تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن الخنازير (piPSCs) إلى خلايا سلفية عصبية (NPCs)

يصف هذا البروتوكول طريقة للتمايز الكيميائي واستزراع الخلايا السلفية العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الخنازير (piPSCs).

الخلايا العصبية المشتقة من iPSC جذابة في نماذج المختبر لدراسة تكوين الخلايا العصبية والتغيرات المظهرية المبكرة في الأمراض العقلية, أساسا عندما تكون معظم النماذج الحيوانية المستخدمة في البحوث قبل السريرية, مثل القوارض, غير قادرة على تلبية معايير ترجمة النتائج إلى العيادة. تعتبر الرئيسيات والأنياب والخنازير غير البشرية نماذج أكثر ملاءمة لأغراض البحث الطبي الحيوي وتطوير الأدوية ، ويرجع ذلك أساسا إلى أوجه التشابه الفسيولوجية والوراثية والتشريحية مع البشر. اكتسب نموذج الخنازير اهتماما خاصا بعلم الأعصاب الانتقالي ، مما يتيح اختبار السلامة وزرع الخنازير. هنا يتم وصف جيل iPSCs الخنازير جنبا إلى جنب مع تمايزها الإضافي إلى الخلايا السلفية العصبية (الشخصيات غير القابلة للعب). عبرت الخلايا المتولدة عن علامات NPC Nestin و GFAP ، والتي أكدها RT-qPCR ، وكانت إيجابية ل Nestin و b-Tubulin III و Vimentin عن طريق التألق المناعي. تظهر هذه النتائج الدليل على توليد خلايا شبيهة ب NPC بعد الحث في المختبر مع مثبطات كيميائية من نموذج حيواني كبير ، وهو نموذج مثير للاهتمام ومناسب لأبحاث الطب التجديدي والانتقالي.

على الرغم من أن العديد من الباحثين يهدفون إلى فهم أفضل للآليات الخلوية والتطور المرضي للأمراض العصبية على البشر ، إلا أن هناك العديد من القيود على استخدام التقنيات غير الغازية على البشر مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، واستحالة ، في معظم الحالات ، تطبيق التقنيات الغازية مثل تتبع المسالك والتسجيل داخل^{الخلايا 1}. من الصعب أيضا الحصول على أنسجة دماغية بعد الوفاة ذات نوعية جيدة لأن الحالات المعاناة لفترات طويلة للمتبرعين قد تؤثر على الدماغ وتتداخل مع الدراسات². لذلك ، هناك ضرورة لأن تكون النماذج الحيوانية ، التي تم استخدامها لعدة عقود في الأبحاث الانتقالية ، ذات صلة ومشكوك فيها حتى اليوم. أصبح اختيار نموذج حيواني معين سؤالا مركزيا في التصميم والتخطيط التجريبي الحديث ، مما يوضح أنه من أجل الحصول على نتائج متسقة ، يتطلب اختيار النموذج الأنسب معرفة عميقة ليس فقط بفسيولوجيا الأنواع المختلفة ولكن أيضا الأهم من ذلك ، حول الأهداف المحددة للبحث³.

ومع ذلك ، غالبا ما تقدم النماذج الحيوانية قيودا عند الاستسلام لبنية الدماغ البشري وتطوره نظرا لأنه يحتوي على بعض السمات التنموية والتشريحية والجزيئية والوراثية الفريدة. لذلك ، من الصعب إلى حد ما تفسير واستقراء البيانات التي تم جمعها من المستخدمة في البحث ، مثل البيانات من القوارض¹.

من بين مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية المتاحة في الوقت الحاضر ، بما في ذلك النماذج المعدلة وراثيا ، تعتبر بعض الكبيرة ذات قيمة عالية ، مثل الرئيسيات غير البشرية والأنياب والخنازير⁴. تؤكد أوجه التشابه الفسيولوجية والوراثية والتشريحية بين البشر والخنازير فيما يتعلق بحجم الأعضاء على أهمية هذه النماذج في تطوير الأساليب التشخيصية والعلاجية. على وجه الخصوص ، اكتسب نموذج الخنازير اهتماما خاصا بعلم الأعصاب الانتقالي ، مما يتيح اختبار السلامة وزرع الخنازير. وقد تم استخدامه في الأبحاث المتعلقة بأمراض القلب والأوعية الدموية والرئة والجهاز الهضمي، وعلى وجه الخصوص، لاختبار علاجات جديدة (على سبيل المثال، في دراسات الطب التجديدي بالخلايا الجذعية^{5، 6}).

في هذا السياق ، تعد النماذج المختبرية ، وبشكل أكثر تحديدا الخلايا الجذعية المستحثة (iPSCs) الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية ، نماذج جذابة للسماح بدراسة تكوين الخلايا العصبية والتغيرات المظهرية المبكرة في الأمراض العقلية ، خاصة عندما تكون معظم النماذج الحيوانية المستخدمة في الأبحاث قبل السريرية ، مثل القوارض ، غير قادرة على تلبية معايير ترجمة النتائج إلى العيادة.

وقد استفاد استخدام iPSCs إلى حد كبير علم الأعصاب من خلال السماح بنمذجة الأمراض في المختبر, لا سيما عن طريق استخدام الخلايا السلفية العصبية المشتقة من iPSCs (NPC), منذ أن أظهرت الشخصيات غير القابلة للعب أن تكون أداة مثيرة للاهتمام لنمذجة الأمراض في المختبر ^7,8,9. وقد تم إنشاء iPSCs بنجاح من المرضى الذين يعانون من مرض الزهايمر¹⁰, الفصام¹¹, والعديد من الأمراض الأخرى مثل مرض باركنسون, متلازمة ريت, ضمور العضلات الشوكي, متلازمة داون, والتصلب الجانبي الضموري كما جمعت من قبل Mungenast والمتعاونين². كما تم الإبلاغ عن أنظمة النماذج الحيوانية قبل السريرية باستخدام الشخصيات غير القابلة للعب المشتقة من iPSC كترقيع وظيفي للعمود الفقري مع الحد الأدنى من الاستجابة المناعية أو عدم اكتشافها 12,13,14.

هنا, يتم وصف توليد iPSCs الخنازير ومزيد من التمايز الكيميائي إلى الخلايا السلفية العصبية المفترضة (الشكل 1 والشكل 2). عبرت الخلايا المتولدة عن علامات NPC Nestin و GFAP ، والتي تم تأكيدها بواسطة RT-qPCR ، وكانت إيجابية ل Nestin و β-Tubulin III و Vimentin عن طريق التألق المناعي. تظهر هذه النتائج دليلا على توليد خلايا شبيهة بالشخصيات غير القابلة للعب بعد الحث في المختبر مع مثبطات كيميائية من نموذج حيواني كبير ، وهو نموذج مهم ومناسب لأبحاث الطب التجديدي والانتقالي.

تمت الموافقة على هذه التجارب من قبل لجنة الأخلاقيات حول التجارب على التابعة لكلية علوم وهندسة الأغذية ، جامعة ساو باولو (أرقام التصاريح: رقم 5130110517 و رقم 4134290716).

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الاستزراع الخلوي والحضانات في جو متحكم فيه (38.5 درجة مئوية و 20٪ ثاني أكسيد الكربون_في الهواء ، الرطوبة القصوى). تم إجراء المرور الخلوي عن طريق حضانة لمدة 5 دقائق مع كاشف التفكك وتم استعادة الخلايا بعد الطرد المركزي (300 × جم).

1. إعادة برمجة الخلايا الليفية الخنازير في iPSC

1. التحضير للتجربة
   1. تحضير الخلايا الليفية و 293 وسط استزراع تتكون من وسيط Dulbecco المعدل من Iscove (IMDM) مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) ، و 0.1 ملي مولار من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 1٪ مضادات حيوية (البنسلين / الستربتومايسين) ما لم ينص على خلاف ذلك.
   2. إعداد وسط استزراع iPSC (وسط إعادة البرمجة) تتكون من انخفاض الأسمولية DMEM/F12 (الأمثل لنمو الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والمستحثة متعددة القدرات) مكملة ب 20٪ استبدال المصل, 0.1 ملي مولار الأحماض الأمينية غير الأساسية, 1 ملي الجلوتامين, 3.85 ميكرومولار β-ميركابتو إيثانول, 10 نانوغرام/مل bFGF, و 1٪ المضادات الحيوية.
   3. عند الحاجة ، قم بزرع الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) في قارورة T75 (10 مل) للحصول على التقاء 70-80٪ في اليوم التالي (حوالي 6 × 10⁵ لكل T75). في اليوم التالي ، قم بتعطيل حضانة لمدة 2 ساعة و 30 دقيقة مع 200 ميكرولتر من 0.5 مجم / مل ميتومايسين C (أضف الميتومايسين في T75 الذي يحتوي على MEFs دون تغيير مسبق للوسائط).
   4. بعد فترة الحضانة ، قم باستعادة الخلايا بعد الحضانة بمحلول تفكك لمدة 5 دقائق والبذور في الآبار المغلفة مسبقا بالجيلاتين في صفيحة 6 آبار بتركيز 1 × 10⁵ .
   5. قم بتغطية الآبار عن طريق احتضانها بمحلول جيلاتين 0.1٪ لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية (حوالي 1 مل من محلول الجيلاتين لكل بئر لتغطية البئر بأكمله) والشفط على الفور. ثم قم بإزالة المحلول واستبدله بوسط ثقافة (2 مل لكل بئر).
2. التعدي وإنتاج الفيروسات العدسية
   1. استزراع 293 خلية في قوارير ثقافة T75 حتى تصل إلى حوالي 90٪ من التقاء.
   2. فصل الخلايا والبذور 5 × 10⁶ خلايا لكل قارورة T75 جديدة بدون مضادات حيوية.
   3. في اليوم التالي ، قم بإعداد محللين لكل قارورة (T75) للتعداد: 1: 1.5 مل من IMDM (بدون مضادات حيوية ، بدون مصل) بتركيز مناسب لكل ناقل (12 ميكروغرام من OSKM ؛ 1.2 ميكروغرام من TAT ؛ 1.2 ميكروغرام من REV ؛ 1.2 ميكروغرام من hgpm2 ، و 2.4 ميكروغرام من توليد VSVG_{2 °)} ؛ و 2: 1.5 مل من IMDM (بدون مضادات حيوية ، بدون مصل) بالإضافة إلى 36 ميكرولتر من كاشف الدهون (أو على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة) ¹⁵.
   4. اخلطي المحاليل واحتضنها لمدة 15 دقيقة.
   5. وفي الوقت نفسه ، استبدل وسط 293 خلية ، مع إضافة 7 مل فقط من IMDM مع 10٪ FBS لكل قارورة.
   6. بعد فترة الحضانة ، أضف 3 مل من كاشف الشحم + البلازميدات في كل قارورة. استبدل الوسيط ب IMDM 10٪ FBS بعد 6 ساعات (اختياري).
   7. اجمع المتوسط (الحجم الكامل - 10 مل لكل T75) عند النقاط الزمنية 24 و 48 و 72 ساعة. قم بتصفيته باستخدام مرشح PVDF 0.45 مم ووزنه لتحقيق التوازن قبل الطرد المركزي الفائق.
   8. جهاز طرد مركزي لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة في الساعة عند 48,960 × جم.
   9. تخلص من المادة الطافية عن طريق صب واحتضان المحتوى المتبقي (حوالي 200 ميكرولتر) لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
   10. أعد تعليق الحبيبات الفيروسية الماصة بدقة لأعلى ولأسفل عدة مرات وتناول محلول فيروسي.
3. التنبيغ
   1. بذرة 2 × 10⁴ خلايا ليفية لكل بئر من صفيحة 6 آبار. قم بتضمين آبار للتحليل الجزيئي (مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (على سبيل المثال، التحليلات الشريكة الإجمالية) (اختياري).
   2. في اليوم التالي ، قم بإزالة 1 مل من الوسط وأضف 1 ميكرولتر من بروميد سداسي ديمترين (8 ميكروغرام / مل) و 50 ميكرولتر من المحلول الفيروسي.
   3. احتضان لمدة 3 إلى 4 ساعات ، متبوعا بتغيير متوسط كامل (2 مل) (اليوم 0).
   4. خلايا الثقافة لمدة 5 أيام ، وتغيير الوسط كل يومين.
   5. قم مسبقا بإعداد 0.1٪ من الألواح المطلية بالجيلاتين و MEF كما هو موضح في البند 1.1.3.
   6. لفصل الخلايا وإعادة طلاء الخلايا في وسط إعادة البرمجة ، اغسل الآبار باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1 مل (PBS). إزالة PBS.
   7. أضف 1 مل من كاشف التفكك لكل بئر واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   8. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي وخلايا الطرد المركزي ل 5 دقائق عند 300 × ز وإعادة تعليقها في 1-3 مل من وسط ثقافة iPSC.
   9. عد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer أو معدات عداد الخلايا وقم بزرعها بتركيز 1-2 × 10⁴ في آبار مغلفة بالجيلاتين ومغطاة ب 0.1٪ سابقا.
   10. تغيير وسيط ثقافة iPSC كل 2 أيام.
   11. مستعمرات iPSC (عند المرور 0, P0) ستظهر في تقريبا 10 أيام من فترة إعادة البرمجة. اختر المستعمرات النموذجية شكليا يدويا (الحواف المستديرة والخلايا ذات نسبة السيتوبلازم النووية العالية) باستخدام إبرة 26 جم لفصل المستعمرة وMEFs المحيطة.
   12. نقل مستعمرة واحدة لكل بئر جديد, بشكل فردي, باستخدام طرف ماصة 10 أو 100 ميكرولتر, للثقافة النسيلي وتوصيف خطوط خلايا iPSC المفترضة.
4. تمرير خنازير iPSC
   1. المرور اليدوي واختيار المستعمرة
      1. قم بتنظيف ونقل المجهر المقلوب إلى غطاء تدفق رقائقي.
      2. تعقيم المجهر بالأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 15 دقيقة.
      3. اغسل الآبار المطلية بالجيلاتين و MEF مسبقا باستخدام PBS قبل نقل المستعمرة. إزالة PBS.
      4. أضف 2 مل من وسيط iPSC.
      5. حدد موقع المستعمرة ذات الأهمية في البئر الذي سيتم استخدامه.
      6. باستخدام شطبة إبرة حقنة الأنسولين ، افصل المستعمرة عن الخلايا المحيطة.
      7. إذا كانت المستعمرة صغيرة، افصلها عن البئر عن طريق سحب المتوسط لأعلى ولأسفل حدودها باستخدام ماصة سعة 10 ميكرولتر.
      8. إذا كانت مستعمرة أكبر ، فقم بتقطيعها إلى بضع أجزاء أصغر بالإبرة.
      9. استنشق شظايا المستعمرة أو المستعمرة بماصة سعة 10 ميكرولتر.
      10. انقله إلى البئر الجديد.
   2. المرور الأنزيمي للخطوط النسيلة
      1. اغسل الآبار باستخدام PBS. إزالة PBS.
      2. أضف 1 مل من كاشف التفكك لكل بئر واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      3. انقل ما يقرب من 100 ميكرولتر من الخلايا إلى بئر جديد. قد تختلف هذه الكمية بين خطوط الخلايا المختلفة. لذلك ، يوصى بشدة بالتحليل البصري اليومي للالتقاء.

2. تحريض iPSCs الخنازير في الشخصيات غير القابلة للعب

1. التحضير للتجربة
   1. تحضير وسط الحث العصبي (NIM) المكون من 50٪ وسط عصبي القاعدي و 50٪ DMEM / F-12 مكمل ب B27 ناقص فيتامين أ (20 ميكرولتر / مل) ، N2 (10 ميكرولتر / مل) ، 1 ملي مولار جلوتامين (10 ميكرولتر / مل) ، البنسلين - الستربتومايسين (1 ميكرولتر / مل). قم بتصفية المحلول في مرشح 0.22 ميكرومتر وأضف LDN193189 مثبط إشارات BMP ومثبط ALK SB431542 بتركيز نهائي يبلغ 0.1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر على التوالي.
   2. قم بتغطية آبار صفيحة 6 آبار ب 1 مل من محلول المصفوفة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. إزالة حل المصفوفة وإضافة E8 وسيط لثقافة iPSCs.
   3. في اليوم 13 من بروتوكول الحث ، قم بإعداد وسط التمدد العصبي (NEM) المكون من 50٪ وسط عصبي القاعدي و 50٪ DMEM / F-12 مكمل ب B27-ناقص فيتامين أ (20 ميكرولتر / مل) ، N2 (10 ميكرولتر / مل) ، NEAA (10 ميكرولتر / مل) ، 1 ملي مولار جلوتامين (10 ميكرولتر / مل) ، بنسلين ستربتومايسين (1 ميكرولتر / مل). قم بتصفية المحلول في مرشح 0.22 ميكرومتر وأضف FGF2 و EGF ليكون بتركيز نهائي يبلغ 10 نانوغرام / مل.
2. بروتوكول الحث
   1. في اليوم السابق ليصل iPSCs إلى 100٪ التقاء, نقل الخلايا إلى بئر جديد (1:1 انقسام). اغسل البئر بإضافة 1 مل من PBS. إزالة PBS.
   2. أضف 1 مل من 0.5 ملي مولار EDTA واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   3. قم بإزالة EDTA وأضف 1 مل من وسط ثقافة E8.
   4. اغسل الخلايا برفق من البئر وانقل المحتويات إلى بئر جديد مغلف مسبقا بمحلول مصفوفة.
   5. في اليوم التالي ، اغسل الآبار باستخدام PBS. قم بإزالة PBS وأضف 2 مل من NIM.
   6. قم بتغيير وسيط الحث كل يوم لمدة 14 يوما.
   7. في اليوم 14 ، اغسل الآبار باستخدام PBS. إزالة PBS.
   8. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلية لكل بئر واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   9. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل وخلايا طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم وأعد تعليقها في 6 مل من وسط NEM.
   10. أضف 60 ميكرولتر (10 ميكرولتر / مل) من محلول الاسترداد بعد الذوبان وانقل 2 مل من المحلول إلى كل بئر مطلي بالمصفوفة.
   11. قم بتغيير وسيط NEM في اليوم التالي ، ثم كل يومين.
       ملاحظة: يعتبر كل بئر يخضع لبروتوكول الحث أنه يؤدي إلى ظهور خط جديد لغير الشخصيات. لذلك ، لا ينبغي خلط الخلايا الخاصة بهم.

3. مرور NPC

1. يغسل جيدا ب 1 مل من PBS. إزالة PBS.
2. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلية واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. اغسل خلايا البئر برفق وانقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي الشكل.
4. الطرد المركزي المحلول لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 6 مل من NEM.
5. قم بتجانس الحبيبات برفق ونقل 2 مل من المحلول إلى بئر جديد مغلف مسبقا بمحلول مصفوفة.

توصيف piPSC
يهدف التوصيف إلى تحديد اكتساب تعدد القدرات للخلايا المعاد برمجتها. لهذا الغرض ، تم إجراء تكوين الجنين ، وتلوين التألق المناعي لعلامات تعدد القدرات ، والتعبير الجيني والتمايز التلقائي إلى أجسام جنينية (EBs).

قدمت مستعمرات الخلايا المتول...

من خلال هذا البروتوكول ، تمت إعادة برمجة الخلايا الليفية في المختبر باستخدام التعبير الخارجي ل OCT4 و SOX2 و c-MYC و KLF4. تم الحفاظ على الخلايا المعاد برمجتها في المختبر لأكثر من 20 مقطعا. عندما تم تقديم هذه السلالات للتمايز العصبي باستخدام مثبطات كيميائية ، عبرت عن علا?...

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

تم تقدير البروفيسور كريستين فرويد للمساعدة في البروتوكولات والمناقشات العلمية. تم دعم هذا العمل ماليا من خلال منح من مؤسسة ساو باولو للأبحاث (FAPESP) (# 2015 / 26818-5 ، # 2017 / 13973-8 و # 2017 / 02159-8) ، والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq # 433133 / 2018-0) ، وتنسيق تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES) (رمز التمويل 001).