Differenzierung von porzininduzierten pluripotenten Stammzellen (piPSCs) in neurale Vorläuferzellen (NPCs)

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur chemischen Differenzierung und Kultivierung von neuralen Vorläuferzellen, die aus porzininduzierten pluripotenten Stammzellen (piPSCs) gewonnen wurden.

iPSC-abgeleitete Neuronen sind attraktive In-vitro-Modelle , um die Neurogenese und frühe phänotypische Veränderungen bei psychischen Erkrankungen zu untersuchen, vor allem dann, wenn die meisten Tiermodelle, die in der präklinischen Forschung verwendet werden, wie z. B. Nagetiere, nicht in der Lage sind, die Kriterien für die Übertragung der Ergebnisse auf die Klinik zu erfüllen. Nicht-menschliche Primaten, Hunde und Schweine gelten als geeignetere Modelle für die biomedizinische Forschung und Arzneimittelentwicklung, vor allem aufgrund ihrer physiologischen, genetischen und anatomischen Ähnlichkeiten mit dem Menschen. Das Schweinemodell hat in den translationalen Neurowissenschaften besonderes Interesse geweckt und ermöglicht Sicherheits- und Allotransplantationstests. In dieser Arbeit wird die Erzeugung von porzinen iPSCs und ihre weitere Differenzierung zu neuralen Vorläuferzellen (NPCs) beschrieben. Die generierten Zellen exprimierten die NPC-Marker Nestin und GFAP, die durch RT-qPCR bestätigt wurden, und waren durch Immunfluoreszenz positiv für Nestin, b-Tubulin III und Vimentin. Diese Ergebnisse zeigen die Evidenz für die Generierung von NPC-ähnlichen Zellen nach in vitro Induktion mit chemischen Inhibitoren aus einem Großtiermodell, ein interessantes und adäquates Modell für die regenerative und translationale Medizinforschung.

Auch wenn viele Forscher darauf abzielen, die zellulären Mechanismen und die pathologische Entwicklung neurologischer Erkrankungen beim Menschen besser zu verstehen, gibt es viele Einschränkungen bei der Anwendung nicht-invasiver Techniken am Menschen wie der Magnetresonanztomographie (MRT) und in den meisten Fällen die Unmöglichkeit, invasive Techniken wie Traktverfolgung und intrazelluläre Aufzeichnung anzuwenden¹. Es ist auch schwierig, postmortales Hirngewebe von guter Qualität zu erhalten, da anhaltende agonale Zustände von Spendern das Gehirn beeinträchtigen und die Studien beeinträchtigen können². Daher besteht die Notwendigkeit, dass Tiermodelle, die seit mehreren Jahrzehnten in der translationalen Forschung eingesetzt werden, bis heute sowohl relevant als auch fragwürdig sind. Die Wahl eines bestimmten Tiermodells wird zu einer zentralen Frage in der jüngsten Versuchsplanung und -planung, was deutlich macht, dass die Auswahl des am besten geeigneten Modells nicht nur profunde Kenntnisse der Physiologie der verschiedenen Spezies, sondern vor allem auch der spezifischen Ziele der Forschung erfordert, um konsistente Ergebnisse zu erzielen³.

Tiermodelle weisen jedoch häufig Einschränkungen auf, wenn es darum geht, die Struktur und Entwicklung des menschlichen Gehirns zu kapitulieren, da es einige einzigartige entwicklungsbezogene, anatomische, molekulare und genetische Merkmale aufweist. Daher ist es etwas schwierig, Daten von Tieren, die in der Forschung verwendet wurden, wie z. B. Daten von Nagetieren, zu interpretieren und zu extrapolieren¹.

Unter der Vielzahl der heute verfügbaren Tiermodelle, einschließlich transgener Modelle, gelten einige Großtiere als sehr wertvoll, wie z. B. nichtmenschliche Primaten, Hunde und Schweine⁴. Die physiologischen, genetischen und anatomischen Ähnlichkeiten zwischen Mensch und Schwein in Bezug auf die Organgröße unterstreichen die Bedeutung dieser Modelle für die Entwicklung diagnostischer und therapeutischer Ansätze. Insbesondere das Schweinemodell hat in den translationalen Neurowissenschaften besonderes Interesse geweckt und ermöglicht Sicherheits- und Allotransplantationstests. Es wurde in der Forschung im Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-, Lungen- und Magen-Darm-Erkrankungen und insbesondere zur Erprobung neuer Therapien eingesetzt (z. B. in Studien der regenerativen Medizin mit Stammzellen^{5, 6}).

In diesem Zusammenhang sind In-vitro-Modelle und insbesondere von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleitete Neuronen attraktive Modelle, um die Neurogenese und frühe phänotypische Veränderungen bei psychischen Erkrankungen zu untersuchen, vor allem dann, wenn die meisten Tiermodelle, die in der präklinischen Forschung verwendet werden, wie z. B. Nagetiere, nicht in der Lage sind, die Kriterien für die Übertragung der Ergebnisse auf die Klinik zu erfüllen.

Die Verwendung von iPSCs hat den Neurowissenschaften sehr geholfen, da sie die Modellierung von Krankheiten in vitro ermöglicht hat, insbesondere durch die Verwendung von iPSCs-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPC), da sich NPCs als interessantes Werkzeug für die In-vitro-Modellierung von Krankheiten erwiesen haben ^7,8,9. iPS-Zellen wurden erfolgreich von Patienten mit Alzheimer-Krankheit¹⁰, Schizophrenie¹¹ und vielen anderen Krankheiten wie Parkinson, Rett-Syndrom, spinaler Muskelatrophie, Down-Syndrom und amyotropher Lateralsklerose generiert, wie von Mungenast und Mitarbeitern^{zusammengestellt 2}. Es wurde auch über präklinische Tiermodellsysteme berichtet, in denen iPSC-abgeleitete NPCs als funktionelle Wirbelsäulentransplantate verwendet wurden, bei denen nur eine minimale oder keine Immunantwort festgestellt wurde 12,13,14.

In dieser Arbeit wird die Erzeugung von porcinen iPSCs und die weitere chemische Differenzierung in mutmaßliche neurale Vorläuferzellen beschrieben (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die erzeugten Zellen exprimierten die NPC-Marker Nestin und GFAP, die durch RT-qPCR bestätigt wurden, und waren durch Immunfluoreszenz positiv für Nestin, β-Tubulin III und Vimentin. Diese Ergebnisse zeigen den Nachweis der Erzeugung von NPC-ähnlichen Zellen nach in vitro Induktion mit chemischen Inhibitoren aus einem Großtiermodell, einem wichtigen und adäquaten Modell für die regenerative und translationale Medizinforschung.

Diese Versuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der Fakultät für Tierwissenschaften und Lebensmitteltechnik der Universität São Paulo genehmigt (Genehmigungsnummern: Nr. 5130110517 und Nr. 4134290716).

HINWEIS: Alle Verfahren, die Zellkulturen und Inkubationen umfassen, werden in einer kontrollierten Atmosphäre (38,5 °C und 20 % CO₂ in der Luft, maximale Luftfeuchtigkeit) durchgeführt. Die zelluläre Passage wurde durch 5-minütige Inkubation mit Dissoziationsreagenz durchgeführt und die Zellen wurden nach der Zentrifugation (300 x g) gewonnen.

1. Reprogrammierung von Schweinefibroblasten in iPSC

1. Vorbereitung des Experiments
   1. Bereiten Sie Fibroblasten und 293 Nährmedien vor, bestehend aus Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % Antibiotika (Penicillin/Streptomycin), sofern nicht anders angegeben.
   2. Bereiten Sie iPSC-Kulturmedium (Reprogrammierungsmedium) vor, das aus DMEM/F12 mit niedriger Osmolalität (optimiert für das Wachstum menschlicher embryonaler und induzierter pluripotenter Stammzellen) besteht, ergänzt mit 20 % Serumersatz, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Glutamin, 3,85 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/ml bFGF und 1 % Antibiotika.
   3. Bei Bedarf embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus in einen T75-Kolben (10 ml) aussäen, um am folgenden Tag eine Konfluenz von 70-80 % zu erhalten (ca. 6 x 10⁵ pro T75). Am nächsten Tag durch eine 2 h 30 min lange Inkubation mit 200 μl 0,5 mg/ml Mitomycin C inaktivieren (Mitomycin in das T75-haltige MEF ohne vorherigen Medienwechsel geben).
   4. Nach der Inkubationszeit werden die Zellen nach der Inkubation mit einer Dissoziationslösung für 5 Minuten gewonnen und in einer 6-Well-Platte mit einer Konzentration von 1x10⁵ in die zuvor mit Gelatine beschichteten Vertiefungen ausgesät.
   5. Beschichten Sie die Vertiefungen, indem Sie sie 20 Minuten lang bei 37 °C mit einer 0,1%igen Gelatinelösung inkubieren (ca. 1 ml Gelatinelösung pro Vertiefung, um die gesamte Vertiefung abzudecken) und sofort aspirieren. Entfernen Sie dann die Lösung und ersetzen Sie sie durch Kulturmedium (2 ml pro Vertiefung).
2. Transfektion und lentivirale Produktion
   1. Kultivieren Sie 293 Zellen in T75-Kulturflaschen, bis eine Konfluenz von etwa 90 % erreicht ist.
   2. Dissoziieren Sie Zellen und säen Sie 5 x 10⁶ Zellen pro neuem T75-Kolben ohne Antibiotika aus.
   3. Am nächsten Tag bereiten Sie zwei Lösungen pro Kolben (T75) für die Transfektion vor: 1: 1,5 ml IMDM (keine Antibiotika, kein Serum) mit der entsprechenden Konzentration jedes Vektors (12 μg OSKM; 1,2 μg TAT; 1,2 μg REV; 1,2 μg hgpm2 und 2,4 μg VSVG_{2°-Erzeugung}); und 2: 1,5 ml IMDM (keine Antibiotika, kein Serum) plus 36 μl Lipofektionsreagenz (oder wie vom Hersteller empfohlen) ¹⁵.
   4. Mischen Sie die Lösungen und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang.
   5. In der Zwischenzeit wird das Medium der 293 Zellen ausgetauscht und nur 7 ml IMDM mit 10 % FBS pro Kolben hinzugefügt.
   6. Nach der Inkubationszeit werden 3 ml des Lipofektionsreagenzes + Plasmide in jeden Kolben gegeben. Ersetzen Sie das Medium nach 6 h durch IMDM 10% FBS (optional).
   7. Sammeln Sie das Medium (vollständiges Volumen - 10 mL pro T75) zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 Stunden. Filtern Sie es mit einem 0,45 mm PVDF-Filter und wiegen Sie es zum Auswuchten vor der Ultrazentrifugation.
   8. Zentrifugieren Sie 1 h 30 min Stunde bei 48.960 x g.
   9. Der Überstand wird durch Gießen verworfen und der verbleibende Inhalt (ca. 200 μl) wird 1 h lang bei 4 °C inkubiert.
   10. Resuspendieren Sie das Viruspellet, indem Sie es mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren und die Viruslösung aliquotieren.
3. Transduktion
   1. Säen Sie 2x10⁴ Fibroblasten pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. Integrieren Sie Wells für die molekulare Analyse (z. B. PCR) und Transduktionskontrollen (z. B. GFP-Analysen) (optional).
   2. Am nächsten Tag entfernen Sie 1 ml Medium und fügen Sie 1 μl Hexadimetrromid (8 μg/ml) und 50 μl der Viruslösung hinzu.
   3. 3 bis 4 Stunden inkubieren, gefolgt von einem vollständigen Medienwechsel (2 mL) (Tag 0).
   4. Zellen 5 Tage lang kultivieren, alle 2 Tage das Medium wechseln.
   5. Zuvor sind 0,1 % gelatinebeschichtete Platten und MEF-Platten wie in Punkt 1.1.3 beschrieben vorzubereiten.
   6. Um Zellen zu dissoziieren und Zellen in Reprogrammierungsmedium neu zu plattieren, waschen Sie die Vertiefungen mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie PBS.
   7. Geben Sie 1 ml Dissoziationsreagenz pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C.
   8. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 300 x g und resuspendieren Sie sie in 1-3 mL iPSC-Kulturmedium.
   9. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer oder einem Zellzähler und säen Sie sie in einer Konzentration von 1-2 x 10⁴ in zuvor 0,1 % gelatinebeschichtete und mit MEFs bedeckte Vertiefungen.
   10. Wechseln Sie das iPS-Kulturmedium alle 2 Tage.
   11. iPSC-Kolonien (bei Passage 0, P0) werden etwa 10 Tage nach Ablauf des Reprogrammierungszeitraums erscheinen. Manuelle Entnahme morphologisch typischer Kolonien (runde Kanten und Zellen mit einem hohen Kern-Zytoplasma-Verhältnis) mit einer 26-G-Nadel, um die Kolonie und die umgebenden MEFs abzulösen.
   12. 1 Kolonie pro neuer Vertiefung einzeln mit einer 10- oder 100-μl-Pipettenspitze für die klonale Kultur und Charakterisierung putativer iPSC-Zelllinien übertragen.
4. iPSC-Passing bei Schweinen
   1. Manuelles Passieren und Koloniekommissionierung
      1. Reinigen Sie ein inverses Mikroskop und übertragen Sie es in eine Laminar-Flow-Haube.
      2. Sterilisieren Sie das Mikroskop 15 Minuten lang mit ultraviolettem (UV) Licht.
      3. Waschen Sie zuvor mit Gelatine und MEF beschichtete Vertiefungen vor dem Kolonietransfer mit PBS. Entfernen Sie PBS.
      4. Fügen Sie 2 ml iPSC-Medium hinzu.
      5. Lokalisieren Sie die gewünschte Kolonie in dem Brunnen, der verwendet werden soll.
      6. Trennen Sie die Kolonie mit der Fase einer Insulinspritzennadel von den umgebenden Zellen.
      7. Wenn die Kolonie klein ist, lösen Sie sie aus der Vertiefung, indem Sie das Medium mit einer 10-μl-Pipette an den Rändern auf und ab pipettieren.
      8. Wenn es sich um ein größeres Volk handelt, schneide es mit der Nadel in ein paar kleinere Segmente.
      9. Aspirieren Sie die Kolonie oder die Fragmente der Kolonie mit einer 10-μl-Pipette.
      10. Übertragen Sie es in die neue Vertiefung.
   2. Enzymatische Passage klonaler Linien
      1. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS. Entfernen Sie PBS.
      2. Geben Sie 1 ml Dissoziationsreagenz pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C.
      3. Übertragen Sie ca. 100 μl Zellen in eine neue Vertiefung. Diese Menge kann zwischen verschiedenen Zelllinien variieren; Daher wird eine tägliche visuelle Analyse der Konfluenz dringend empfohlen.

2. Induktion von Schweine-iPSCs in NPCs

1. Vorbereitung des Experiments
   1. Bereiten Sie ein neuronales Induktionsmedium (NIM) vor, das aus 50 % neurobasalem Medium und 50 % DMEM/F-12 besteht, ergänzt mit B27-Minus Vitamin A (20 μL/ml), N2 (10 μL/ml), 1 mM Glutamin (10 μL/ml), Penicillin-Streptomycin (1 μL/ml). Die Lösung wird in einem 0,22-μm-Filter filtriert und der BMP-Signalinhibitor LDN193189 und der ALK-Inhibitor SB431542 in einer Endkonzentration von 0,1 μM bzw. 10 μM zugegeben.
   2. Die Vertiefungen einer 6-Well-Platte werden mit 1 ml Matrixlösung bestreut und mindestens 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Entfernen Sie die Matrixlösung und fügen Sie E8-Medium für die iPS-Kultur hinzu.
   3. Bereiten Sie an Tag 13 des Induktionsprotokolls ein neuronales Expansionsmedium (NEM) vor, das aus 50 % neurobasalem Medium und 50 % DMEM/F-12 besteht, ergänzt mit B27-Minus Vitamin A (20 μL/ml), N2 (10 μL/ml), NEAA (10 μL/ml), 1 mM Glutamin (10 μL/ml), Penicillin-Streptomycin (1 μL/ml). Die Lösung wird in einem 0,22-μm-Filter filtriert und FGF2 und EGF bis zu einer Endkonzentration von 10 ng/ml zugegeben.
2. Induktionsprotokoll
   1. Am Tag, bevor die iPS-Zellen eine Konfluenz von 100 % erreichen, werden die Zellen in eine neue Vertiefung überführt (1:1-Teilung). Waschen Sie die Mulde gut, indem Sie 1 ml PBS hinzufügen. Entfernen Sie PBS.
   2. Fügen Sie 1 ml 0,5 mM EDTA hinzu und inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C.
   3. Entfernen Sie EDTA und fügen Sie 1 ml E8-Nährmedium hinzu.
   4. Waschen Sie die Zellen vorsichtig aus der Vertiefung und überführen Sie den Inhalt in eine neue, zuvor mit Matrixlösung beschichtete Vertiefung.
   5. Waschen Sie die Vertiefungen am nächsten Tag mit PBS. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 2 mL NIM hinzu.
   6. Wechseln Sie das Induktionsmedium 14 Tage lang täglich.
   7. Waschen Sie die Vertiefungen an Tag 14 mit PBS. Entfernen Sie PBS.
   8. Geben Sie 1 ml Zelldissoziationsreagenz pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C.
   9. Die Zellen werden in ein konisches Röhrchen gegeben und die Zellen werden 5 min lang bei 300 x g zentrifugiert und in 6 mL NEM-Medium resuspendiert.
   10. Fügen Sie 60 μl (10 μl/ml) einer Rückgewinnungslösung nach dem Auftauen hinzu und geben Sie 2 ml der Lösung in jede matrixbeschichtete Vertiefung.
   11. Wechseln Sie das NEM-Medium am nächsten Tag und dann alle zwei Tage.
       HINWEIS: Jede Bohrung, die das Induktionsprotokoll durchlaufen hat, wird als Entstehung einer neuen NPC-Linie angesehen. Daher sollten ihre jeweiligen Zellen nicht vermischt werden.

3. NPC-Pässe

1. Gut mit 1 ml PBS waschen. Entfernen Sie PBS.
2. Fügen Sie 1 ml Zelldissoziationsreagenz hinzu und inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 37 °C.
3. Waschen Sie die Zellen vorsichtig aus der Vertiefung und geben Sie den Inhalt in ein konisches Röhrchen.
4. Die Lösung wird 5 min lang bei 300 x g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 6 mL NEM hinzu.
5. Homogenisieren Sie das Pellet vorsichtig und überführen Sie 2 ml der Lösung in eine neue, zuvor mit Matrixlösung beschichtete Vertiefung.

Charakterisierung von piPSC
Die Charakterisierung zielte darauf ab, den Erwerb der Pluripotenz der reprogrammierten Zellen zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden die Embryoidbildung, die Immunfluoreszenzfärbung für Pluripotenzmarker sowie die Genexpression und spontane Differenzierung in Embryoidkörper (EBs) durchgeführt.

Die generierten Zellkolonien wiesen eine flache, kompakte Morphologie in Zellclustern mit gut definierten Grenzen auf,...

Durch dieses Protokoll wurden Fibroblasten in vitro unter Verwendung der exogenen Expression von OCT4, SOX2, c-MYC und KLF4 reprogrammiert. Die reprogrammierten Zellen wurden in vitro für mehr als 20 Passagen konserviert. Als diese Linien der neuronalen Differenzierung mit chemischen Inhibitoren unterzogen wurden, exprimierten sie die Marker Nestin und GFAP der neuronalen Vorläuferzellen, die durch RT-qPCR bestätigt wurden, und waren durch Immunfluo...

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Prof. Kristine Freude wird für ihre Unterstützung bei Protokollen und wissenschaftlichen Diskussionen gedankt. Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch Zuschüsse der Forschungsstiftung von São Paulo (FAPESP) (# 2015/26818-5, # 2017/13973-8 und # 2017/02159-8), des Nationalen Rates für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq # 433133/2018-0) und der Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES) (Finanzierungscode 001).