测定牛初乳中的总蛋白和生物活性蛋白浓度

牛初乳既是新生犊牛的主要营养来源，也是免疫支持。了解治疗性蛋白质（乳铁蛋白和 IgG）的水平对于牛初乳剂量和人类食用标准化非常重要。

初乳是哺乳动物在分娩后立即产生的一种复杂的生物液体。它满足新生儿的所有营养需求，是宏量和微量营养素、生物活性肽和生长因子的良好来源。牛初乳也是一种潜在的营养和生物活性来源，因为它含有丰富的蛋白质，包括免疫球蛋白 G （IgG） 和乳铁蛋白。然而，牛初乳中的乳铁蛋白和 IgG 水平在哺乳期会发生显著变化。因此，监测使用牛初乳作为蛋白质来源的 IgG 和乳铁蛋白浓度是一个需要研究的重要问题。本文中的方法描述了如何测定蛋白质含量以及乳铁蛋白和 IgG 的特定浓度。这些方法包括以下步骤：分离牛初乳蛋白， 通过 二辛可宁酸测定 （BCA） 测定蛋白质浓度， 通过 SDS-PAGE 观察蛋白质，使用 ELISA 测定乳铁蛋白和 IgG 浓度。

初乳是哺乳动物在分娩后不久产生的乳腺的初始分泌物。初乳富含常量和微量营养素、抗菌肽和生长因子 1,2,3,4。成分在过渡到成熟乳的过程中随时间逐渐变化 ^5,6,7，但在分娩后 24 小时内最为显着⁸。初乳的成分还受母体因素的影响，包括年龄、胎次、品种、健康和营养状况，以及外在因素，包括季节、早产、早乳、初乳处理因素（初乳汇集和储存温度）和诱导分娩 ^9,10,11.与成熟牛奶相比，初乳含有较少的乳糖和更多的脂肪、蛋白质、肽、非蛋白氮、灰分、激素、生长因子、细胞因子、核苷酸、维生素和矿物质¹²。牛初乳含有多种蛋白质，包括免疫球蛋白、乳铁蛋白、α-乳清蛋白 （α-LA）、β-乳球蛋白 （β-Lg）、乳过氧化物酶和几种生长因子¹³。牛初乳的总蛋白浓度在 11.26 mg/mL 和 169.55 mg/mL^{之间 14}。蛋白质含量包括平均浓度分别为 124.00 mg/mL 和 26.00 mg/mL 的乳清和酪蛋白¹⁵。乳清部分包含三种主要类型的免疫球蛋白 （Ig），即 IgG （85%-90%）、IgM （7%） 和 IgA （5%）¹⁶。牛初乳中的主要 Ig 是 IgG，它提供被动免疫并调节犊牛的适应性和先天免疫系统¹⁷。第一次挤奶牛初乳的初始 Ig 浓度范围为 20 至 200 mg/mL，并降至 0.4-1.0 mg/mL^{左右 18}。平均 IgG 浓度约为 60 mg/mL，在整个过渡到成熟乳的整个过程中稳步下降至 1 mg/mL 以下的水平¹⁹。

初乳中另一种重要的生物活性蛋白是乳铁蛋白，这是一种铁结合糖蛋白，浓度为 1.5-5 mg/mL。乳铁蛋白的特性包括增强铁吸收以及具有抗菌活性^20,21、结合脂多糖、免疫调节以及刺激肠上皮细胞和成纤维细胞的生长²²。牛初乳还含有 α-乳清蛋白和 β-乳球蛋白。这些蛋白质是必需氨基酸的来源，还具有杀菌活性 23,24,25。初乳中的平均 α-LA 和 β-Lg 浓度分别为 2.77 mg/mL² 和 11.5 mg/mL²⁶。此后，这些浓度在成熟乳中降至 1-1.5 mg/mL²⁷ 和 4.8 mg/mL²⁶。初乳还含有大量的乳过氧化物酶（平均 22.8 μg/mL）和溶菌酶（平均 0.40 μg/mL）²⁶。乳过氧化物酶是一种糖蛋白，通过产生活性氧对革兰氏阳性菌和阴性菌²⁸ 具有抗菌活性。溶菌酶通过裂解细菌细胞壁的肽聚糖成分而起到抗菌剂的作用，从而导致细胞死亡^29,30。

由于它们的特性，IgG 和乳铁蛋白被加工成不同的食品，以强化婴儿配方奶粉、食品补充剂、康复者和运动员的高蛋白制剂以及药理学和美容学 31,32,33。牛初乳是 IgG 和乳铁蛋白的重要来源。然而，牛初乳中这些生物活性蛋白的组成在哺乳期发生了显著变化。因此，监测用于研究和食品加工的初乳样品中这些生物活性蛋白浓度的变化至关重要。本研究旨在描述监测产犊后 6 天内牛初乳中总蛋白、乳铁蛋白和 IgG 浓度和组成的方法。

在 7 月至 8 月期间，从土耳其恰纳卡莱 Uluova 牛奶贸易公司的 28 头荷斯坦奶牛中收集初乳样品，在中午产犊后 6 天，并进行深度冷冻。根据每个样品的日期合并同一天收集的样品，并分析其总蛋白、乳铁蛋白和 IgG 浓度。所有样品一式两份测定。

1. 样品制备

1. 将 200 μL 牛初乳与 400 μL dH₂O 混合，以获得用于分析的稀释样品。相应地稀释所有样品。
2. 将稀释和未稀释的样品在 4 °C、1000 x g 下离心 30 分钟。
3. 将中间相分离到适当标记的新管中。重复步骤 1.2。以获得清晰的中间期。如果不立即使用，请将整个中间相和稀释的样品储存在 -20 °C 下。
4. 使用从稀释样品中获得的中间相进行 BCA、SDS-PAGE 和乳铁蛋白分析。从未稀释的样品中收集中间相用于 IgG 测定。
5. 为每个样品准备样品稀释液，以确保读数在标准曲线范围内。将从稀释样品中获得的每个中间相稀释至 1：300 用于 BCA 测定，将 1：30,000 稀释至乳铁蛋白测定，并将从未稀释样品获得的每个中间相稀释至 1：400,000 用于 IgG 测定。
   注：稀释因子根据吸光度值和标准曲线确定。

2. 使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度

1. 标准品和试剂的制备
   1. 使用市售试剂盒中提供的试剂（参见 材料表）进行检测：BCA 试剂 A，含有碳酸钠、碳酸氢钠、二辛可宁酸和酒石酸钠，溶于 0.1 M 氢氧化钠中。BCA 试剂 B 含有 4% 的硫酸铜。白蛋白 （BSA） 标准品含有 2.0 mg/mL 的牛血清白蛋白，溶于 0.9% 生理盐水和 0.05% 叠氮化钠溶液中。
   2. 将所有样品和蛋白质标准品平衡至室温 （RT）。
   3. 通过混合 50：1 比例的试剂 A：B 制备足量的工作试剂 （WR），每个样品和标准品需要 200 μL WR。
   4. 根据以下稀释方案（表 1）制备稀释白蛋白 （BSA） 标准品，其工作范围为 20-2,000 μg/mL 最终 BSA 浓度。用 dH₂O 作为稀释剂。

表 1： BSA 标准品的稀释方案。

2. BCA 检测程序
   1. 将 25 μL 每种 BCA 标准品或样品转移到 96 孔板中。向每个含孔的标准品或样品中加入 200 μL WR。在板振荡器上彻底混合板 30 秒。
   2. 用板密封剂盖住板，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。孵育后，让反应平衡至 RT 约 10 分钟。使用酶标仪及其相关软件在 562 nm 处读取每个板。
3. 生成标准曲线并确定结果
   1. 记录标准品和样品的吸光度值。稀释系列见 表 1 。从标准品和样品的每个吸光度值中减去标准空白的吸光度值。对每个标准品和样品的重复读数进行平均，以估计总蛋白质浓度。
   2. 通过在 x 轴上绘制每个标准品的校正平均吸光度，在 y 轴上绘制浓度来构建标准曲线。使用能够进行四参数曲线拟合的适当软件绘制线性曲线。
   3. 使用标准曲线通过插值每个样品对浓度的响应来确定每个样品的浓度。乘以稀释因子（步骤 1.5）以获得样品的实际浓度。

3. 使用 SDS-PAGE 检测法进行蛋白质可视化

1. 样品和溶液的制备
   1. 制备储备液
      1. 制备 10% （w/v） SDS、1.5 M Tris-HCl pH 8.3、0.5 M Tris-HCl pH 6.8、10% （w/v） 过硫酸铵 （APS） 溶液（新鲜制备）。
      2. （w/v）SDS：称取 1 g SDS 并加入 10 mL dH₂O。
      3. M Tris-HCl pH 8.8：称取 18.15 g Tris，用 ~60 mL dH₂O 溶解，用 HCl 调节至 pH 8.8，加入 dH₂O，使体积达到 100 mL。
      4. M Tris-HCl pH 6.8：称取 6.00 g Tris，用 ~60 mL dH₂O 溶解。用 HCl 调节至 pH 6.8，加入 dH₂O，使体积达到 100 mL。
      5. APS：称取 15 mg APS 并加入 150 μL dH₂O。
         注意：丙烯酰胺和 SDS 有毒有害。戴上防护手套并在引擎盖下工作。
   2. 通过将 50 μL β-巯基乙醇添加到 950 μL 2x SDS-PAGE 样品缓冲液中来制备样品缓冲液。
      注意：β-巯基乙醇吸入有毒。戴上防护手套并在引擎盖下工作。
   3. 通过将 100 mL 的 10x Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液与 900 mL 的 dH₂O 混合来制备电泳缓冲液。
   4. 准备染色溶液（45% dH₂O、45% 甲醇、10% 冰醋酸、2 g 考马斯亮蓝 R）。
   5. 准备脱色溶液（50% dH₂O、40% 甲醇、10% 冰醋酸）。
2. 凝胶的制备
   1. 准备电泳装置设备，包括凝胶盒、电源、电极和用于检测的电缆。用乙醇清洁玻璃板并组装三明治。确保玻璃板和垫片的下边缘对齐。
   2. 制备含有 3.5 mL dH₂O、2.4 mL 40% 丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺、2 mL 1.5M Tris-HCl、100 μL 10% （w/v） SDS、80 μL 10% APS、8 μL N，N，N′，N′-四甲基乙二胺 （TEMED） 的分离凝胶混合物。
      注意：TEMED 有毒和/或有刺激性。戴上防护手套并在引擎盖下工作。
   3. 将分离的凝胶混合物倒入凝胶板中，至较短板顶部下方约 1-1.5 cm 的水平。
   4. 在分离凝胶的顶部涂上异丙醇，以去除凝胶顶部的气泡并防止聚合凝胶变干。
   5. 在分离凝胶聚合至少 15 分钟后，将异丙醇倒在分离凝胶的顶部。
   6. 制备含有 1.92 mL dH₂O、300 μL 40% 丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺、750 μL 0.5M Tris-HCl、100 μL 10% （w/v） SDS、30 μL 10% APS 和 3 μL TEMED 的堆积凝胶混合物。
   7. 将浓缩胶溶液倒在分离凝胶上，使凝胶板充满。将梳子插入垫片的顶部。
   8. 让浓缩凝胶在室温下聚合约 15 分钟。
3. 电泳凝胶
   1. 将凝胶连接到电极组件上。将新鲜制备的 1x Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液添加到设备的两个腔室中。
   2. 取下梳子。
   3. 将 5 μL 分子量标准品 （10-250 kDa） 和 8 μL 稀释样品的中间相上样到凝胶孔中。在 80 V 下运行凝胶，直到染料迁移到分离凝胶中，然后增加到 120 V，直到染料到达凝胶底部。染料到达凝胶底部后关闭施加的功率。
4. 凝胶染色和脱色
   1. 电泳完成后，从设备中取出凝胶，并取下垫片和玻璃板。将凝胶放入一个小托盘中。
   2. 通过加入染色溶液（步骤 3.1.4）对凝胶进行染色 30 分钟，并以 55 rpm 轻轻摇动。
   3. 从凝胶中倒出染色溶液。用少量脱色溶液冲洗凝胶并丢弃染料。
   4. 加入足够体积的脱色溶液以覆盖凝胶，然后轻轻摇动脱色 ~1 小时，直到出现条带。

4. 使用牛乳铁蛋白 ELISA 测定乳铁蛋白浓度

1. 标准品和试剂的制备
   1. 使用市售的牛 LF/LTF/乳铁蛋白 ELISA 试剂盒进行此检测。
   2. 将所有样品和标准品平衡至 RT。
   3. 准备足够体积的检测试剂 A 和 B 工作溶液，用于与捕获的抗原结合。
   4. 分别使用检测稀释剂 A 和 B 将检测试剂 A 和 B 稀释至 1：100 的比例。
   5. 通过用 dH₂O 稀释 30x 洗涤缓冲液浓缩液来制备 1x 工作洗涤缓冲液。
   6. 将足量的 3,3′，5,5′-四甲基联苯胺 （TMB） 底物溶液放入无菌微管中。
   7. 用 0.5 mL 样品稀释剂重悬一管冻干标准品 （100 ng/mL），并在室温下轻轻搅拌孵育 10 分钟。旋转样品瓶以确保所有冻干的 sanple 都收集在底部。
   8. 根据以下稀释方案制备标准稀释系列（表 2）。

表 2： 牛乳铁蛋白标准品的稀释方案。

2. 测量牛乳铁蛋白的浓度
   1. 将 100 μL 每种乳铁蛋白标准品或样品移液到包被的 96 孔联排板中。用板密封剂盖住板以避免蒸发。在 37 °C 孵育 1 小时。
   2. 吸出每个孔的液体。向每个孔中加入 100 μL 检测试剂 A 工作溶液。用板密封剂盖住并轻轻搅拌以确保充分混合。在 37 °C 孵育 1 小时。
   3. 从每个孔中吸出液体后，加入约 350 μL 的 1x 洗涤缓冲液，洗涤 3 次。在完全吸液之前，让每次洗涤静置 1-2 分钟。最后一次洗涤后，吸出以去除任何剩余的洗涤缓冲液，然后倒置板并敲击干净的吸水纸。
   4. 向每个孔中加入 100 μL 检测试剂 B 工作溶液。用新的板封口机盖住。在 37 °C 下孵育 30 分钟。从每个孔中吸出液体，并按照步骤 4.2.3 中的说明洗涤五次。将 90 μL TMB 底物溶液放入每个孔中，并用新的板密封剂覆盖。
   5. 在 37 °C 下避光孵育 10-20 分钟。通过定期监控来检查最佳颜色。观察孔中的深蓝色包含高浓度乳铁蛋白。
   6. 向每个孔中加入 50 μL 终止液。颜色将从蓝色变为黄色。使用酶标仪及其相关软件在 450 nm 处立即测量每个孔的吸光度。
      注：轻轻敲击板以确保充分混合，直到颜色变化均匀。
3. 生成标准曲线并确定结果
   1. 按照步骤 2.3.1 进行数据生成以估计乳铁蛋白浓度。
   2. 如步骤 2.3.2 所述，通过绘制每个标准品的校正平均吸光度来构建标准曲线，但使用能够进行四参数曲线拟合的适当软件绘制多项式曲线。
   3. 如步骤 2.3.3 所述，通过将吸收值插值到生成的方程式上来计算每个样品的乳铁蛋白含量。

5. 使用牛 IgG ELISA 测定样品的 IgG 浓度

1. 标准品和试剂的制备
   1. 使用牛 IgG ELISA 试剂盒中提供的所需物品。
   2. 将所有样品和标准品平衡至 RT。
   3. 用 990 μL 酶-抗体偶联物稀释剂稀释 10 μL 辣根过氧化物酶 （HRP）-亲和素浓缩物 （100x），制备足量的工作酶-抗体偶联物溶液。
   4. 通过用 dH₂O 稀释 20x 洗涤缓冲液浓缩物来制备足够体积的 1x 洗涤缓冲液。
   5. 通过用 dH₂O 稀释 20 倍稀释剂浓缩液来制备足够体积的 1 倍稀释剂溶液。
   6. 向牛 IgG 校准品中加入 1.0 mL dH₂O，轻轻混合直至溶解。校准品的最终浓度为 123.000 ng/mL。
   7. 根据 表 3 中描述的稀释方案准备标准稀释系列。

表 3： 牛 IgG 标准品的稀释方案。

2. 牛 IgG ELISA 检测程序
   1. 将 100 μL 每种 IgG 标准品或样品移液到包被的 96 孔条板中。用板密封剂盖住板，并在 RT 下孵育 30 分钟。从每个孔中吸出液体。
   2. 用 1x 洗涤缓冲液填充孔并吸出，洗涤四次。最后一次洗涤后，吸出以去除任何残留的洗涤缓冲液，然后倒置板并敲击干净的吸水纸。向每个孔中加入 100 μL 适当稀释的酶-抗体偶联物。用板密封剂盖住并轻轻搅拌以确保充分混合。
   3. 在 RT 孵育 10 分钟。如步骤 5.2.2 所述，从孔中洗涤并去除残留的洗涤缓冲液。向每个孔中加入 100 μL TMB 底物;用新的孔板密封剂盖住。
   4. 在 RT 中孵育 10 分钟，远离光线。向每个孔中加入 100 μL 终止液以终止反应。使用酶标仪及其相关软件在 450 nm 处读取每个板。
3. 生成标准曲线并确定结果
   1. 按照数据版本的步骤 2.3.1 估计 IgG 浓度。
   2. 通过在 x 轴上绘制浓度，在 y 轴上绘制每个标准品的校正平均吸光度来构建标准曲线。使用能够进行四参数曲线拟合的适当软件绘制多项式曲线。
   3. 如步骤 2.3.3 所述，通过将吸收值插值到生成的方程式上来计算每个样品的 IgG 含量。

按照方案，分析牛初乳样品以确定蛋白质、乳铁蛋白和 IgG 浓度。牛初乳的蛋白质、乳铁蛋白和 IgG 分析结果如 表 4 所示。

表 4： 牛初乳的蛋白质、乳铁蛋白和 IgG 浓度。

这项研究提供了有关在向成熟乳过渡期间初乳中蛋白质、乳铁蛋白和 IgG 浓度发生显著变化的信息。通过夹心 ELISA 检测乳铁蛋白和 IgG 浓度的变化，并通过 BCA 测定分析总蛋白浓度。结果表明，早期初乳的蛋白质、乳铁蛋白和 IgG 浓度最高，随后在接下来的 3 天内下降。这些蛋白质的准确测量与初乳在酸奶^50,51、乳饮料和黄油

作者没有什么可披露的。

这项研究得到了 Uluova Süt Ticaret A.Ş （Uluova Milk Trading Co.） 的支持。RMD 和 BMH 是 Evolve BioSystems 的员工，该公司专注于恢复婴儿微生物组。