Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Suínos (piPSCs) em Células Progenitoras Neurais (NPCs)

Este protocolo descreve um método para diferenciação química e cultura de células progenitoras neurais derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas porcinas (piPSCs).

Os neurônios derivados de iPSC são modelos in vitro atraentes para estudar a neurogênese e as mudanças fenotípicas precoces em doenças mentais, principalmente quando a maioria dos modelos animais usados em pesquisas pré-clínicas, como roedores, não são capazes de atender aos critérios para traduzir os achados para a clínica. Primatas não humanos, caninos e suínos são considerados modelos mais adequados para fins de pesquisa biomédica e desenvolvimento de medicamentos, principalmente devido às suas semelhanças fisiológicas, genéticas e anatômicas com os humanos. O modelo suíno ganhou particular interesse na neurociência translacional, permitindo testes de segurança e alotransplante. Aqui, a geração de iPSCs suínas é descrita juntamente com sua posterior diferenciação em células progenitoras neurais (NPCs). As células geradas expressaram os marcadores NPC Nestin e GFAP, confirmados por RT-qPCR, e foram positivas para Nestin, b-Tubulin III e Vimentina por imunofluorescência. Esses resultados mostram a evidência para a geração de células NPC-like após indução in vitro com inibidores químicos de um modelo animal de grande porte, um modelo interessante e adequado para pesquisas em medicina regenerativa e translacional.

Embora muitos pesquisadores tenham como objetivo entender melhor os mecanismos celulares e o desenvolvimento patológico de doenças neurológicas em humanos, existem muitas limitações para o uso de técnicas não invasivas em humanos, como a ressonância magnética (RM), e a impossibilidade, na maioria dos casos, de aplicar técnicas invasivas, como rastreamento de trato e registro intracelular¹. Também é desafiador obter tecido cerebral post-mortem de boa qualidade, uma vez que estados agonais prolongados dos doadores podem afetar o cérebro e interferir nos estudos². Portanto, há uma necessidade de modelos animais, que têm sido utilizados há várias décadas na pesquisa translacional, sendo relevantes e questionáveis até hoje. A escolha de um modelo animal específico está se tornando uma questão central no planejamento e planejamento experimental recente, deixando claro que, para obter resultados consistentes, a seleção do modelo mais adequado requer um conhecimento profundo não apenas da fisiologia das diferentes espécies, mas também, principalmente, dos objetivos específicos da pesquisa³.

No entanto, os modelos animais frequentemente apresentam limitações ao capitular a estrutura e o desenvolvimento do cérebro humano, uma vez que possui algumas características únicas de desenvolvimento, anatômicas, moleculares e genéticas. Portanto, é um pouco difícil interpretar e extrapolar dados coletados de animais usados em pesquisas, como dados de roedores¹.

Dentre a grande variedade de modelos animais disponíveis atualmente, incluindo modelos transgênicos, alguns animais de grande porte são considerados de alto valor, como primatas não humanos, caninos e suínos⁴. As semelhanças fisiológicas, genéticas e anatômicas entre humanos e suínos em relação ao tamanho dos órgãos enfatizam a importância desses modelos no desenvolvimento de abordagens diagnósticas e terapêuticas. Especialmente, o modelo suíno ganhou particular interesse na neurociência translacional, permitindo testes de segurança e alotransplante. Tem sido usado em pesquisas relacionadas a afecções cardiovasculares, pulmonares, gastrointestinais e, em particular, para testar novas terapias (por exemplo, em estudos de medicina regenerativa com células-tronco^{5, 6}).

Nesse contexto, modelos in vitro e, mais especificamente, neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), são modelos atraentes por permitir o estudo da neurogênese e alterações fenotípicas precoces em doenças mentais, principalmente quando a maioria dos modelos animais usados em pesquisas pré-clínicas, como roedores, não são capazes de atender aos critérios para traduzir os achados para a clínica.

O uso de iPSCs tem beneficiado muito a neurociência ao permitir a modelagem de doenças in vitro, particularmente pelo uso de células progenitoras neurais (NPCs) derivadas de iPSCs, uma vez que as NPCs têm se mostrado uma ferramenta interessante para modelagem de doenças in vitro ^7,8,9. As iPSCs foram geradas com sucesso a partir de pacientes com doença de Alzheimer¹⁰, esquizofrenia¹¹ e muitas outras doenças, como doença de Parkinson, síndrome de Rett, atrofia muscular espinhal, síndrome de Down e esclerose lateral amiotrófica, conforme compilado por Mungenast e colaboradores². Sistemas de modelo animal pré-clínico também foram relatados usando NPCs derivados de iPSC como enxertos funcionais de coluna com resposta imune mínima ou nenhuma resposta imune detectada 12,13,14.

Aqui, a geração de iPSCs suínas e a diferenciação química adicional em células progenitoras neurais putativas são descritas (Figura 1 e Figura 2). As células geradas expressaram os marcadores NPC Nestin e GFAP, confirmados por RT-qPCR, e foram positivas para Nestin, β-Tubulina III e Vimentina por imunofluorescência. Esses resultados mostram a evidência da geração de células NPC-like após indução in vitro com inibidores químicos de um modelo animal de grande porte, um modelo importante e adequado para pesquisas em medicina regenerativa e translacional.

Esses experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo (nº 5130110517 e nº 4134290716).

NOTA: Todos os procedimentos que envolvem cultura celular e incubações são realizados em atmosfera controlada (38,5 °C e 20% de CO₂ no ar, umidade máxima). A passagem celular foi realizada por 5 min de incubação com reagente de dissociação e as células foram recuperadas após centrifugação (300 x g).

1. Reprogramação de fibroblastos suínos em iPSC

1. Preparação do experimento
   1. Prepare fibroblastos e 293 meios de cultura consistindo de meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 0,1 mM de aminoácidos não essenciais e 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina), salvo indicação em contrário.
   2. Prepare o meio de cultura iPSC (meio de reprogramação) consistindo de DMEM/F12 de baixa osmolalidade (otimizado para o crescimento de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas) suplementado com 20% de reposição de soro, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 1 mM de glutamina, 3,85 μM de β-mercaptoetanol, 10 ng/mL de bFGF e 1% de antibióticos.
   3. Quando necessário, semeie fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) em um frasco T75 (10 mL) para obter 70-80% de confluência no dia seguinte (aproximadamente 6 x 10⁵ por T75). No dia seguinte, inativar por uma incubação de 2 h 30 min com 200 μL de mitomicina C 0,5 mg / mL (adicionar mitomicina no T75 contendo MEFs sem alteração prévia do meio).
   4. Após o período de incubação, recuperar as células após a incubação com uma solução de dissociação durante 5 min e semear em alvéolos previamente revestidos com gelatina numa placa de 6 poços na concentração de 1x10⁵ .
   5. Cubra os poços incubando-os com uma solução de gelatina a 0,1% por 20 min a 37 ° C (aproximadamente 1 mL de solução de gelatina por poço para cobrir todo o poço) e aspire imediatamente. Em seguida, remova a solução e substitua por meio de cultura (2 mL por poço).
2. Transfecção e produção de lentivírus
   1. Cultive 293 células em frascos de cultura T75 até atingir aproximadamente 90% de confluência.
   2. Dissociar as células e semear 5 x 10⁶ células por novo balão T75 sem antibióticos.
   3. No dia seguinte, prepare duas soluções por frasco (T75) para transfecção: 1: 1,5 mL de IMDM (sem antibióticos, sem soro) com a concentração apropriada de cada vetor (12 μg de OSKM; 1,2 μg de TAT; 1,2 μg de REV; 1,2 μg de hgpm2 e 2,4 μg de VSVG_{2°geração);} e 2: 1,5 mL de IMDM (sem antibióticos, sem soro) mais 36 μL de reagente de lipofecção (ou conforme recomendação do fabricante) ¹⁵.
   4. Misture as soluções e incube por 15 min.
   5. Enquanto isso, substitua o meio das 293 células, adicionando apenas 7 mL de IMDM suplementado com 10% de FBS por frasco.
   6. Após o período de incubação, adicionar 3 ml do reagente de lipofecção + plasmídeos em cada balão. Substitua o meio por IMDM 10% FBS após 6 h (opcional).
   7. Colete o meio (volume completo - 10 mL por T75) nos pontos de tempo de 24, 48 e 72 h. Filtre-o com um filtro de PVDF de 0,45 mm e pese-o para balanceamento antes da ultracentrifugação.
   8. Centrifugue por 1 h 30 min hora a 48.960 x g.
   9. Rejeitar o sobrenadante vertendo e incubar o conteúdo restante (cerca de 200 μl) durante 1 h a 4 °C.
   10. Ressuspenda o pellet viral delicadamente pipetando para cima e para baixo várias vezes e alíquota da solução viral.
3. Transdução
   1. Semeie 2x10⁴ fibroblastos por poço de uma placa de 6 poços. Inclua poços para análise molecular (por exemplo, PCR) e controles de transdução (por exemplo, análises GFP) (opcional).
   2. No dia seguinte, remova 1 mL de meio e adicione 1 μL de brometo de hexadimétrina (8 μg/mL) e 50 μL da solução viral.
   3. Incubar por 3 a 4 h, seguido de uma troca completa do meio (2 mL) (Dia 0).
   4. Células de cultura por 5 dias, trocando de meio a cada 2 dias.
   5. Preparar previamente placas revestidas com gelatina a 0,1% e MEF, conforme descrito no ponto 1.1.3.
   6. Para dissociar as células e recolocar as células em meio de reprogramação, lave os poços usando 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remova o PBS.
   7. Adicionar 1 ml de reagente de dissociação por alvéolo e incubar as células a 37 °C durante 5 min.
   8. Transfira as células para um tubo cônico e centrifugue as células por 5 min a 300 x g e ressuspenda-as em 1-3 mL de meio de cultura iPSC.
   9. Conte as células usando uma câmara de Neubauer ou um equipamento contador de células e semeie-as em uma concentração de 1-2 x 10⁴ em poços previamente revestidos com gelatina a 0,1% e cobertos com MEFs.
   10. Troque o meio de cultura iPSC a cada 2 dias.
   11. As colônias iPSC (na passagem 0, P0) aparecerão aproximadamente 10 dias do período de reprogramação. Escolha manualmente colônias morfologicamente típicas (bordas arredondadas e células com alta relação citoplasma nuclear) usando uma agulha de 26 G para separar a colônia e os MEFs circundantes.
   12. Transferir 1 colônia por novo poço, individualmente, usando uma ponta de pipeta de 10 ou 100 μL, para cultura clonal e caracterização de linhagens celulares iPSC putativas.
4. Passagem de iPSC porcina
   1. Passagem manual e colheita de colônias
      1. Limpe e transfira um microscópio invertido para uma capela de fluxo laminar.
      2. Esterilize o microscópio com luz ultravioleta (UV) por 15 min.
      3. Lave previamente os poços revestidos com gelatina e MEF com PBS antes da transferência da colônia. Remova o PBS.
      4. Adicione 2 mL de meio iPSC.
      5. Localize a colônia de interesse no poço que será usado.
      6. Usando o bisel de uma agulha de seringa de insulina, separe a colônia das células circundantes.
      7. Se a colônia for pequena, separe-a do poço pipetando o meio para cima e para baixo em suas bordas com uma pipeta de 10 μL.
      8. Se for uma colônia maior, corte-a em alguns segmentos menores com a agulha.
      9. Aspirar a colónia ou os fragmentos da colónia com uma pipeta de 10 μL.
      10. Transfira-o para o novo poço.
   2. Passagem enzimática de linhagens clonais
      1. Lave os poços usando PBS. Remova o PBS.
      2. Adicionar 1 ml de reagente de dissociação por alvéolo e incubar as células a 37 °C durante 5 min.
      3. Transfira aproximadamente 100 μL de células para um novo poço. Essa quantidade pode variar entre diferentes linhagens celulares; portanto, a análise visual diária da confluência é altamente recomendada.

2. Indução de iPSCs suínos em NPCs

1. Preparação do experimento
   1. Prepare o Meio de Indução Neural (NIM) composto por 50% de meio neurobasal e 50% de DMEM/F-12 suplementado com B27-Minus Vitamina A (20 μL/mL), N2 (10 μL/mL), 1 mM de glutamina (10 μL/mL), penicilina-estreptomicina (1 μL/mL). Filtre a solução em um filtro de 0,22 μm e adicione o inibidor de sinalização BMP LDN193189 e o inibidor de ALK SB431542 a uma concentração final de 0,1 μM e 10 μM, respectivamente.
   2. Revestir os alvéolos de uma placa de 6 alvéolos com 1 ml de solução de matriz e incubar a 37 °C durante pelo menos 30 minutos. Remova a solução de matriz e adicione o meio E8 para a cultura de iPSCs.
   3. No dia 13 do protocolo de indução, prepare o Meio de Expansão Neural (NEM) composto por 50% de meio neurobasal e 50% de DMEM/F-12 suplementado com B27-Minus Vitamina A (20 μL/mL), N2 (10 μL/mL), NEAA (10 μL/mL), 1 mM de glutamina (10 μL/mL), penicilina-estreptomicina (1 μL/mL). Filtrar a solução num filtro de 0,22 μm e adicionar FGF2 e EGF a uma concentração final de 10 ng/ml.
2. Protocolo de indução
   1. Um dia antes de as iPSCs atingirem 100% de confluência, transfira as células para um novo poço (divisão 1:1). Lave o poço adicionando 1 mL de PBS. Remova o PBS.
   2. Adicione 1 mL de EDTA 0,5 mM e incube as células a 37 °C por 5 min.
   3. Remova o EDTA e adicione 1 mL de meio de cultura E8.
   4. Lave suavemente as células do poço e transfira o conteúdo para um novo poço previamente revestido com solução de matriz.
   5. No dia seguinte, lave os poços com PBS. Remova o PBS e adicione 2 mL de NIM.
   6. Troque o meio de indução todos os dias durante 14 dias.
   7. No dia 14, lave os poços usando PBS. Remova o PBS.
   8. Adicionar 1 ml de reagente de dissociação celular por alvéolo e incubar as células a 37 °C durante 5 min.
   9. Transfira as células para um tubo cônico e centrifugue as células por 5 min a 300 x g e ressuspenda-as em 6 mL de meio NEM.
   10. Adicione 60 μL (10 μL / mL) de uma solução de recuperação pós-descongelamento e transfira 2 mL da solução para cada poço revestido com matriz.
   11. Mude o meio NEM no dia seguinte e depois a cada dois dias.
       NOTA: Cada poço que passou pelo protocolo de indução é considerado como dando origem a uma nova linha NPC. Portanto, suas respectivas células não devem ser misturadas.

3. Passagem de NPC

1. Lave bem com 1 mL de PBS. Remova o PBS.
2. Adicione 1 ml de reagente de dissociação celular e incube as células a 37 °C durante 5 min.
3. Lave suavemente as células do poço e transfira o conteúdo para um tubo cônico.
4. Centrifugue a solução durante 5 min a 300 x g. Remova o sobrenadante e adicione 6 mL de NEM.
5. Homogeneizar suavemente o pellet e transferir 2 ml da solução para um novo poço previamente revestido com solução de matriz.

Caracterização de piPSC
A caracterização teve como objetivo determinar a aquisição de pluripotência das células reprogramadas. Para tanto, foram realizadas a formação de embrióides, a coloração por imunofluorescência para marcadores de pluripotência, a expressão gênica e a diferenciação espontânea em corpos embrióides (EBs).

As colônias de células geradas apresentaram uma morfologia plana e compacta em aglomerados de ...

Por meio desse protocolo, os fibroblastos foram reprogramados in vitro usando a expressão exógena de OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4. As células reprogramadas foram mantidas in vitro por mais de 20 passagens. Quando essas linhagens foram submetidas à diferenciação neuronal usando inibidores químicos, elas expressaram os marcadores das células progenitoras neuronais Nestin e GFAP, confirmados por RT-qPCR, e foram positivos para Nestin, β-Tubulina III ...

Os autores não têm nada a divulgar.

A Prof. Kristine Freude é reconhecida pela assistência com protocolos e discussões científicas. Este trabalho foi apoiado financeiramente por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (# 2015/26818-5, # 2017/13973-8 e # 2017/02159-8), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq # 433133/2018-0) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) (código de financiamento 001).