Différenciation des cellules souches pluripotentes induites porcines (piPSC) en cellules progénitrices neurales (NPC)

Ce protocole décrit une méthode de différenciation chimique et de culture de cellules progénitrices neurales dérivées de cellules souches pluripotentes induites porcines (piPSC).

Les neurones dérivés d’iPSC sont des modèles in vitro attrayants pour étudier la neurogenèse et les changements phénotypiques précoces de la maladie mentale, principalement lorsque la plupart des modèles animaux utilisés dans la recherche préclinique, tels que les rongeurs, ne sont pas en mesure de répondre aux critères permettant de transposer les résultats en clinique. Les primates non humains, les chiens et les porcins sont considérés comme des modèles plus adéquats pour la recherche biomédicale et le développement de médicaments, principalement en raison de leurs similitudes physiologiques, génétiques et anatomiques avec les humains. Le modèle porcin a suscité un intérêt particulier en neurosciences translationnelles, permettant des tests de sécurité et d’allotransplantation. Ici, la génération d’iPSC porcines est décrite ainsi que sa différenciation ultérieure en cellules progénitrices neurales (NPC). Les cellules générées ont exprimé les marqueurs NPC Nestin et GFAP, confirmés par RT-qPCR, et étaient positives pour Nestin, b-Tubuline III et Vimentin par immunofluorescence. Ces résultats montrent la preuve de la génération de cellules de type NPC après induction in vitro avec des inhibiteurs chimiques à partir d’un grand modèle animal, un modèle intéressant et adéquat pour la recherche en médecine régénérative et translationnelle.

Même si de nombreux chercheurs visent à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et le développement pathologique des maladies neurologiques chez l’homme, l’utilisation de techniques non invasives sur l’homme, comme l’imagerie par résonance magnétique (IRM), et l’impossibilité, dans la plupart des cas, d’appliquer des techniques invasives telles que le traçage des voies et^{l’enregistrement} intracellulaire1. Il est également difficile d’obtenir un tissu cérébral post-mortem de bonne qualité, car les états agonaux prolongés des donneurs peuvent affecter le cerveau et interférer avec les études². Par conséquent, il est nécessaire que les modèles animaux, qui ont été utilisés pendant plusieurs décennies dans la recherche translationnelle, soient à la fois pertinents et discutables jusqu’à aujourd’hui. Le choix d’un modèle animal particulier est en train de devenir une question centrale dans la conception et la planification expérimentales récentes, ce qui montre clairement que pour obtenir des résultats cohérents, la sélection du modèle le plus approprié nécessite une connaissance approfondie non seulement de la physiologie des différentes espèces, mais aussi, et surtout, des objectifs spécifiques de la recherche³.

Cependant, les modèles animaux présentent souvent des limites lors de la capitulation de la structure et du développement du cerveau humain, car il présente des caractéristiques développementales, anatomiques, moléculaires et génétiques uniques. Par conséquent, il est quelque peu difficile d’interpréter et d’extrapoler les données recueillies sur les animaux utilisés en recherche, telles que les données sur les rongeurs¹.

Parmi la grande variété de modèles animaux disponibles de nos jours, y compris les modèles transgéniques, certains grands animaux sont considérés comme très précieux, tels que les primates non humains, les canidés et les porcins⁴. Les similitudes physiologiques, génétiques et anatomiques entre les humains et les porcins en ce qui concerne la taille des organes soulignent l’importance de ces modèles dans le développement d’approches diagnostiques et thérapeutiques. En particulier, le modèle porcin a suscité un intérêt particulier dans les neurosciences translationnelles, permettant des tests de sécurité et d’allotransplantation. Il a été utilisé dans la recherche liée aux affections cardiovasculaires, pulmonaires et gastro-intestinales, et, en particulier, pour tester de nouvelles thérapies (par exemple, dans des études de médecine régénérative avec des cellules souches^{5, 6}).

Dans ce contexte, les modèles in vitro, et plus particulièrement les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), sont des modèles attrayants pour permettre l’étude de la neurogenèse et des changements phénotypiques précoces dans la maladie mentale, principalement lorsque la plupart des modèles animaux utilisés en recherche préclinique, tels que les rongeurs, ne sont pas en mesure de répondre aux critères pour traduire les résultats en clinique.

L’utilisation des iPSC a grandement profité aux neurosciences en permettant la modélisation des maladies in vitro, en particulier en utilisant des cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées d’iPSC, car les NPC se sont révélées être un outil intéressant pour la modélisation in vitro des maladies ^7,8,9. Des cellules souches embryonnaires ont été générées avec succès chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer¹⁰, de la schizophrénie¹¹ et de nombreuses autres maladies telles que la maladie de Parkinson, le syndrome de Rett, l’amyotrophie spinale, le syndrome de Down et la sclérose latérale amyotrophique, comme compilé par Mungenast et ses collaborateurs². Des systèmes précliniques de modèles animaux ont également été rapportés utilisant des NPC dérivés d’iPSC comme greffes de colonne vertébrale fonctionnelles avec une réponse immunitaire minimale ou nulle détectée 12,13,14.

Dans cet article, la génération d’iPSC porcines et la différenciation chimique ultérieure en cellules progénitrices neurales présumées sont décrites (Figure 1 et Figure 2). Les cellules générées ont exprimé les marqueurs NPC Nestin et GFAP, confirmés par RT-qPCR, et étaient positifs pour Nestin, β-Tubuline III et Vimentin par immunofluorescence. Ces résultats montrent la preuve de la génération de cellules de type NPC après induction in vitro avec des inhibiteurs chimiques à partir d’un grand modèle animal, un modèle important et adéquat pour la recherche en médecine régénérative et translationnelle.

Ces expériences ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de la Faculté des sciences animales et de l’ingénierie alimentaire de l’Université de São Paulo (numéros de permis : n° 5130110517 et n° 4134290716).

REMARQUE : Toutes les procédures impliquant la culture cellulaire et l’incubation sont effectuées dans une atmosphère contrôlée (38,5 °C et 20 % de CO₂ dans l’air, humidité maximale). Le passage cellulaire a été effectué par incubation de 5 minutes avec réactif de dissociation et les cellules ont été récupérées après centrifugation (300 x g).

1. Reprogrammation des fibroblastes porcins en iPSC

1. Préparation de l’expérience
   1. Préparez un fibroblaste et un milieu de culture 293 composé d’un milieu de Dulbecco modifié (IMDM) d’Iscove complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 0,1 mM d’acides aminés non essentiels et 1 % d’antibiotiques (pénicilline/streptomycine), sauf indication contraire.
   2. Préparez un milieu de culture iPSC (milieu de reprogrammation) composé de DMEM/F12 à faible osmolalité (optimisé pour la croissance de cellules souches embryonnaires humaines et pluripotentes induites) complété par 20 % de sérum de remplacement, 0,1 mM d’acides aminés non essentiels, 1 mM de glutamine, 3,85 μM de β-mercaptoéthanol, 10 ng/mL de bFGF et 1 % d’antibiotiques.
   3. Au besoin, ensemencez des fibroblastes embryonnaires de souris (FME) dans une fiole T75 (10 ml) pour obtenir une confluence de 70 à 80 % le lendemain (environ 6 x 10⁵ par T75). Le lendemain, inactiver par une incubation de 2 h 30 min avec 200 μL de mitomycine C à 0,5 mg/mL (ajouter de la mitomycine dans le T75 contenant des MEF sans changement de milieu préalable).
   4. Après la période d’incubation, récupérer les cellules après l’incubation avec une solution de dissociation pendant 5 min et les semer dans des puits préalablement enrobés de gélatine dans une plaque à 6 puits à une concentration de 1x10⁵ .
   5. Enduire les puits en les incubant avec une solution de gélatine à 0,1 % pendant 20 minutes à 37 °C (environ 1 mL de solution de gélatine par puits pour couvrir tout le puits) et aspirer immédiatement. Ensuite, retirer la solution et la remplacer par un milieu de culture (2 mL par puits).
2. Transfection et production lentivirale
   1. Cultivez 293 cellules dans des flacons de culture T75 jusqu’à ce qu’il atteigne environ 90 % de confluence.
   2. Dissocier les cellules et ensemencer 5 x 10⁶ cellules par nouveau ballon T75 sans antibiotiques.
   3. Le lendemain, préparer deux solutions par fiole (T75) pour la transfection : 1 : 1,5 mL d’IMDM (sans antibiotiques, sans sérum) avec la concentration appropriée de chaque vecteur (12 μg d’OSKM ; 1,2 μg de TAT ; 1,2 μg de REV ; 1,2 μg de hgpm2 et 2,4 μg de VSVG_{2°génération}) ; et 2 : 1,5 mL d’IMDM (sans antibiotiques, sans sérum) plus 36 μL de réactif de lipofection (ou selon les recommandations du fabricant) ¹⁵.
   4. Mélangez les solutions et laissez incuber pendant 15 min.
   5. Entre-temps, remplacez le milieu des 293 cellules, en ajoutant seulement 7 mL d’IMDM complété par 10 % de FBS par flacon.
   6. Après la période d’incubation, ajouter 3 mL de réactif de lipofection + plasmides dans chaque flacon. Remplacez le support par IMDM 10 % FBS après 6 h (facultatif).
   7. Prélever le milieu (volume complet - 10 mL par T75) aux points de temps de 24, 48 et 72 h. Filtrez-le avec un filtre PVDF de 0,45 mm et pesez-le pour l’équilibrer avant l’ultracentrifugation.
   8. Centrifugeuse pendant 1 h 30 min heure à 48 960 x g.
   9. Jeter le surnageant en le versant et incuber le reste du contenu (environ 200 μL) pendant 1 h à 4 °C.
   10. Remettre en suspension la pastille virale en pipetant délicatement de haut en bas plusieurs fois et aliquote de la solution virale.
3. Transduction
   1. Grainez 2x10⁴ fibroblastes par puits d’une plaque de 6 puits. Inclure des puits pour l’analyse moléculaire (p. ex., PCR) et les contrôles de transduction (p. ex., analyses GFP) (facultatif).
   2. Le lendemain, prélever 1 mL de milieu et ajouter 1 μL de bromure d’hexadimétrine (8 μg/mL) et 50 μL de solution virale.
   3. Incuber pendant 3 à 4 h, suivi d’un changement complet de milieu (2 ml) (jour 0).
   4. Cellules de culture pendant 5 jours, en changeant de milieu tous les 2 jours.
   5. Préparez préalablement des plaques recouvertes de gélatine à 0,1 % et des plaques MEF comme décrit à l’article 1.1.3.
   6. Pour dissocier les cellules et les replaquer dans un milieu de reprogrammation, laver les puits à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 1 mL. Supprimer PBS.
   7. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation par puits et incuber les cellules à 37 °C pendant 5 min.
   8. Transférez les cellules dans un tube conique et des cellules de centrifugation pendant 5 min à 300 x g et mettez-les en suspension dans 1 à 3 mL de milieu de culture iPSC.
   9. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre Neubauer ou d’un équipement de comptage de cellules et ensemencez-les à une concentration de 1-2 x 10⁴ dans des puits préalablement recouverts de gélatine à 0,1 % et recouverts de MEF.
   10. Changer de milieu de culture iPSC tous les 2 jours.
   11. Les colonies d’iPSC (au passage 0, P0) apparaîtront environ 10 jours après la période de reprogrammation. Prélever manuellement les colonies morphologiquement typiques (bords arrondis et cellules avec un rapport nucléaire-cytoplasme élevé) à l’aide d’une aiguille de 26 G pour détacher la colonie et les MEF environnants.
   12. Transférez 1 colonie par nouveau puits, individuellement, à l’aide d’une pointe de pipette de 10 ou 100 μL, pour la culture clonale et la caractérisation de lignées cellulaires présumées d’iPSC.
4. Passage d’iPSC porcin
   1. Passage manuel et cueillette de colonies
      1. Nettoyez et transférez un microscope inversé dans une hotte à flux laminaire.
      2. Stérilisez le microscope à la lumière ultraviolette (UV) pendant 15 min.
      3. Lavez préalablement les puits enrobés de gélatine et de MEF avec du PBS avant le transfert de la colonie. Supprimer PBS.
      4. Ajouter 2 ml de milieu iPSC.
      5. Localisez la colonie d’intérêt dans le puits qui sera utilisé.
      6. À l’aide du biseau de l’aiguille d’une seringue à insuline, séparez la colonie des cellules environnantes.
      7. Si la colonie est petite, détachez le puits en pipetant le milieu de haut en bas sur ses bords à l’aide d’une pipette de 10 μL.
      8. S’il s’agit d’une colonie plus grande, coupez-la en quelques petits segments avec l’aiguille.
      9. Aspirez la colonie ou les fragments de la colonie à l’aide d’une pipette de 10 μL.
      10. Transférez-le dans le nouveau puits.
   2. Passage enzymatique de lignées clonales
      1. Lavez les puits à l’aide de PBS. Supprimer PBS.
      2. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation par puits et incuber les cellules à 37 °C pendant 5 min.
      3. Transférez environ 100 μL de cellules dans un nouveau puits. Cette quantité peut varier d’une lignée cellulaire à l’autre ; Par conséquent, une analyse visuelle quotidienne de la confluence est fortement recommandée.

2. Induction des iPSC porcins dans les NPC

1. Préparation de l’expérience
   1. Préparez un milieu d’induction neurale (MIN) composé de 50 % de milieu neurobasal et de 50 % de DMEM/F-12 complété par de la vitamine A B27-moins (20 μL/mL), N2 (10 μL/mL), 1 mM de glutamine (10 μL/mL), pénicilline-streptomycine (1 μL/mL). Filtrez la solution dans un filtre de 0,22 μm et ajoutez l’inhibiteur de signalisation BMP LDN193189 et l’inhibiteur d’ALK SB431542 à une concentration finale de 0,1 μM et 10 μM, respectivement.
   2. Enduire les puits d’une plaque à 6 puits avec 1 mL de solution matricielle et incuber à 37 °C pendant au moins 30 minutes. Retirer la solution matricielle et ajouter le milieu E8 pour la culture des iPSC.
   3. Le 13e jour du protocole d’induction, préparer un milieu d’expansion neurale (NEM) composé de 50 % de milieu neurobasal et de 50 % de DMEM/F-12 complété par de la vitamine A moins B27 (20 μL/mL), N2 (10 μL/mL), NEAA (10 μL/mL), 1 mM de glutamine (10 μL/mL), pénicilline-streptomycine (1 μL/mL). Filtrer la solution dans un filtre de 0,22 μm et ajouter du FGF2 et de l’EGF pour obtenir une concentration finale de 10 ng/mL.
2. Protocole d’induction
   1. La veille de la confluence de 100 % des iPSC, transférez les cellules dans un nouveau puits (répartition 1:1). Lavez le puits en ajoutant 1 mL de PBS. Supprimer PBS.
   2. Ajouter 1 mL d’EDTA 0,5 mM et incuber les cellules à 37 °C pendant 5 min.
   3. Retirer l’EDTA et ajouter 1 mL de milieu de culture E8.
   4. Lavez doucement les cellules du puits et transférez le contenu dans un nouveau puits préalablement recouvert d’une solution matricielle.
   5. Le lendemain, lavez bien les puits avec du PBS. Retirer le PBS et ajouter 2 ml de NIM.
   6. Changez de milieu d’induction tous les jours pendant 14 jours.
   7. Le 14e jour, laver les puits à l’aide de PBS. Supprimer PBS.
   8. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire par puits et incuber les cellules à 37 °C pendant 5 min.
   9. Transférez les cellules dans un tube conique et des cellules de centrifugation pendant 5 min à 300 x g et mettez-les en suspension dans 6 mL de milieu NEM.
   10. Ajouter 60 μL (10 μL/mL) d’une solution de récupération après décongélation et transférer 2 mL de la solution dans chaque puits à revêtement matriciel.
   11. Changez de support NEM le lendemain, puis tous les deux jours.
       REMARQUE : Chaque puits qui est passé par le protocole d’induction est considéré comme donnant naissance à une nouvelle ligne NPC. Par conséquent, leurs cellules respectives ne doivent pas être mélangées.

3. Passage des PNJ

1. Bien laver avec 1 mL de PBS. Supprimer PBS.
2. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire et incuber les cellules à 37 °C pendant 5 min.
3. Lavez doucement les cellules du puits et transférez le contenu dans un tube conique.
4. Centrifuger la solution pendant 5 min à 300 x g. Retirer le surnageant et ajouter 6 mL de NEM.
5. Homogénéiser doucement la pastille et transférer 2 mL de la solution dans un nouveau puits préalablement recouvert d’une solution matricielle.

Caractérisation des piPSC
La caractérisation visait à déterminer l’acquisition de la pluripotence des cellules reprogrammées. À cette fin, la formation d’embryoïdes, la coloration par immunofluorescence pour les marqueurs de pluripotence, ainsi que l’expression génique et la différenciation spontanée en corps embryoïdes (EB) ont été effectuées.

Les colonies cellulaires générées présentaient une morphologie plate et c...

Grâce à ce protocole, les fibroblastes ont été reprogrammés in vitro en utilisant l’expression exogène d’OCT4, SOX2, c-MYC et KLF4. Les cellules reprogrammées ont été maintenues in vitro pendant plus de 20 passages. Lorsque ces lignées ont été soumises à la différenciation neuronale à l’aide d’inhibiteurs chimiques, elles ont exprimé les marqueurs des cellules progénitrices neuronales Nestin et GFAP, confirmés par RT-qPCR, et ...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le Prof. Kristine Freude est remercié pour l’aide apportée aux protocoles et aux discussions scientifiques. Ce travail a été soutenu financièrement par des subventions de la Fondation pour la Recherche de São Paulo (FAPESP) (# 2015/26818-5, # 2017/13973-8 et # 2017/02159-8), du Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq # 433133/2018-0), et de la Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES) (code de financement 001).