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Method Article
Ce protocole décrit une méthode de différenciation chimique et de culture de cellules progénitrices neurales dérivées de cellules souches pluripotentes induites porcines (piPSC).
Les neurones dérivés d’iPSC sont des modèles in vitro attrayants pour étudier la neurogenèse et les changements phénotypiques précoces de la maladie mentale, principalement lorsque la plupart des modèles animaux utilisés dans la recherche préclinique, tels que les rongeurs, ne sont pas en mesure de répondre aux critères permettant de transposer les résultats en clinique. Les primates non humains, les chiens et les porcins sont considérés comme des modèles plus adéquats pour la recherche biomédicale et le développement de médicaments, principalement en raison de leurs similitudes physiologiques, génétiques et anatomiques avec les humains. Le modèle porcin a suscité un intérêt particulier en neurosciences translationnelles, permettant des tests de sécurité et d’allotransplantation. Ici, la génération d’iPSC porcines est décrite ainsi que sa différenciation ultérieure en cellules progénitrices neurales (NPC). Les cellules générées ont exprimé les marqueurs NPC Nestin et GFAP, confirmés par RT-qPCR, et étaient positives pour Nestin, b-Tubuline III et Vimentin par immunofluorescence. Ces résultats montrent la preuve de la génération de cellules de type NPC après induction in vitro avec des inhibiteurs chimiques à partir d’un grand modèle animal, un modèle intéressant et adéquat pour la recherche en médecine régénérative et translationnelle.
Même si de nombreux chercheurs visent à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et le développement pathologique des maladies neurologiques chez l’homme, l’utilisation de techniques non invasives sur l’homme, comme l’imagerie par résonance magnétique (IRM), et l’impossibilité, dans la plupart des cas, d’appliquer des techniques invasives telles que le traçage des voies etl’enregistrement intracellulaire1. Il est également difficile d’obtenir un tissu cérébral post-mortem de bonne qualité, car les états agonaux prolongés des donneurs peuvent affecter le cerveau et interférer avec les études2. Par conséquent, il est nécessaire que les modèles animaux, qui ont été utilisés pendant plusieurs décennies dans la recherche translationnelle, soient à la fois pertinents et discutables jusqu’à aujourd’hui. Le choix d’un modèle animal particulier est en train de devenir une question centrale dans la conception et la planification expérimentales récentes, ce qui montre clairement que pour obtenir des résultats cohérents, la sélection du modèle le plus approprié nécessite une connaissance approfondie non seulement de la physiologie des différentes espèces, mais aussi, et surtout, des objectifs spécifiques de la recherche3.
Cependant, les modèles animaux présentent souvent des limites lors de la capitulation de la structure et du développement du cerveau humain, car il présente des caractéristiques développementales, anatomiques, moléculaires et génétiques uniques. Par conséquent, il est quelque peu difficile d’interpréter et d’extrapoler les données recueillies sur les animaux utilisés en recherche, telles que les données sur les rongeurs1.
Parmi la grande variété de modèles animaux disponibles de nos jours, y compris les modèles transgéniques, certains grands animaux sont considérés comme très précieux, tels que les primates non humains, les canidés et les porcins4. Les similitudes physiologiques, génétiques et anatomiques entre les humains et les porcins en ce qui concerne la taille des organes soulignent l’importance de ces modèles dans le développement d’approches diagnostiques et thérapeutiques. En particulier, le modèle porcin a suscité un intérêt particulier dans les neurosciences translationnelles, permettant des tests de sécurité et d’allotransplantation. Il a été utilisé dans la recherche liée aux affections cardiovasculaires, pulmonaires et gastro-intestinales, et, en particulier, pour tester de nouvelles thérapies (par exemple, dans des études de médecine régénérative avec des cellules souches5, 6).
Dans ce contexte, les modèles in vitro, et plus particulièrement les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), sont des modèles attrayants pour permettre l’étude de la neurogenèse et des changements phénotypiques précoces dans la maladie mentale, principalement lorsque la plupart des modèles animaux utilisés en recherche préclinique, tels que les rongeurs, ne sont pas en mesure de répondre aux critères pour traduire les résultats en clinique.
L’utilisation des iPSC a grandement profité aux neurosciences en permettant la modélisation des maladies in vitro, en particulier en utilisant des cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées d’iPSC, car les NPC se sont révélées être un outil intéressant pour la modélisation in vitro des maladies 7,8,9. Des cellules souches embryonnaires ont été générées avec succès chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer10, de la schizophrénie11 et de nombreuses autres maladies telles que la maladie de Parkinson, le syndrome de Rett, l’amyotrophie spinale, le syndrome de Down et la sclérose latérale amyotrophique, comme compilé par Mungenast et ses collaborateurs2. Des systèmes précliniques de modèles animaux ont également été rapportés utilisant des NPC dérivés d’iPSC comme greffes de colonne vertébrale fonctionnelles avec une réponse immunitaire minimale ou nulle détectée 12,13,14.
Dans cet article, la génération d’iPSC porcines et la différenciation chimique ultérieure en cellules progénitrices neurales présumées sont décrites (Figure 1 et Figure 2). Les cellules générées ont exprimé les marqueurs NPC Nestin et GFAP, confirmés par RT-qPCR, et étaient positifs pour Nestin, β-Tubuline III et Vimentin par immunofluorescence. Ces résultats montrent la preuve de la génération de cellules de type NPC après induction in vitro avec des inhibiteurs chimiques à partir d’un grand modèle animal, un modèle important et adéquat pour la recherche en médecine régénérative et translationnelle.
Ces expériences ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de la Faculté des sciences animales et de l’ingénierie alimentaire de l’Université de São Paulo (numéros de permis : n° 5130110517 et n° 4134290716).
REMARQUE : Toutes les procédures impliquant la culture cellulaire et l’incubation sont effectuées dans une atmosphère contrôlée (38,5 °C et 20 % de CO2 dans l’air, humidité maximale). Le passage cellulaire a été effectué par incubation de 5 minutes avec réactif de dissociation et les cellules ont été récupérées après centrifugation (300 x g).
1. Reprogrammation des fibroblastes porcins en iPSC
2. Induction des iPSC porcins dans les NPC
3. Passage des PNJ
Caractérisation des piPSC
La caractérisation visait à déterminer l’acquisition de la pluripotence des cellules reprogrammées. À cette fin, la formation d’embryoïdes, la coloration par immunofluorescence pour les marqueurs de pluripotence, ainsi que l’expression génique et la différenciation spontanée en corps embryoïdes (EB) ont été effectuées.
Les colonies cellulaires générées présentaient une morphologie plate et c...
Grâce à ce protocole, les fibroblastes ont été reprogrammés in vitro en utilisant l’expression exogène d’OCT4, SOX2, c-MYC et KLF4. Les cellules reprogrammées ont été maintenues in vitro pendant plus de 20 passages. Lorsque ces lignées ont été soumises à la différenciation neuronale à l’aide d’inhibiteurs chimiques, elles ont exprimé les marqueurs des cellules progénitrices neuronales Nestin et GFAP, confirmés par RT-qPCR, et ...
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Le Prof. Kristine Freude est remercié pour l’aide apportée aux protocoles et aux discussions scientifiques. Ce travail a été soutenu financièrement par des subventions de la Fondation pour la Recherche de São Paulo (FAPESP) (# 2015/26818-5, # 2017/13973-8 et # 2017/02159-8), du Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq # 433133/2018-0), et de la Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES) (code de financement 001).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
293FT | Invitrogen | # R70007 | |
6 well plates | Costar | # 3516 | |
anti-B-Tubulin III | abcam | # ab7751 | |
anti-NANOG | abcam | # ab77095 | |
anti-NESTIN | Millipore | # ABD69 | |
anti-OCT4 | Santa Cruz biotechnology | # SC8628 | |
anti-SOX2 | abcam | # ab97959 | |
anti-SSEA1 | Millipore | # MAB4301 | |
anti-TRA1-60 | Millipore | # MAB4360 | |
anti-VIMENTIN | abcam | # ab8069 | |
B27-Minus Vitamin A | Life Technologies | # 12587010 | |
DMEM/F-12 | Life Technologies | # 11960 | |
donkey anti-goat 488 | Invitrogen | # A11055 | |
EGF | Sigma | # E9644 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | # 10099 | |
FGF2 | Peprotech | # 100-18B | |
GlutaMAX | Gibco | # 35050-061 | |
Glutamine | Gibco | # 25030-081 | |
goat anti-mouse 594 | Invitrogen | # A21044 | |
goat anti-rabbit 488 | Invitrogen | # A11008 | |
Hexadimethrine bromide | Sigma Aldrich | # 107689 | |
HighCapacity kit | Life Technologies | # 4368814 | |
IMDM | Gibco | # 12200-036 | |
KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | # 12660-012 | |
Knockout serum replacement | Gibco | # 10828-028 | |
LDN-193189 | Sigma-Aldrich | # SML0559 | |
Leukocyte Alkaline Phosphatase kit | Sigma Aldrich | # 86R | |
Lipofectamine P3000™ | Invitrogen | # L3000-015 | |
Matrigel | Corning | # 354277 | |
Mitomycin C | Sigma Aldrich | # M4287-2MG | |
N2 | Life Technologies | # 17502048 | |
Nanodrop ND-1000 | Nanodrop Technologies, Inc. | ||
Neurobasal medium | Life Technologies | # 21103049 | |
Non-essential amino-acids | Gibco | # 11140-050 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
Revita Cell | Gibco | # A2644501 | |
Rnase out | Life Technologies | # 10777019 | |
SB431542 | Stemgent | # 72232 | |
StemPro Accutase | Gibco | # A11105-01 | |
SW28 rotor | Beckman Coulter | # 342207 | |
Trizol | Life Technologies | # 15596026 | |
TrypLE Express | Gibco | # 12604-021 | |
β-mercaptoethanol | Gibco | # 21985-023 |
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