돼지 유도 만능 줄기 세포(piPSC)를 신경전구세포(NPC)로 분화

이 프로토콜은 돼지 유도 만능 줄기세포(piPSC)에서 유래한 신경전구세포의 화학적 분화 및 배양 방법을 설명합니다.

iPSC 유래 뉴런은 주로 설치류와 같이 전임상 연구에 사용되는 대부분의 동물 모델이 연구 결과를 임상에 적용할 수 있는 기준을 충족할 수 없는 경우 정신 질환의 신경 발생 및 초기 표현형 변화를 연구하는 데 매력적인 체외 모델입니다. 인간이 아닌 영장류, 송곳니 및 돼지는 주로 인간과의 생리학적, 유전적, 해부학적 유사성으로 인해 생물 의학 연구 및 약물 개발 목적에 더 적합한 모델로 간주됩니다. 돼지 모델은 중개 신경 과학에서 특별한 관심을 불러일으켜 안전성 및 동종 이식 테스트를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 돼지 iPSC의 생성과 함께 신경전구세포(NPC)로의 추가 분화에 대해 설명합니다. 생성된 세포는 RT-qPCR로 확인된 NPC 마커 Nestin 및 GFAP를 발현했으며 면역형광에 의해 Nestin, b-Tubulin III 및 Vimentin에 대해 양성이었습니다. 이러한 결과는 재생 및 중개 의학 연구를 위한 흥미롭고 적절한 모델인 대형 동물 모델의 화학 억제제로 체외 유도 후 NPC 유사 세포가 생성된다는 증거를 보여줍니다.

많은 연구자들이 인간에 대한 신경 질환의 세포 메커니즘 및 병리학적 발달을 더 잘 이해하는 것을 목표로 하고 있지만, 자기공명영상(MRI)과 같은 비침습적 기술을 인간에게 사용하는 데에는 많은 제한이 있으며, 대부분의 경우 요로 추적 및 세포 내 기록과 같은 침습적 기술을 적용하는 것이 불가능합니다¹. 또한 기증자의 장기간의 고통 상태가 뇌에 영향을 미치고 연구를 방해할 수 있기 때문에 좋은 품질의 사후 뇌 조직을 얻는 것도 어렵다². 따라서 수십 년 동안 중개 연구에서 사용되어 온 동물 모델은 오늘날까지 관련성이 있고 의심스러울 필요가 있습니다. 특정 동물 모델의 선택은 최근 실험 설계 및 계획에서 핵심 질문이 되고 있으며, 일관된 결과를 얻기 위해서는 가장 적절한 모델을 선택하는 데 다양한 종의 생리학뿐만 아니라 중요하게는 연구의 특정 목표에 대한 깊은 지식이 필요하다는 것이 분명해지고 있습니다³.

그러나 동물 모델은 인간의 뇌 구조와 발달을 항복 할 때 종종 한계를 제시하는데, 이는 인간의 뇌가 독특한 발달, 해부학적, 분자적, 유전적 특징을 가지고 있기 때문입니다. 따라서 설치류¹과 같이 연구에 사용된 동물로부터 수집된 데이터를 해석하고 외삽하는 것은 다소 어렵다.

형질전환 모델을 포함하여 오늘날 사용 가능한 다양한 동물 모델 중 인간이 아닌 영장류, 송곳니 및 돼지와 같은 일부 대형 동물은 매우 가치 있는 것으로 간주됩니다⁴. 장기 크기에 관한 인간과 돼지의 생리학적, 유전적, 해부학적 유사성은 진단 및 치료 접근법을 개발하는 데 있어 이러한 모델의 중요성을 강조합니다. 특히 돼지 모델은 중개 신경 과학에서 특별한 관심을 받고 있어 안전성 및 동종 이식 테스트를 가능하게 합니다. 심혈관, 폐, 위장 질환과 관련된 연구, 특히 새로운 치료법을 테스트하는 데 사용되었습니다(예: 줄기세포를 이용한 재생 의학 연구^{5, 6}).

이러한 맥락에서, 체외 모델, 더 구체적으로 말하자면 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 뉴런은 주로 설치류와 같은 전임상 연구에 사용되는 대부분의 동물 모델이 연구 결과를 임상에 적용할 수 있는 기준을 충족할 수 없는 경우 정신 질환의 신경 발생 및 초기 표현형 변화를 연구할 수 있는 매력적인 모델입니다.

NPC는 체외 질환 모델링을 위한 흥미로운 도구인 것으로 밝혀졌기 때문에 iPSC의 사용은 특히 iPSC 유래 신경전구세포(NPC)를 사용하여 체외 질병 모델링을 가능하게 함으로써 신경 과학에 큰 도움이 되었습니다 ^7,8,9. iPSC는 알츠하이머병¹⁰, 정신분열증¹¹ 및 파킨슨병, 레트 증후군, 척수성 근위축증, 다운 증후군, 근위축성 측삭 경화증과 같은 다른 많은 질병을 앓고 있는 환자로부터 성공적으로 생성되었습니다². 전임상 동물 모델 시스템에서도 면역 반응이 최소화되거나 전혀 검출되지 않은 기능적 척추 이식편으로 iPSC 유래 NPC를 사용하는 것이 보고되었습니다 12,13,14.

본 명세서에서는 돼지 iPSC의 생성 및 추정되는 신경전구세포로의 화학적 분화가 기술되어 있습니다(그림 1 및 그림 2). 생성된 세포는 RT-qPCR로 확인된 NPC 마커 Nestin 및 GFAP를 발현했으며 면역형광에 의해 Nestin, β-Tubulin III 및 Vimentin에 대해 양성이었습니다. 이러한 결과는 재생 및 중개 의학 연구에 중요하고 적절한 모델인 대형 동물 모델의 화학 억제제로 체외 유도 후 NPC와 같은 세포가 생성되었다는 증거를 보여줍니다.

이 실험은 상파울루 대학교 동물 과학 및 식품 공학 학부의 동물 실험 윤리 위원회(허가 번호: n° 5130110517 및 n°4134290716)의 승인을 받았습니다.

참고: 세포 배양 및 배양과 관련된 모든 절차는 통제된 대기(공기 중 38.5°C 및 20% CO₂ , 최대 습도)에서 수행됩니다. 세포 계대는 해리 시약으로 5분 배양으로 수행하고, 원심분리(300 x g) 후 세포를 회수하였다.

1. 돼지 섬유아세포를 iPSC로 재프로그래밍(reprogramming)

1. 실험 준비
   1. 달리 명시되지 않는 한 10% 소 태아 혈청(FBS), 0.1mM 비필수 아미노산 및 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)가 보충된 Iscove의 Modified Dulbecco's Medium(IMDM)으로 구성된 섬유아세포 및 293 배양 배지를 준비합니다.
   2. 20% 혈청 대체, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 글루타민, 3.85μM β-메르캅토에탄올, 10ng/mL bFGF 및 1% 항생제가 보충된 저삼투압 DMEM/F12(인간 배아 및 유도 만능 줄기 세포의 성장에 최적화됨)로 구성된 iPSC 배양 배지(재프로그래밍 배지)를 준비합니다.
   3. 필요한 경우, 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 T75 플라스크(10mL)에 시딩하여 다음 날에 70-80%의 포화도를 얻습니다(T75당 약 6 x 10⁵ ). 다음 날, 200μL의 0.5mg/mL 미토마이신 C로 2시간 30분 배양하여 비활성화합니다(사전 배지 변경 없이 MEF를 포함하는 T75에 미토마이신 추가).
   4. 배양 기간이 지난 후, 5분 동안 해리 용액으로 배양 후 세포를 회수하고 1x10⁵ 농도의 6웰 플레이트에 젤라틴으로 이전에 코팅된 웰에 파종합니다.
   5. 37°C에서 0.1% 젤라틴 용액으로 20분 동안 배양하여 웰을 코팅한 후(웰 전체를 덮기 위해 웰당 약 1mL의 젤라틴 용액) 즉시 흡인합니다. 그런 다음 용액을 제거하고 배양 배지(웰당 2mL)로 교체합니다.
2. Transfection 및 Lentiviral 생산
   1. T75 배양 플라스크에서 약 90% 포화도에 도달할 때까지 293개의 세포를 배양합니다.
   2. 항생제 없이 새로운 T75 플라스크당 세포를 해리하고 5 x 10⁶ 세포를 시드합니다.
   3. 다음날, transfection을 위해 플라스크 (T75) 당 두 가지 용액을 준비합니다 : 1 : 각 벡터의 적절한 농도 (12 μg의 OSKM, 1.2 μg의 TAT; 1.2 μg의 REV; 1.2 μg의 hgpm2 및 2.4 μg의 VSVG_{2 ° generation,}); 및 2: 1.5mL의 IMDM(항생제 없음, 혈청 없음) 및 36μL의 리포펙션 시약(또는 제조업체에서 권장하는 대로) ¹⁵.
   4. 용액을 섞고 15분 동안 배양합니다.
   5. 한편, 293개 세포의 배지를 교체하고 플라스크당 10% FBS가 보충된 IMDM 7mL만 추가합니다.
   6. 배양 기간이 끝나면 각 플라스크에 3mL의 lipofection 시약 + 플라스미드를 추가합니다. 6시간 후에 매체를 IMDM 10% FBS로 교체합니다(선택 사항).
   7. 24, 48 및 72h 시점에서 배지(전체 부피 - T75당 10mL)를 수집합니다. 0.45mm PVDF 필터로 여과하고 초원심분리 전에 균형을 맞추기 위해 무게를 잰다.
   8. 48,960 x g에서 1시간 30분 동안 원심분리기.
   9. 상층액을 붓고 나머지 함량(약 200μL)을 4°C에서 1시간 동안 배양하여 상층액을 버리십시오.
   10. 바이러스 펠릿을 섬세하게 위아래로 여러 번 피펫팅하고 부분 표본 바이러스 용액을 재현탁합니다.
3. 변환
   1. 6웰 플레이트의 웰당 2x10⁴ 개의 섬유아세포를 파종합니다. 분자 분석(예: PCR) 및 형질 도입 제어(예: GFP 분석)를 위한 웰을 포함합니다(선택 사항).
   2. 다음 날, 배지 1mL를 제거하고 1μL의 헥사디메트린 브로마이드(8μg/mL)와 50μL의 바이러스 용액을 추가합니다.
   3. 3-4시간 동안 배양한 후 완전한 매체 변화(2mL)(0일차)를 합니다.
   4. 5일 동안 세포를 배양하고 2일마다 배지를 변경합니다.
   5. 이전에 항목 1.1.3에 설명된 대로 0.1% 젤라틴 코팅 및 MEF 플레이트를 준비합니다.
   6. 리프로그래밍(reprogramming) 배지에서 세포를 해리하고 재플레이플레이트하려면 1mL 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 웰을 세척합니다. PBS를 제거합니다.
   7. 웰당 1mL의 해리 시약을 추가하고 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
   8. 세포를 원뿔형 튜브로 옮기고 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리한 후 1-3mL의 iPSC 배양 배지에 재현탁합니다.
   9. Neubauer 챔버 또는 세포 계수기 장비를 사용하여 세포를 계수하고 1-2 x 10⁴ 농도로 이전에 0.1% 젤라틴 코팅 및 MEF로 덮인 웰에 파종합니다.
   10. 2일마다 iPSC 배양 배지를 교체합니다.
   11. iPSC 콜로니(통로 0, P0)는 재프로그래밍 기간의 약 10일에 나타납니다. 형태학적으로 전형적인 콜로니(둥근 가장자리와 핵-세포질 비율이 높은 세포)를 26G 바늘을 사용하여 콜로니와 주변 MEF를 수동으로 분리합니다.
   12. 클론 배양 및 추정 iPSC 세포주의 특성 분석을 위해 10 또는 100 μL 피펫 팁을 사용하여 새로운 웰당 1개의 콜로니를 개별적으로 옮깁니다.
4. 돼지 iPSC 패시징
   1. 수동 패시징 및 콜로니 피킹
      1. 도립 현미경을 청소하고 층류 후드로 옮깁니다.
      2. 현미경을 자외선(UV)으로 15분 동안 살균합니다.
      3. 콜로니 이동 전에 젤라틴과 MEF 코팅된 웰을 PBS로 미리 세척합니다. PBS를 제거합니다.
      4. iPSC 배지 2mL를 추가합니다.
      5. 사용할 우물에서 관심 식민지를 찾습니다.
      6. 인슐린 주사기 바늘의 베벨을 사용하여 주위 세포로부터 집락을 분리합니다.
      7. 군체가 작은 경우 10 μL 피펫으로 배지를 경계 위아래로 피펫팅하여 웰에서 분리합니다.
      8. 더 큰 식민지라면 바늘로 몇 개의 작은 부분으로 자릅니다.
      9. 10 μL 피펫으로 콜로니 또는 콜로니의 단편을 흡입합니다.
      10. 새 우물로 옮깁니다.
   2. 클론 세포주의 효소 전달(Enzymatic passaging of clonal line)
      1. PBS를 사용하여 우물을 씻으십시오. PBS를 제거합니다.
      2. 웰당 1mL의 해리 시약을 추가하고 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
      3. 약 100μL의 세포를 새로운 웰로 옮깁니다. 이 양은 세포주에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 매일 포화도를 시각적으로 분석하는 것이 좋습니다.

2. NPC로 돼지 iPSC 유도

1. 실험 준비
   1. B27-Minus Vitamin A(20 μL/mL), N2(10 μL/mL), 1 mM 글루타민(10 μL/mL), 페니실린-스트렙토마이신(1 μL/mL)이 보충된 50% Neurobasal 배지와 50% DMEM/F-12로 구성된 신경 유도 배지(NIM)를 준비합니다. 0.22μm 필터에서 용액을 여과하고 BMP 신호 억제제 LDN193189 및 ALK 억제제 SB431542 각각 0.1μM 및 10μM의 최종 농도로 추가합니다.
   2. 6웰 플레이트의 웰에 매트릭스 용액 1mL를 코팅하고 37°C에서 최소 30분 동안 배양합니다. 매트릭스 용액을 제거하고 iPSC 배양을 위한 E8 배지를 추가합니다.
   3. 유도 프로토콜의 13일째에 B27-마이너스 비타민 A(20μL/mL), N2(10μL/mL), NEAA(10μL/mL), 1mM 글루타민(10μL/mL), 페니실린-스트렙토마이신(1μL/mL)이 보충된 50% Neurobasal 배지와 50% DMEM/F-12로 구성된 신경 확장 배지(NEM)를 준비합니다. 0.22μm 필터에서 용액을 여과하고 FGF2 및 EGF를 10ng/mL의 최종 농도로 추가합니다.
2. 인덕션 프로토콜
   1. iPSC가 100% 포화도에 도달하기 전날, 세포를 새로운 웰(1:1 분할)로 이동합니다. PBS 1mL를 첨가하여 우물을 씻으십시오. PBS를 제거합니다.
   2. 1mL의 0.5mM EDTA를 추가하고 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
   3. EDTA를 제거하고 E8 배양 배지 1mL를 추가합니다.
   4. 웰에서 세포를 부드럽게 씻어내고 내용물을 이전에 매트릭스 용액으로 코팅된 새 웰로 옮깁니다.
   5. 다음 날, PBS로 우물을 씻으십시오. PBS를 제거하고 NIM 2mL를 추가합니다.
   6. 14일 동안 매일 유도 배지를 교체하십시오.
   7. 14일째에는 PBS를 사용하여 우물을 세척합니다. PBS를 제거합니다.
   8. 웰당 1mL의 세포 해리 시약을 추가하고 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
   9. 세포를 원뿔형 튜브로 옮기고 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리한 후 6mL의 NEM 배지에 재현탁합니다.
   10. 60 μL(10 μL/mL)의 해동 후 회수 용액을 추가하고 2 mL의 용액을 매트릭스 코팅된 각 웰로 옮깁니다.
   11. 다음날 NEM 배지를 교체하고 이후에는 이틀에 한 번씩 교체하십시오.
       참고: 유도 프로토콜을 거친 각 우물은 새로운 NPC 라인을 생성하는 것으로 간주됩니다. 따라서 각각의 세포를 혼합해서는 안 됩니다.

3. NPC 패시징

1. PBS 1mL로 잘 씻으십시오. PBS를 제거합니다.
2. 세포 해리 시약 1mL를 추가하고 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다.
3. 우물의 세포를 부드럽게 씻고 내용물을 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
4. 용액을 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 NEM 6mL를 추가합니다.
5. 펠릿을 부드럽게 균질화하고 용액 2mL를 이전에 매트릭스 용액으로 코팅된 새 웰로 옮깁니다.

piPSC의 특성화
특성화는 재프로그래밍된 세포의 다능성 획득을 결정하는 것을 목표로 했습니다. 이를 위해 배아 형성, 다능성 마커를 위한 면역형광 염색, 유전자 발현 및 배아체(EB)로의 자발적 분화를 수행했습니다.

생성된 세포 군집은 piPSC^{16, 17} 에서 예상할 수 있듯이 잘 정의된 경계를 가?...

이 프로토콜을 통해 섬유아세포는 OCT4, SOX2, c-MYC 및 KLF4의 외인성 발현을 사용하여 체외 에서 재프로그래밍되었습니다. 재프로그래밍된 세포는 20회 이상의 계대 동안 시험관 내에서 유지되었습니다. 이러한 계통을 화학적 억제제를 사용하여 신경 분화에 투여했을 때, RT-qPCR로 확인된 신경 전구 세포의 마커 Nestin 및 GFAP을 발현했으며 면역형광에...

저자는 공개할 내용이 없습니다.

Kristine Freude 교수는 프로토콜 및 과학적 토론에 도움을 준 공로를 인정받았습니다. 이 작업은 상파울루 연구 재단 (FAPESP) (# 2015 / 26818-5, # 2017 / 13973-8 및 # 2017 / 02159-8), 국립 과학 기술 개발위원회 (CNPq # 433133 / 2018-0) 및 고등 교육 인력 개선을위한 조정 (CAPES) (자금 조달 코드 001).