקטופרין שיפור ספיגת הברזל וגם פעילות אנטי-בקטריאלית20,21, קשירת ליפופוליסכריד, ויסות מערכת החיסון והמרצת צמיחה של תאי אפיתל ופיברובלסטים במעי22. קולוסטרום בקר מכיל גם α-לקטאלבומין ו-β-לקטוגלובולין. חלבונים אלה הם מקורות לחומצות אמינו חיוניות ויש להם גם פעילות חיידקית 23,24,25. הריכוזים הממוצעים של α-LA ו-β-Lg בקולוסטרום הם בממוצע 2.77 מ"ג/מ"ל2, ו-11.5 מ"ג/מ"ל26, בהתאמה. לאחר מכן, ריכוזים אלה יורדים ל-1-1.5 מ"ג/מ"ל27, ו-4.8 מ"ג/מ"ל26 בחלב בוגר. קולוסטרום מכיל גם כמות משמעותית של לקטופרוקסידאז (ממוצע של 22.8 מק"ג/מ"ל) וליזוזים (ממוצע של 0.40 מק"ג/מ"ל)26. לקטופרוקסידאז הוא גליקופרוטאין בעל פעילות אנטי-מיקרוביאלית כנגד חיידקים גראם-חיוביים ושליליים28 על ידי ייצור מיני חמצן תגובתיים. ליזוזים מתפקד כחומר אנטי-מיקרוביאלי על ידי פיצול מרכיב הפפטידוגליקן של דפנות תאי החיידקים, ובכך מוביל למוות תאי29,30.

בשל תכונותיהם, IgG ולקטופרין מעובדים למוצרי מזון שונים כדי להעשיר פורמולות לתינוקות, תוספי מזון, תכשירים עתירי חלבון למחלימים וספורטאים, כמו גם בפרמקולוגיה וקוסמטיקה 31,32,33. קולוסטרום בקר מהווה מקור חשוב ל-IgG ולקטופרין. עם זאת, הרכב החלבונים הביו-אקטיביים הללו בקולוסטרום בקר משתנה באופן ניכר במהלך תקופת ההנקה. לכן, ניטור שינויים בריכוז החלבונים הביו-אקטיביים הללו בדגימות קולוסטרום המשמשות למחקר ועיבוד מזון הוא קריטי. מחקר זה נועד לתאר את השיטות לניטור הריכוז וההרכבים של החלבון הכולל, לקטופרין ו-IgG בקולוסטרום בקר במהלך 6 הימים שלאחר ההמלטה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

דגימות קולוסטרום נאספו במשך 6 ימים לאחר ההמלטה בצהריים בתקופה יולי-אוגוסט, מ-28 פרות חולבות הולשטיין מחברת סחר החלב Uluova בצ'נקלה, טורקיה, והוקפאו עמוק. הדגימות שנאספו באותו יום אוגדו בהתאם ליום של כל דגימה ונותחו עבור ריכוזי החלבון, הלקטופרין וה-IgG הכוללים שלהן. כל הדגימות נבדקו בכפולות.

1. הכנת מדגם

  1. מערבבים 200 מיקרוליטר של קולוסטרום בקר עם 400 מיקרוליטר של dH2O כדי לקבל דגימה מדוללת לניתוח. מדללים את כל הדגימות בהתאם.
  2. דגימות צנטריפוגה מדוללות ולא מדוללות ב-4 מעלות צלזיוס, 1000 x גרם למשך 30 דקות.
  3. הפרד את השלב האמצעי לצינור חדש המסומן כראוי. חזור על שלב 1.2. כדי להשיג שלב אמצעי ברור. אחסן את כל השלב האמצעי והדגימות המדוללות ב-20 מעלות צלזיוס, אם לא משתמשים בהן מיד.
  4. השתמש בשלב האמצעי שהתקבל מדגימות מדוללות עבור בדיקות BCA, SDS-PAGE ולקטופרין. אסוף את השלב האמצעי מדגימות לא מדוללות לבדיקת IgG.
  5. הכן דילולים לדוגמה עבור כל דגימה כדי להבטיח שהקריאות נמצאות בטווח העקומה הסטנדרטי. יש לדלל כל שלב אמצעי שהתקבל מהדגימות המדוללות ל-1:300 לבדיקת BCA, ול-1:30,000 לבדיקת לקטופרין, ולדלל כל שלב אמצעי המתקבל מדגימות לא מדוללות ל-1:400,000 לבדיקת IgG.
    הערה: גורמי הדילול נקבעים על סמך ערך הספיגה והעקומה הסטנדרטית.

2. קבע את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA

  1. הכנת תקנים וריאגנטים
    1. השתמש בריאגנטים המסופקים בערכה הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) שישמשו לבדיקה: מגיב BCA A, המכיל נתרן פחמתי, נתרן ביקרבונט, חומצה ביצינצ'ונינית ונתרן טרטרט ב-0.1 M נתרן הידרוקסיד. מגיב BCA B מכיל 4% סולפט קופרי. תקני אלבומין (BSA), מכיל אלבומין בסרום בקר ב-2.0 מ"ג/מ"ל ב-0.9% מי מלח ו-0.05% נתרן אזיד.
    2. איזון כל הדגימות ותקני החלבון לטמפרטורת החדר (RT).
    3. הכן כמויות מספיקות של מגיב עבודה (WR) על ידי ערבוב יחס של 50:1 של מגיב A:B. נדרש 200 מיקרוליטר של WR עבור כל דגימה ותקן.
    4. הכן תקני אלבומין מדולל (BSA) על פי תוכנית הדילול הבאה (טבלה 1), המציגה טווח עבודה בין 20-2,000 מיקרוגרם/מ"ל ריכוז BSA סופי. השתמש ב-dH2O כמדלל.

טבלה 1: תוכנית דילול של תקני BSA.

הבקבוקוןנפח מדלל (μL)נפח ומקור BSA (μL)ריכוז BSA סופי (מיקרוגרם/מ"ל)
A0300 מיקרוליטר מלאי2000
B125מלאי של 375 מיקרוליטר1500
C325מלאי של 325 μL1000
D175175 של בקבוקון B דילוטון750
E325325 של דילול בקבוקון C500
F325325 של דילול בקבוקון E250
G325325 של דילול בקבוקון F125
H400100 של דילול בקבוקון G25
אני40000 = ריק
  1. הליך בדיקת BCA
    1. מעבירים 25 מיקרוליטר מכל תקן BCA או דגימה לצלחת של 96 בארות. הוסף 200 מיקרוליטר של ה-WR לכל תקן או דגימה המכילים היטב. מערבבים היטב את הצלחת על שייקר צלחת למשך 30 שניות.
    2. מכסים את הצלחת בסילר צלחות ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, אפשר לתגובות להתאזן ל-RT למשך כ-10 דקות. קרא כל לוחית ב-562 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות עם התוכנה המשויכת אליו.
  2. יצירת עקומה סטנדרטית וקביעת תוצאות
    1. רשום את ערכי הספיגה עבור התקנים והדגימות. אנא ראה טבלה 1 לסדרת הדילול. הפחיתו את ערכי הספיגה של הריק הסטנדרטי מכל ערך ספיגה של תקנים ודגימה. ממוצע את הקריאות הכפולות עבור כל תקן ודגימה כדי להעריך את ריכוז החלבון הכולל.
    2. בנה עקומה סטנדרטית על ידי התוויית הספיגה הממוצעת המתוקנת עבור כל תקן על ציר ה-x והריכוז על ציר ה-y. צייר עקומה ליניארית עם תוכנה מתאימה המסוגלת להתאים את העקומה של ארבעת הפרמטרים.
    3. השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע את הריכוז של כל דגימה על ידי אינטרפולציה של תגובתה לריכוז. הכפל עם גורם הדילול (שלב 1.5) כדי לקבל את הריכוז בפועל של הדגימה.

3. הדמיה של חלבון באמצעות בדיקת SDS-PAGE

  1. הכנת מדגם ופתרונות
    1. הכנת פתרונות מלאי
      1. הכן 10% (w/v) SDS, 1.5 M Tris-HCl pH 8.3, 0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 10% (w/v) אמוניום פרסולפט (APS) תמיסת (הכן טרי).
      2. (עם / נ) SDS: שקלו 1 גרם SDS והוסיפו 10 מ"ל של dH2O.
      3. M Tris-HCl pH 8.8: שוקל 18.15 גרם של Tris ומתמוסס עם ~60 מ"ל של dH2O. התאם ל-pH 8.8 עם HCl. הוסף dH2O כדי להביא את הנפח ל-100 מ"ל.
      4. M Tris-HCl pH 6.8: שוקל 6.00 גרם טריס ומתמוסס עם ~60 מ"ל של dH2O. התאם ל-pH 6.8 עם HCl. הוסף dH2O כדי להביא את הנפח ל-100 מ"ל.
      5. APS: שוקלים 15 מ"ג של APS ומוסיפים 150 מיקרוליטר של dH2O.
        זהירות: אקרילאמיד ו-SDS רעילים ומזיקים. ללבוש כפפות מגן ולעבוד מתחת למכסה המנוע.
    2. הכן את מאגר הדגימה על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של β-Mercaptoethanol ל-950 מיקרוליטר של מאגר דגימה 2x SDS-PAGE.
      אזהרה: β-מרקפטואתנול רעיל בשאיפה. ללבוש כפפות מגן ולעבוד מתחת למכסה המנוע.
    3. הכן את מאגר הריצה על ידי ערבוב של 100 מ"ל של 10x Tris-glycine SDS Running Buffer עם 900 מ"ל של dH2O.
    4. הכן את תמיסת הצביעה (45% dH2O, 45% מתנול, 10% חומצה אצטית קרחונית , 2 גרם Coomassie Brilliant Blue R).
    5. הכן את תמיסת ההימנעות (50% dH2O, 40% מתנול, 10% חומצה אצטית קרחונית
  2. הכנת ג'ל
    1. הכן את ציוד יחידת האלקטרופורזה, כולל קלטת ג'ל, ספקי כוח, אלקטרודות וכבלים לבדיקה. נקו את צלחות הזכוכית באתנול והרכיבו את הכריך. ודא שהקצוות התחתונים של לוחות זכוכית ומרווחים מיושרים היטב.
    2. הכינו את תערובת הג'ל המפרידה המכילה 3.5 מ"ל של dH2O, 2.4 מ"ל של 40% אקרילאמיד/מתילן ביס אקרילאמיד, 2 מ"ל של 1.5M Tris-HCl, 100 מיקרוליטר של 10% (w/v) SDS, 80 מיקרוליטר של 10% APS, 8 מיקרוליטר של N,N′,N′-טטרמתיל אתילנדיאמין (TEMED).
      זהירות: TEMED הוא רעיל ו/או מגרה. ללבוש כפפות מגן ולעבוד מתחת למכסה המנוע.
    3. יוצקים את תערובת הג'ל המפרידה לצלחות הג'ל עד לרמה של כ-1-1.5 ס"מ מתחת לחלק העליון של הצלחת הקצרה יותר.
    4. שכבו את החלק העליון של הג'ל המפריד עם איזופרופנול כדי להסיר בועות בחלק העליון של הג'ל ולמנוע מהג'ל הפולימרי להתייבש.
    5. יוצקים איזופרופנול על גבי הג'ל המפריד לאחר שהג'ל המפריד התפלמר למשך 15 דקות לפחות.
    6. הכן את תערובת ג'ל הערימה המכילה 1.92 מ"ל של dH2O, 300 מיקרוליטר של 40% אקרילאמיד/מתילן ביס אקרילאמיד, 750 מיקרוליטר של 0.5M Tris-HCl, 100 מיקרוליטר של 10% (w/v) SDS, 30 מיקרוליטר של 10% APS ו-3 מיקרוליטר של TEMED.
    7. יוצקים את תמיסת הג'ל הערמה על גבי הג'ל המפריד כך שצלחות הג'ל יתמלאו. הכנס את המסרק לחלק העליון של המרווחים.
    8. הניחו לג'ל הערימה להתפלמר בטמפרטורת החדר למשך כ-15 דקות.
  3. הפעלת הג'ל
    1. חבר את הג'ל למכלול האלקטרודות. הוסף 1x Tris-glycine SDS Running Buffer שהוכן טרי לשני תאי המכשיר.
    2. הסר את המסרק.
    3. טען 5 מיקרוליטר מהסולם (10-250 kDa) ו -8 מיקרוליטר מהשלב האמצעי של דגימות מדוללות לבארות הג'ל. הפעל את הג'ל ב-80 וולט עד שהצבע נודד לג'ל המפריד והגדל ל-120 וולט עד שהצבע מגיע לתחתית הג'ל. כבה את הכוח המופעל לאחר שהצבע מגיע לתחתית הג'ל.
  4. מכתים ומעכבים את הג'ל
    1. הסר את הג'ל מהמנגנון לאחר השלמת הריצה והסר את המרווחים וצלחות הזכוכית. מניחים את הג'ל במגש קטן.
    2. מכתים את הג'ל על ידי הוספת תמיסת מכתים (שלב 3.1.4) למשך 30 דקות עם ניעור עדין ב-55 סל"ד.
    3. שופכים את תמיסת הצביעה מהג'ל. שוטפים את הג'ל בכמות קטנה של תמיסת הימנעות וזורקים את הצבע.
    4. יש להוסיף נפח מספיק של תמיסת עיכוב כדי לכסות את הג'ל ולהימנע בניעור עדין למשך ~1 שעה עד שהרצועות נראות לעין.

4. ריכוז לקטופרין באמצעות לקטופרין בקר ELISA

  1. הכנת תקנים וריאגנטים
    1. השתמש בערכת Bovine LF/LTF/Lactoferrin ELISA הזמינה מסחרית לבדיקה זו.
    2. לאזן את כל הדוגמאות והתקנים ל-RT.
    3. הכן נפחים מספיקים של פתרון עבודה של מגיב זיהוי A ו-B האחראים על קשירה לאנטיגן שנלכד.
    4. לדלל את ריאגנטים לזיהוי A ו-B ליחס של 1:100 באמצעות מדללי בדיקה A ו-B, בהתאמה.
    5. הכן מאגר כביסה עובד 1x על ידי דילול תרכיז מאגר הכביסה פי 30 עם dH2O.
    6. הכניסו כמות מספקת של תמיסת מצע 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) לתוך מיקרו-צינור סטרילי.
    7. השעו שפופרת אחת של תקן ליופיליזציה (100 ננוגרם/מ"ל) עם 0.5 מ"ל של מדלל הדגימה ודגרו ב-RT למשך 10 דקות עם תסיסה עדינה. סובב את הבקבוקון כדי להבטיח שכל הסנפל הליופילי נאסף בתחתית.
    8. הכן סדרת דילול סטנדרטית לפי תוכנית הדילול הבאה (טבלה 2).

טבלה 2: תוכנית דילול של תקני לקטופרין בקר.

הבקבוקוןנפח מדלל (μL)נפח ומקור Lf (μL)ריכוז Lf סופי (ng/mL)
ד10500 מיקרוליטר מלאי100
ד2250250 של דילול בקבוקון D150
ד3250250 של דילול בקבוקון D225
ד4250250 של דילול בקבוקון D312.5
ד5250250 של דילול בקבוקון D46.25
ד6250250 של דילול בקבוקון D53,125
ד7250250 של דילול בקבוקון D61,563
ד825000 = ריק
  1. מדידת ריכוז לקטופרין בקר
    1. פיפטה 100 מיקרוליטר מכל תקן לקטופרין או דגימה לתוך צלחת הרצועה המצופה של 96 בארות. מכסים את הצלחת באיטום צלחת כדי למנוע אידוי. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    2. שאפו את הנוזל של כל באר. הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב הגילוי פתרון עובד לכל באר. מכסים בסילר צלחות ומערבבים בעדינות כדי להבטיח ערבוב יסודי. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    3. שטפו שלוש פעמים על ידי הוספת כ-350 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1x לאחר שאיבת הנוזל מכל באר. הניחו לכל שטיפה לשבת במשך 1-2 דקות לפני השאיבה המלאה. לאחר הכביסה האחרונה, שאפו כדי להסיר את כל מאגר הכביסה שנותר, ואז הפכו את הצלחת והקישו על נייר סופג נקי.
    4. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת העבודה של מגיב הגילוי B לכל באר. מכסים באוטם צלחות חדש. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שאפו את הנוזל מכל באר ושטפו אותו חמש פעמים כמתואר בשלב 4.2.3. הכניסו 90 מיקרוליטר של תמיסת מצע TMB לכל באר, וכסו באיטום צלחות חדש.
    5. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות הרחק מהאור. בדוק את הצבע האופטימלי על ידי ניטור מעת לעת. שימו לב שהצבע הכחול העז בבאר כולל לקטופרין בריכוז גבוה.
    6. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר. הצבע ישתנה מכחול לצהוב. מדוד את הספיגה של כל באר מיד ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות עם התוכנה המשויכת אליו.
      הערה: הקש על הצלחת בעדינות כדי להבטיח ערבוב יסודי עד ששינוי הצבע אחיד.
  2. יצירת עקומה סטנדרטית וקביעת תוצאות
    1. בצע את שלב 2.3.1 להפקת נתונים כדי להעריך את ריכוז הלקטופרין.
    2. בנה עקומה סטנדרטית על ידי התוויית הספיגה הממוצעת המתוקנת עבור כל תקן כמתואר בשלב 2.3.2 אך ציור עקומה פולינומית עם תוכנה מתאימה המסוגלת להתאים את העקומה של ארבעת הפרמטרים.
    3. חישבו את תכולת הלקטופרין של כל דגימה על-ידי אינטרפולציה של ערך הספיגה במשוואה שנוצרה, כמתואר בשלב 2.3.3.

5. קביעת ריכוז IgG של דגימות באמצעות בקר IgG ELISA

  1. הכנת תקנים וריאגנטים
    1. השתמש בפריטים הנדרשים מאלה המסופקים בערכת Bovine IgG ELISA.
    2. לאזן את כל הדוגמאות והתקנים ל-RT.
    3. הכן כמויות מספיקות של תמיסה מצומדת אנזים-נוגדן עובדת על ידי דילול 10 מיקרוליטר של תרכיז חזרת פרוקסידאז (HRP)-אבידין (פי 100) עם 990 מיקרוליטר של מדלל מצומד אנזים-נוגדן.
    4. הכן נפחים מספיקים של מאגר כביסה 1x על ידי דילול תרכיז מאגר כביסה פי 20 עם dH2O.
    5. הכן נפחים מספיקים של תמיסת הדילול 1x על ידי דילול תרכיז מדלל פי 20 עם dH2O.
    6. הוסף 1.0 מ"ל של dH2O לכיול IgG בקר וערבב בעדינות עד להמסה. הריכוז הסופי של הכיול הוא 123.000 ננוגרם/מ"ל.
    7. הכן סדרות דילול סטנדרטיות בהתאם לתוכנית הדילול המתוארת בטבלה 3.

טבלה 3: תוכנית דילול של תקני IgG בקר.

הבקבוקוןנפח מדלל (μL)נפח ומקור IgG (μL)ריכוז IgG סופי (ng/mL)
ד1900100 מיקרוליטר מלאי12300
ד2900100 של דילול בקבוקון D11230
ד3178122 של דילול בקבוקון D2500
ד415050 של דילול בקבוקון D3250
ד5150150 של דילול בקבוקון D4125
ד6100100 של דילול בקבוקון D562.5
ד7100100 של דילול בקבוקון D631.25
ד8100100 של דילול בקבוקון D715,625
ד9100100 של דילול בקבוקון D87,813
D1010000 = ריק
  1. נוהל בדיקת IgG ELISA בקר
    1. פיפטה 100 מיקרוליטר מכל תקן IgG או דגימה לתוך צלחת הרצועה המצופה של 96 בארות. מכסים את הצלחת בסילר צלחת ודוגרים ב-RT למשך 30 דקות. שואבים את הנוזל מכל באר.
    2. יש לשטוף ארבע פעמים על ידי מילוי בארות עם מאגר כביסה אחד ולשאוף. לאחר הכביסה האחרונה, שאפו כדי להסיר את כל שאריות מאגר הכביסה, ולאחר מכן הפכו את הצלחת והקישו על נייר סופג נקי. הוסף 100 מיקרוליטר של מצומד אנזים-נוגדן מדולל כראוי לכל באר. מכסים בסילר צלחות ומערבבים בעדינות כדי להבטיח ערבוב יסודי.
    3. דגירה ב- RT למשך 10 דקות. שטפו והוציאו את מאגר הכביסה הנותר מהבארות כמתואר בשלב 5.2.2. הוסף 100 מיקרוליטר של מצע TMB לכל באר; מכסים באוטם צלחות חדש.
    4. דגירה ב-RT למשך 10 דקות בדיוק הרחק מהאור. עצור את התגובה על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר. קרא כל לוחית ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות עם התוכנה המשויכת אליו.
  2. יצירת עקומה סטנדרטית וקביעת תוצאות
    1. בצע את שלב 2.3.1 עבור מהדורת הנתונים כדי להעריך את ריכוז ה-IgG.
    2. בנה עקומה סטנדרטית על ידי התוויית הריכוז על ציר ה-x והספיגה הממוצעת המתוקנת עבור כל תקן על ציר ה-y. צייר עקומה פולינומית עם תוכנה מתאימה המסוגלת להתאים את העקומה של ארבעת הפרמטרים.
    3. חשב את תכולת ה-IgG של כל דגימה על ידי אינטרפולציה של ערך הספיגה על המשוואה שנוצרה כמתואר בשלב 2.3.3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול, דגימות הקולוסטרום של הבקר נותחו כדי לקבוע את ריכוז החלבון, הלקטופרין וה-IgG. התוצאות של ניתוחי חלבון, לקטופרין ו-IgG של קולוסטרום בקר מוצגות בטבלה 4.

טבלה 4: ריכוז חלבון, לקטופרין ו-IgG של קולוסטרום בקר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מחקר זה מספק מידע על שינויים ניכרים בריכוזי החלבון, הלקטופרין וה-IgG בקולוסטרום במהלך המעבר לחלב בוגר. זיהוי שינויים בריכוז הלקטופרין וה-IgG בוצע על ידי כריך ELISA, וריכוז החלבון הכולל נותח על ידי בדיקת BCA. התוצאות מצביעות על כך שקולוסטרום מוקדם מכיל את ריכוז החלבון, הלקטופרין ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co). RMD ו-BMH הם עובדים של Evolve BioSystems, חברה המתמקדת בשיקום המיקרוביום של התינוקות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10X Running Buffer (Tris-Glycine-SDS)ClearBandTGS10SDS-Page analysis
2-mercaptoethanolgibco31350-010SDS-Page analysis
Acetic Acid GLACIALIsolab901,013,2500SDS-Page analysis
Bovine IgG ELISA KitAviva Systems BiologyOKIA00005Determination of IgG concentration
Bovine LF / LTF / Lactoferrin ELISA KitLSBio Lifespan BiosciencesLS-F4884Determinaton of lactoferrin concentration
Coomassie Brillant Blue R 250amresco0472-25GSDS-Page analysis
Hydrochloric Acid Fuming 37%Isolab932,103,2501SDS-Page analysis
IsopropanolIsolab961,023,2500SDS-Page analysis
Laemmli Sample Buffer (2X)ClearBandLSB-2xSDS-Page analysis
MethanolIsolab947,046,2500SDS-Page analysis
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder 10 to 250Thermo Scientific26619SDS-Page analysis
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Determination of protein concentration
Sodium dodecyl sulfate (SDS)BioShopSDS001.500SDS-Page analysis
SureCast Acrylamide Solution 40% (w/v)InvitrogenHC2040SDS-Page analysis
SureCast Ammonium persulfate (APS)Thermo Scientific17874SDS-Page analysis
SureCast Tetramethylethylenediamine (TEMED)InvitrogenHC2006SDS-Page analysis
TECAN Infinite M200 Plate ReaderTecan30035094Measurement of absorbance
Tris baseBioShopTRS001.1SDS-Page analysis

References

  1. Kehoe, S. I., Jayarao, B. M., Heinrichs, A. J. A survey of bovine colostrum composition and colostrum management practices on Pennsylvania dairy farms. Journal of Dairy Science. 90 (9), 4108-4116 (2007).
  2. Levieux, D., Ollier, A. Bovine immunoglobulin G, β-lactoglobulin, α-lactalbumin and serum albumin in colostrum and milk during the early post partum period. Journal of Dairy Research. 66 (3), 421-430 (1999).
  3. Elfstrand, L., Lindmark-Månsson, H., Paulsson, M., Nyberg, L., Åkesson, B. Immunoglobulins, growth factors and growth hormone in bovine colostrum and the effects of processing. International Dairy Journal. 12 (11), 879-887 (2002).
  4. Strekozov, N. I., Motova, E. N., Fedorov, Y. N. Evaluation of the chemical composition and immunological properties of colostrum of cows' first milk yield. Russian Agricultural Sciences. 34 (4), 259-260 (2008).
  5. Playford, R. J., Weiser, M. J. Bovine colostrum: Its constituents and uses. Nutrients. 13 (1), 265(2021).
  6. Godhia, M., Patel, N. Colostrum - Its composition, benefits as a nutraceutical: A review. Current Research in Nutrition and Food Science Journal. 1 (1), 37-47 (2013).
  7. Nakamura, T., et al. Concentrations of sialyloligosaccharides in bovine colostrum and milk during the prepartum and early lactation. Journal of Dairy Science. 86 (4), 1315-1320 (2003).
  8. Arain, H. H., Khaskheli, M., Arain, M. A., Soomro, A. H., Nizamani, A. H. Heat stability and quality characteristics of postpartum buffalo milk. Pakistan Journal of Nutrition. 7 (2), 303-307 (2008).
  9. Maunsell, F. P., et al. Effects of mastitis on the volume and composition of colostrum produced by Holstein cows. Journal of Dairy Science. 81 (5), 1291-1299 (1998).
  10. Tittle, D. J. Factors affecting colostrum quality. Cattle Practice. 10 (2), 131-136 (2002).
  11. Zarcula, S., et al. Influence of breed, parity and food intake on chemical composition of first colostrum in cow. Animal Science and Biotechnology. 43 (1), 43(2010).
  12. McGrath, B. A., Fox, P. F., McSweeney, P. L. H., Kelly, A. L. Composition and properties of bovine colostrum: a review. Dairy Science and Technology. 96 (2), 133-158 (2016).
  13. Bastian, S. E. P., Dunbar, A. J., Priebe, I. K., Owens, P. C., Goddard, C. Measurement of betacellulin levels in bovine serum, colostrum and milk. Journal of Endocrinology. 168 (1), 203-212 (2001).
  14. Zhang, L., et al. Bovine milk proteome in the first 9 days: Protein interactions in maturation of the immune and digestive system of the newborn. PloS One. 10 (2), 0116710(2015).
  15. Godden, S. Colostrum management for dairy calves. The Veterinary clinics of North America. Food Animal Practice. 24 (1), 19-39 (2008).
  16. Larson, B. L., Heary, H. L., Devery, J. E. Immunoglobulin production and transport by the mammary gland. Journal of Dairy Science. 63 (4), 665-671 (1980).
  17. Ulfman, L. H., Leusen, J. H. W., Savelkoul, H. F. J., Warner, J. O., van Neerven, R. J. J. Effects of bovine immunoglobulins on immune function, allergy, and infection. Frontiers in Nutrition. 5, 52(2018).
  18. El-Loly, M. M. Bovine milk immunoglobulins in relation to human health. International Journal of Dairy Science. 2 (3), 183-195 (2007).
  19. Korhonen, H., Marnila, P., Gill, H. S. Milk immunoglobulins and complement factors. British Journal of Nutrition. 84 (1), 75-80 (2000).
  20. Arnold, R. R., Brewer, M., Gauthier, J. J. Bactericidal activity of human lactoferrin: Sensitivity of a variety of microorganisms. Infection and Immunity. 28 (3), 893-898 (1980).
  21. Aisen, P., Listowsky, I. Iron transport and storage proteins. Annual Review of Biochemistry. 49 (1), 357-393 (1980).
  22. Zhao, X., et al. The in vitro protective role of bovine lactoferrin on intestinal epithelial barrier. Molecules. 24 (1), 148(2019).
  23. Chatterton, D. E. W., Smithers, G., Roupas, P., Brodkorb, A. Bioactivity of β-lactoglobulin and α-lactalbumin-Technological implications for processing. International Dairy Journal. 16 (11), 1229-1240 (2006).
  24. Pellegrini, A., Dettling, C., Thomas, U., Hunziker, P. Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1526 (2), 131-140 (2001).
  25. Brück, W. M., et al. rRNA probes used to quantify the effects of glycomacropeptide and α-lactalbumin supplementation on the predominant groups of intestinal bacteria of infant rhesus monkeys challenged with enteropathogenic Escherichia coli. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 37 (3), 273-280 (2003).
  26. Indyk, H. E., Hart, S., Meerkerk, T., Gill, B. D., Woollard, D. C. The β-lactoglobulin content of bovine milk: Development and application of a biosensor immunoassay. International Dairy Journal. 73, 68-73 (2017).
  27. Swaisgood, H. E. Protein and amino acid composition of bovine milk. Handbook of Milk Composition. , 464-468 (1995).
  28. Seifu, E., Buys, E. M., Donkin, E. F. Significance of the lactoperoxidase system in the dairy industry and its potential applications: A review. Trends in Food Science and Technology. 16 (4), 137-154 (2005).
  29. Wheeler, T. T., Hodgkinson, A. J., Prosser, C. G., Davis, S. R. Immune components of colostrum and milk-A historical perspective. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 12 (4), 237-247 (2007).
  30. Clare, D., Catignani, G., Swaisgood, H. Biodefense properties of milk: The role of antimicrobial proteins and peptides. Current Pharmaceutical Design. 9 (16), 1239-1255 (2003).
  31. Mehra, R., Marnila, P., Korhonen, H. Milk immunoglobulins for health promotion. International Dairy Journal. 16 (11), 1262-1271 (2006).
  32. Gapper, L. W., Copestake, D. E. J., Otter, D. E., Indyk, H. E. Analysis of bovine immunoglobulin G in milk, colostrum and dietary supplements: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (1), 93-109 (2007).
  33. Mettler, A. E. Utilization of whey by-products for infant feeding. International Journal of Dairy Technology. 33 (2), 67-72 (1980).
  34. Zenker, H. E., Raupbach, J., Boeren, S., Wichers, H. J., Hettinga, K. A. The effect of low vs. high temperature dry heating on solubility and digestibility of cow's milk protein. Food Hydrocolloids. 109, 106098(2020).
  35. Costa, F. F., et al. Microfluidic chip electrophoresis investigation of major milk proteins: Study of buffer effects and quantitative approaching. Analytical Methods. 6 (6), 1666-1673 (2014).
  36. Lönnerdal, B., Du, X., Jiang, R. Biological activities of commercial bovine lactoferrin sources. Biochemistry and Cell Biology. 99 (1), 35-46 (2021).
  37. Belanger, L., Sylvestre, C., Dufour, D. Enzyme-linked immunoassay for alpha-fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta. 48 (1), 15-18 (1973).
  38. Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
  39. Engvall, E. The ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay. Clinical Chemistry. 56 (2), 319-320 (2010).
  40. Kohl, T. O., Ascoli, C. A. Immunometric double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (6), (2017).
  41. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77 (7), 98-101 (2016).
  42. Abd El-Fattah, A. M., Abd Rabo, F. H. R., EL-Dieb, S. M., El-Kashef, H. A. Changes in composition of colostrum of Egyptian buffaloes and Holstein cows. BMC Veterinary Research. 8 (1), 19(2012).
  43. Newby, T. J., Stokes, C. R., Bourne, F. J. Immunological activities of milk. Veterinary Immunology and Immunopathology. 3 (1-2), 67-94 (1982).
  44. Chigerwe, M., et al. Comparison of four methods to assess colostral IgG concentration in dairy cows. Journal of the American Veterinary Medical Association. 233 (5), 761-766 (2008).
  45. Foley, J. A., Otterby, D. E. Availability, storage, treatment, composition, and feeding value of surplus colostrum: A review. Journal of Dairy Science. 61 (8), 1033-1060 (1978).
  46. Mechor, G. D., Gröhn, Y. T., McDowell, L. R., Van Saun, R. J. Specific gravity of bovine colostrum immunoglobulins as affected by temperature and colostrum components. Journal of Dairy Science. 75 (11), 3131-3135 (1992).
  47. Pritchett, L. C., Gay, C. C., Besser, T. E., Hancock, D. D. Management and production factors influencing immunoglobulin G1 concentration in colostrum from Holstein cows. Journal of Dairy Science. 74 (7), 2336-2341 (1991).
  48. Quigley, J. D., Martin, K. R., Dowlen, H. H. Concentrations of trypsin inhibitor and immunoglobulins in colostrum of Jersey cows. Journal of Dairy Science. 78 (7), 1573-1577 (1995).
  49. Bielmann, V., et al. An evaluation of Brix refractometry instruments for measurement of colostrum quality in dairy cattle. Journal of Dairy Science. 93 (8), 3713-3721 (2010).
  50. A Ayar, A., Sıçramaz, H., Çetin, I. The effect of bovine colostrum on the lactic flora of yogurt and kefir. JSM Biotechnology and Biomedical Engineering. 3, 3-8 (2016).
  51. Sobaih, A., Zaki, D. A. Production of novel functional yoghurt fortified with bovine colostrum and date syrup for children. Alexandria Science Exchange Journal. 39, 651-662 (2018).
  52. Saalfeld, M. H., et al. Colostro: a redescoberta de um alimento saudável, nutritivo e com potencial probiótico. Agroecologia e Desenvolvimento Rural Sustentável. 5 (2), 18-24 (2012).
  53. Mouton, E., Aryana, K. J. Influence of colostrum on the characteristics of ice cream. Food and Nutrition Sciences. 06 (05), 480-484 (2015).
  54. Nazir, T., Pal, M. A., Manzoor, A. Effect of admixing varying levels of whole milk to the colostrum on the sensory quality of fermented colostrum product. International Journal of Advanced Research in Science, Engineering and Technology. 7 (4), 156-161 (2018).
  55. Korhonen, H. J. Bioactive milk proteins, peptides and lipids and other functional components derived from milk and bovine colostrum. Functional Foods. , 471-511 (2011).
  56. Cortés-Ríos, J., et al. Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times. Analytical Biochemistry. 608, 113904(2020).
  57. Johnson, M. Protein quantitation. Materials and Methods. 2, 115(2012).
  58. Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).
  59. Wang, R., et al. Sensitive immunoassays based on specific monoclonal IgG for determination of bovine lactoferrin in cow milk samples. Food Chemistry. 338, 127820(2021).
  60. Kazemi, M. G., Feizy, J. Overview of the important of ELISA technique and application in food industry. Analyzing Microbes. 4 (4), 19-25 (2020).
  61. Verma, J., Saxena, S., Babu, S. G. ELISA-based identification and detection of microbes. Analyzing Microbes. , 169-186 (2013).
  62. Minic, R., Zivkovic, I. Optimization, validation and standardization of ELISA. Norovirus. , (2020).
  63. Drijvers, J. M., Awan, I. M., Perugino, C. A., Rosenberg, I. M., Pillai, S. The enzyme-linked immunosorbent assay. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 119-133 (2017).
  64. Walker, A. Breast milk as the gold standard for protective nutrients. The Journal of Pediatrics. 156 (2), 3-7 (2010).
  65. Patel, K., Rana, R. Pedimune in recurrent respiratory infection and diarrhoea-The Indian experience-The PRIDE study. The Indian Journal of Pediatrics. 73 (7), 585-591 (2006).
  66. Saad, K., et al. Effects of bovine colostrum on recurrent respiratory tract infections and diarrhea in children. Medicine. 95 (37), 4560(2016).
  67. Buckley, J. D., Brinkworth, G. D., Abbott, M. J. Effect of bovine colostrum on anaerobic exercise performance and plasma insulin-like growth factor I. Journal of Sports Sciences. 21 (7), 577-588 (2003).
  68. Kotsis, Y., et al. A low-dose, 6-week bovine colostrum supplementation maintains performance and attenuates inflammatory indices following a Loughborough Intermittent Shuttle Test in soccer players. European Journal of Nutrition. 57 (3), 1181-1195 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

GIgGSDS PAGEELISA ASSSAY

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved