Determining Total Protein and Bioactive Protein Concentrations in Bovine Colostrum(소 초유의 총 단백질 및 생체 활성 단백질 농도 측정)

소 초유는 갓 태어난 송아지를 위한 영양소이자 면역학적 지원의 주요 공급원입니다. 치료용 단백질(락토페린 및 IgG)의 수준에 대한 이해는 소 초유 투여 및 인체 섭취를 위한 표준화에 중요합니다.

초유는 분만 직후 포유류가 생산하는 복잡한 생물학적 액체입니다. 그것은 다량 영양소 및 미량 영양소, 생체 활성 펩타이드 및 성장 인자의 좋은 공급원으로서 신생아에 대한 모든 영양 요구 사항을 충족합니다. 또한 소초유는 면역글로불린 G(IgG)와 락토페린을 포함한 풍부한 단백질 함량으로 인해 영양 및 생체 활성의 잠재적인 공급원입니다. 그러나 소 초유의 락토페린과 IgG 수치는 수유 기간 동안 현저하게 변합니다. 따라서 소 초유를 단백질 공급원으로 사용하기 위해 IgG 및 락토페린의 농도를 모니터링하는 것은 연구해야 할 중요한 질문입니다. 이 기사의 방법은 단백질 함량을 측정하는 방법과 락토페린 및 IgG의 특정 농도를 설명합니다. 이러한 방법에는 소 초유 단백질 분리, Bicinchoninic acid assay(BCA)를 통한 단백질 농도 측정, SDS-PAGE를 통한 단백질 시각화, lactoferrin 측정 및 ELISA 분석을 사용한 IgG 농도 측정 단계가 포함됩니다.

초유는 분만 직후 포유류가 생산하는 유선의 초기 분비물입니다. 초유는 다량 영양소 및 미량 영양소, 항균 펩타이드, 성장 인자 1,2,3,4가 풍부합니다. 조성은 성숙^{한 우유로의} 전환을 통해 시간이 지남에 따라 점진적으로 변하지만^5,6,7 가장 두드러지게 분만 후 24시간 이내에 변화합니다⁸. 초유의 구성은 또한 연령, 동등성, 품종, 건강 및 영양 상태를 포함한 모계 요인뿐만 아니라 계절, 조기 분만, 조기 수유, 초유 처리 요인(초유 및 보관 온도 웅덩이) 및 분만 유도를 포함한 외적 요인에 의해서도 영향을 받습니다 ^9,10,11. 초유는 성숙한 우유에 비해 유당이 적고 지방, 단백질, 펩타이드, 비단백질 질소, 회분, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 뉴클레오티드, 비타민 및 미네랄을 더 많이 함유하고 있습니다¹². 소 초유에는 면역글로불린, 락토페린, α-락토글로불린(α-LA), β-락토글로불린(β-Lg), 락토페록시다아제 및 여러 성장 인자를 포함한 광범위한 단백질이 포함되어 있습니다¹³. 소 초유의 총 단백질 농도는 11.26mg/mL에서 169.55mg/mL 사이입니다¹⁴. 단백질 함량은 평균 농도가 124.00mg/mL 및 26.00mg/mL인 유청과 카제인으로 구성되어 있습니다¹⁵. 유청 부분에는 IgG(85%-90%), IgM(7%) 및 IgA(5%)의 세 가지 주요 면역 글로불린(Igs)이 포함되어 있습니다¹⁶. 소 초유의 주요 Ig는 IgG로, 이는 수동적 면역을 제공하고 송아지¹⁷의 적응 및 선천성 면역 체계를 조절합니다. 첫 번째 착유 소 초유의 초기 Ig 농도는 20-200 mg/mL 범위이며 약 0.4-1.0 mg/mL로 감소할 수 있습니다¹⁸. 평균 IgG 농도는 약 60mg/mL이며 성숙한 우유로 전환하는 동안 1mg/mL 미만으로 꾸준히 감소합니다¹⁹.

초유의 또 다른 중요한 생체 활성 단백질은 1.5-5mg/mL 농도의 철 결합 당단백질인 락토페린입니다. 락토페린의 특성에는 철 흡수 향상, 항균 활성 ^20,21, 지질다당류 결합, 면역 조절, 장 상피 세포 및 섬유아세포의 성장 자극^{등이 있습니다 22}. 소 초유에는 α-락트알부민과 β-락토글로불린도 함유되어 있습니다. 이 단백질은 필수 아미노산의 공급원이며 살균 활성도 가지고 있습니다 23,24,25. 초유의 평균 α-LA 및 β-Lg 농도는 각각 평균 2.77mg/mL2^및 11.5mg/^mL26입니다. 그 후, 이러한 농도는 성숙한 우유에서 1-1.5 mg/mL²⁷ 및 4.8 mg/mL²⁶으로 감소합니다. 초유에는 또한 상당한 양의 락토페록시다제(평균 22.8μg/mL)와 라이소자임(평균 0.40μg/mL)이 함유되어 있습니다²⁶. 락토페록시다아제(Lactoperoxidase)는 활성산소종(reactive oxygen species)을 생성함으로써 그람 양성 및 음성 박테리아²⁸에 대한 항균 활성을 가진 당단백질(glycoprotein)이다. 라이소자임(Lysozyme)은 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸(peptidoglycan) 성분을 절단하여 세포사멸을 유발함으로써 항균제로 작용한다^29,30.

IgG와 락토페린은 그 특성으로 인해 유아용 조제분유, 식품 보조제, 회복기 및 운동선수를 위한 고단백 제제, 약리학 및 미용 요법을 강화하기 위해 다양한 식품으로 가공됩니다 31,32,33^. 소 초유는 IgG와 락토페린의 중요한 공급원입니다. 그러나 소 초유에서 이러한 생체 활성 단백질의 구성은 수유 기간 동안 현저하게 변합니다. 따라서 연구 및 식품 가공에 사용되는 초유 샘플에서 이러한 생체 활성 단백질의 농도 변화를 모니터링하는 것이 중요합니다. 본 연구는 분만 후 6일 동안 소 초유 내 총 단백질, 락토페린 및 IgG의 농도 및 조성을 모니터링하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다.

초유 샘플은 7월에서 8월 사이에 걸쳐 터키 차나칼레(Çanakkale)에 있는 울루오바 우유 무역 회사(Uluova Milk Trading Company)의 홀스타인 젖소 28마리에서 정오에 분만한 후 6일 동안 채취하여 급속 냉동했습니다. 당일에 수집된 샘플은 각 샘플의 날짜에 따라 통합되고 총 단백질, 락토페린 및 IgG 농도를 분석했습니다. 모든 샘플은 중복으로 분석되었습니다.

1. 시료 준비

1. 200μL의 소 초유와 400μL의 dH₂O를 혼합하여 분석을 위한 희석된 샘플을 얻습니다. 그에 따라 모든 샘플을 희석하십시오.
2. 원심분리기 희석 및 희석되지 않은 시료를 4°C, 1000 x g 에서 30분 동안 사용합니다.
3. 중간 단계를 적절하게 라벨링된 새 튜브로 분리합니다. 1.2단계를 반복합니다. 명확한 중간 단계를 얻기 위해. 즉시 사용하지 않는 경우 전체 중간상과 희석된 샘플을 -20°C에서 보관하십시오.
4. 희석된 샘플에서 얻은 중간상을 BCA, SDS-PAGE 및 락토페린 분석에 사용합니다. IgG 분석을 위해 희석되지 않은 샘플에서 중간 단계를 수집합니다.
5. 각 샘플에 대한 샘플 희석을 준비하여 판독값이 표준 곡선 범위 내에 있는지 확인합니다. 희석된 샘플에서 얻은 각 중간상을 BCA 분석의 경우 1:300, 락토페린 분석의 경우 1:30,000으로 희석하고, 희석되지 않은 샘플에서 얻은 각 중간상을 IgG 분석의 경우 1:400,000으로 희석합니다.
   참고: 희석 계수는 흡광도 값과 표준 곡선에 따라 결정됩니다.

2. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도 측정

1. 표준물질 및 시약의 준비
   1. 분석에 사용하기 위해 시중에서 판매되는 키트( 재료 표 참조)에 제공된 시약을 사용하십시오: 0.1M 수산화나트륨에 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 비신초닌산 및 주석산나트륨을 함유한 BCA 시약 A. BCA 시약 B에는 4%의 황산구리가 함유되어 있습니다. 알부민(BSA) 표준물질은 0.9% 식염수와 0.05% 아지드화나트륨에 2.0mg/mL의 소 혈청 알부민을 함유하고 있습니다.
   2. 모든 샘플과 단백질 표준물질을 실온(RT)으로 평형화합니다.
   3. 50:1 비율의 시약 A:B를 혼합하여 충분한 양의 작업 시약(WR)을 준비합니다. 각 샘플과 표준물질에 대해 200μL의 WR이 필요합니다.
   4. 다음 희석 계획(표 1)에 따라 20-2,000 μg/mL 최종 BSA 농도 사이의 작동 범위를 나타내는 희석 알부민(BSA) 표준물을 준비합니다. dH₂O를 희석제로 사용하십시오.

표 1: BSA 표준의 희석 계획.

2. BCA 분석 절차
   1. 각 BCA 표준물질 또는 시료 25μL를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 200 μL의 WR을 각 웰 함유 표준물질 또는 샘플에 추가합니다. 접시 셰이커에서 30초 동안 접시를 완전히 섞습니다.
   2. 플레이트를 플레이트 씰러로 덮고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 약 10분 동안 반응이 RT로 평형을 이루도록 합니다. 관련 소프트웨어와 함께 마이크로플레이트 리더를 사용하여 562nm에서 각 플레이트를 판독합니다.
3. 표준 곡선 생성 및 결과 결정
   1. 표준물질 및 샘플에 대한 흡광도 값을 기록합니다. 희석 시리즈에 대해서는 표 1 을 참조하십시오. 표준물질 및 시료의 각 흡광도 값에서 standard blank의 흡광도 값을 뺍니다. 각 표준물질 및 샘플에 대한 중복 판독값을 평균화하여 총 단백질 농도를 추정합니다.
   2. 각 표준에 대한 수정된 평균 흡광도를 x축에 표시하고 농도를 y축에 표시하여 표준 곡선을 구성합니다. 4개의 매개변수로 구성된 곡선을 피팅할 수 있는 적절한 소프트웨어를 사용하여 선형 곡선을 그립니다.
   3. 표준 곡선을 사용하여 농도에 대한 각 샘플의 반응을 보간하여 각 샘플의 농도를 결정합니다. 희석 계수(단계 1.5)를 곱하여 샘플의 실제 농도를 구합니다.

3. SDS-PAGE assay를 사용한 단백질 시각화

1. 시료 및 용액 준비
   1. 재고 솔루션 준비
      1. 10 % (w / v) SDS, 1.5 M Tris-HCl pH 8.3, 0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 10 % (w / v) 과황산 암모늄 (APS) 용액 (신선하게 준비)을 준비합니다.
      2. (승/패) SDS: SDS 1g의 무게를 측정하고 10mL의 dH₂O를 추가합니다.
      3. M Tris-HCl pH 8.8: Tris 18.15g의 무게를 측정하고 ~60mL의 dH₂O로 용해합니다. HCl로 pH 8.8로 조정합니다. dH_2O를 추가하여 부피를 100mL로 가져옵니다.
      4. M Tris-HCl pH 6.8 : Tris 6.00g의 무게를 측정하고 ~ 60mL의 dH₂O로 용해합니다. HCl로 pH 6.8로 조정합니다. dH₂O를 추가하여 부피를 100mL로 가져옵니다.
      5. APS: APS 15mg의 무게를 측정하고 150μL의 dH₂O를 추가합니다.
         주의 : 아크릴아마이드와 SDS는 독성이 있고 유해합니다. 보호 장갑을 착용하고 후드 아래에서 작업하십시오.
   2. 950μL의 2x SDS-PAGE 샘플 버퍼에 50μL의 β-Mercaptoethanol을 추가하여 샘플 버퍼를 준비합니다.
      주의: β-메르캅토에탄올은 흡입하면 독성이 있습니다. 보호 장갑을 착용하고 후드 아래에서 작업하십시오.
   3. 100mL의 10x Tris-glycine SDS Running Buffer와 900mL의 dH₂O를 혼합하여 Running Buffer를 준비합니다.
   4. 염색 용액(45% dH₂O, 45% 메탄올, 10% 빙초산, Coomassie Brilliant Blue R 2g)을 준비합니다.
   5. 탈염 용액 (50 % dH₂O, 40 % 메탄올, 10 % 빙초산)을 준비합니다.
2. 젤의 준비
   1. 분석을 위해 젤 카세트, 전원 공급 장치, 전극 및 케이블을 포함한 전기영동 장치 장비를 준비합니다. 유리판을 에탄올로 청소하고 샌드위치를 조립합니다. 유리판과 스페이서의 아래쪽 가장자리가 잘 정렬되어 있는지 확인하십시오.
   2. dH₂O 3.5 mL, 40 % 아크릴 아미드 / 메틸렌 비스 아크릴 아미드 2.4 mL, 1.5M Tris-HCl 2 mL, 10 % (w / v) SDS 100 μL, 10 % APS 80 μL, N, N, N ', N '- 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED).
      주의: TEMED는 독성 및/또는 자극제입니다. 보호 장갑을 착용하고 후드 아래에서 작업하십시오.
   3. 분리 젤 혼합물을 짧은 플레이트 상단에서 약 1-1.5cm 아래 수준까지 젤 플레이트에 붓습니다.
   4. 분리 젤 상단에 이소프로판올을 겹쳐 젤 상단의 기포를 제거하고 중합된 젤이 마르지 않도록 합니다.
   5. 분리 젤이 최소 15분 동안 중합된 후 분리 젤 위에 이소프로판올을 붓습니다.
   6. 1.92 mL의 dH₂O, 300 μL의 40 % 아크릴 아미드 / 메틸렌 비스 아크릴 아미드, 750 μL의 0.5M Tris-HCl, 100 μL의 10 % (w / v) SDS, 30 μL의 10 % APS 및 3 μL의 TEMED를 포함하는 스태킹 겔 혼합물을 준비합니다.
   7. 젤 플레이트가 채워지도록 분리 젤 위에 스태킹 젤 용액을 붓습니다. 스페이서 상단에 빗을 삽입합니다.
   8. 스태킹 젤이 실온에서 약 15분 동안 중합되도록 합니다.
3. 젤 실행
   1. 전극 어셈블리에 젤을 부착합니다. 갓 준비된 1x Tris-glycine SDS Running Buffer를 장치의 두 챔버에 추가합니다.
   2. 빗을 제거합니다.
   3. 5 μL의 ladder(10-250 kDa)와 8 μL의 희석된 샘플의 중간 단계를 겔의 웰에 로드합니다. 염료가 분리 젤로 이동할 때까지 80V에서 젤을 실행하고 염료가 젤 바닥에 도달할 때까지 120V로 증가시킵니다. 염료가 젤 바닥에 도달 한 후 적용된 전원을 끕니다.
4. 겔의 염색 및 염색
   1. 실행이 완료되면 장치에서 젤을 제거하고 스페이서와 유리판을 제거합니다. 젤을 작은 트레이에 넣습니다.
   2. 염색 용액(3.1.4단계)을 첨가하여 55rpm으로 30분 동안 부드럽게 흔들어 젤을 염색합니다.
   3. 젤에서 염색 용액을 붓습니다. 소량의 탈염액으로 젤을 헹구고 염료를 버립니다.
   4. 젤을 덮을 만큼 충분한 양의 탈염 용액을 추가하고 밴드가 보일 때까지 ~1시간 동안 부드럽게 흔들어 탈염합니다.

4. 소 락토페린 ELISA를 이용한 락토페린 농도

1. 표준물질 및 시약의 준비
   1. 이 분석을 위해 시중에서 판매되는 Bovine LF/LTF/Lactoferrin ELISA Kit를 사용하십시오.
   2. 모든 샘플과 표준물질을 RT로 평형화합니다.
   3. 포획된 항원에 결합하는 역할을 하는 검출 시약 A 및 B Working Solution을 충분한 부피로 준비합니다.
   4. 검출 시약 A와 B를 각각 분석 희석제 A와 B를 사용하여 1:100의 비율로 희석합니다.
   5. 1x 세척 완충액 농축액을 dH_2O로 희석하여 30x 작업 세척 완충액을 준비합니다.
   6. 멸균 마이크로튜브에 충분한 양의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액을 넣습니다.
   7. 동결건조된 표준물질(100ng/mL)의 튜브 1개를 샘플 희석제 0.5mL와 함께 재현탁하고 RT에서 10분 동안 부드럽게 교반하면서 배양합니다. 바이알을 돌려 동결건조된 산플이 모두 바닥에 모이도록 합니다.
   8. 다음 희석 방식에 따라 표준 희석 시리즈를 준비합니다(표 2).

표 2: 소 락토페린 표준물질의 희석 계획.

2. 소 락토페린의 농도 측정
   1. 각 락토페린 표준물질 또는 시료 100μL를 코팅된 96웰 스트립 플레이트에 피펫팅합니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트 씰러로 플레이트를 덮으십시오. 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
   2. 각 웰의 액체를 흡입하십시오. 각 웰에 검출 시약 A 작업 용액 100μL를 추가합니다. 플레이트 씰러로 덮고 철저히 혼합되도록 부드럽게 저어줍니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
   3. 각 웰에서 액체를 흡입한 후 약 350μL의 1x 세척 버퍼를 추가하여 3회 세척합니다. 완전히 흡입하기 전에 각 세척을 1-2분 동안 그대로 두십시오. 마지막 세탁 후 흡입하여 남아 있는 세탁 버퍼를 제거한 다음 플레이트를 뒤집고 깨끗한 흡수성 종이에 두드립니다.
   4. 각 웰에 검출 시약 B 작업 용액 100μL를 추가합니다. 새 플레이트 씰러로 덮습니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양합니다. 각 웰에서 액체를 흡입하고 4.2.3단계에 설명된 대로 5회 세척합니다. 90μL의 TMB 기질 용액을 각 웰에 넣고 새 플레이트 씰러로 덮습니다.
   5. 37 °C에서 10-20 분 동안 빛으로부터 떨어져서 배양하십시오. 주기적인 모니터링을 통해 최적의 색상을 확인합니다. 웰의 강렬한 파란색에 고농축 락토페린이 포함되어 있음을 관찰하십시오.
   6. 각 웰에 50μL의 정지 용액을 추가합니다. 색상이 파란색에서 노란색으로 바뀝니다. 450nm에서 각 웰의 흡광도를 즉시 측정하려면 관련 소프트웨어와 함께 마이크로플레이트 리더를 사용합니다.
      알림: 색상 변화가 균일해질 때까지 철저한 혼합을 위해 플레이트를 부드럽게 두드립니다.
3. 표준 곡선 생성 및 결과 결정
   1. 데이터 생성을 위해 2.3.1단계에 따라 락토페린 농도를 추정합니다.
   2. 2.3.2단계에서 설명한 대로 각 표준에 대한 수정된 평균 흡광도를 플로팅하되 4개 매개변수 곡선 피팅이 가능한 적절한 소프트웨어를 사용하여 다항식 곡선을 그려 표준 곡선을 구성합니다.
   3. 2.3.3단계에서 설명한 대로 생성된 방정식에 흡수 값을 보간하여 각 샘플의 락토페린 함량을 계산합니다.

5. 소 IgG ELISA를 사용한 샘플의 IgG 농도 측정

1. 표준물질 및 시약의 준비
   1. Bovine IgG ELISA Kit에 제공된 품목 중 필요한 품목을 사용하십시오.
   2. 모든 샘플과 표준물질을 RT로 평형화합니다.
   3. 10μL의 양고추냉이 과산화효소(HRP)-아비딘 농축액(100x)을 990μL의 효소-항체 접합체 희석액으로 희석하여 충분한 양의 작동 효소-항체 접합 용액을 준비합니다.
   4. 1x 세척 완충액 농축액을 dH_20O로 희석하여 충분한 양의 세척 완충액을 준비합니다.
   5. 20x 희석제 농축액을 dH₂O로 희석하여 1x 희석액을 충분한 부피의 준비합니다.
   6. 소 IgG 캘리브레이터에 1.0mL의 dH₂O를 추가하고 용해될 때까지 부드럽게 혼합합니다. 캘리브레이터의 최종 농도는 123.000ng/mL입니다.
   7. 표 3에 설명된 희석 방식에 따라 표준 희석 시리즈를 준비합니다.

표 3: 소 IgG 표준물질의 희석 계획.

2. 소 IgG ELISA 분석 절차
   1. 각 IgG 표준물질 또는 시료 100μL를 코팅된 96웰 스트립 플레이트에 피펫팅합니다. 플레이트를 플레이트 씰러로 덮고 RT에서 30분 동안 배양합니다. 각 웰에서 액체를 흡입합니다.
   2. 웰에 1x 세척 버퍼를 채워 4번 세척하고 흡입합니다. 마지막 세탁 후 흡입하여 잔여 세탁 버퍼를 제거한 다음 플레이트를 뒤집고 깨끗한 흡수성 종이에 두드립니다. 적절하게 희석된 Enzyme-Antibody Conjugate 100μL를 각 웰에 추가합니다. 플레이트 씰러로 덮고 철저히 혼합되도록 부드럽게 저어줍니다.
   3. 상온에서 10분 동안 배양합니다. 5.2.2 단계에서 설명한 대로 웰에서 잔류 세척 버퍼를 세척하고 제거합니다. 각 웰에 100μL의 TMB 기질을 추가합니다. 새 플레이트 씰러로 덮습니다.
   4. 빛에서 정확히 10분 떨어진 곳에서 RT에서 배양합니다. 각 웰에 100μL의 정지 용액을 첨가하여 반응을 중지합니다. 관련 소프트웨어와 함께 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 각 플레이트를 판독합니다.
3. 표준 곡선 생성 및 결과 결정
   1. 데이터 에디션에 대한 2.3.1단계에 따라 IgG 농도를 추정합니다.
   2. x축에 농도를 표시하고 y축에 각 표준에 대한 수정된 평균 흡광도를 표시하여 표준 곡선을 구성합니다. 4개의 매개변수 곡선을 피팅할 수 있는 적절한 소프트웨어를 사용하여 다항식 곡선을 그립니다.
   3. 2.3.3단계에서 설명한 대로 생성된 방정식에 흡수 값을 보간하여 각 샘플의 IgG 함량을 계산합니다.

프로토콜에 따라 소 초유 샘플을 분석하여 단백질, 락토페린 및 IgG 농도를 측정했습니다. 소 초유의 단백질, 락토페린 및 IgG 분석 결과는 표 4에 나와 있습니다.

표 4: 단백질, 락토페린 및 소 초유의 IgG 농도.

이 연구는 성숙한 우유로 전환하는 동안 초유의 단백질, 락토페린 및 IgG 농도의 상당한 변화에 대한 정보를 제공합니다. 락토페린과 IgG 농도의 변화는 샌드위치 ELISA로 검출하고, 총 단백질 농도는 BCA 분석법으로 분석하였다. 연구 결과에 따르면 초기 초유는 단백질, 락토페린, IgG 농도가 가장 높았으며, 이후 3일 동안 감소한 것으로 나타났습니다. 이러한 단백질의 정확한...

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이 연구는 Uluova Süt Ticaret A.Ş(Uluova Milk Trading Co.)의 지원을 받았습니다. RMD와 BMH는 유아 마이크로바이옴 복원에 중점을 둔 회사인 Evolve BioSystems의 직원입니다.