이 프로토콜은 배양된 뉴런의 축삭 초기 세그먼트에서 막 주기적 골격을 분해하는 것을 허용한다. 단백질의 국소화를 조사함으로써 통찰력은 막의 기능으로 주기적으로 골격을 얻을 수 있다. 이 기술의 가장 큰 장점은 견고성과 사용 편의성입니다.
구조화 된 조명 현미경은 멤브레인 주기적 골격을 해결할 수 있으며 샘플 준비는 쉽고 간단합니다. 형광 현미경에 대한 이전 경험이있는 사람은이 기술을 쉽게 구현할 수 있습니다. 이 프로토콜은 시료 준비 및 이미징 중에 신호 대 잡음비를 최대화하도록 설계되었습니다.
시작하려면 실온에서 12 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 뉴런을 고정하십시오. 커버 슬립을 포스페이트 완충 용액 중 0.2%BSA로 1회 세척하고, 실온에서 PBS 중의 트리톤 X의 1% 용액에서 10분 동안 인큐베이션한다. 커버슬립을 인산완충용액에서 BSA로 세척하고, BSA를 이용하여 항안키린 G 항체를 인산완충용액에서 하나 내지 200비로 희석한다.
표지 슬립에 항체 용액을 첨가하고 섭씨 네 도에서 밤새 인큐베이션한다. 세포를 BSA 인산염 완충 용액에서 1회 인산염 완충용액에서 0.1%Triton X에 한 번, 인산염 완충용액에서 1회 세척한다. 4 개의 태그가 붙은 플루오로를 희석하고, BSA 인산염 완충 용액에 이차 항체를 더 추가하고 커버 슬립에 첨가한다.
세포를 BSA 인산염 완충 용액에서 0.1 % Triton X에서 1 회 인산염 완충 용액으로 한 번 씻은 다음 인산염 완충 용액에서 1 회 세척하십시오. 인산염 완충 용액에 태그된 페로딘의 마이크로몰 용액 하나를 준비하고 그것을 세포에 첨가한다. 세포를 소 혈청 알부민 인산염 완충용액에서 0.1%Triton X에 1회 인산완충용액으로 한 번 세척한 다음, 인산완충용액으로 1회 세척한다.
커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착하려면 슬라이드에 장착 미디어 한 방울을 바르고 커버 슬립을 탈이온수에 담근 다음 부드러운 종이 타월로 탭하여 과도한 물을 제거하십시오. 커버 슬립을 유리 슬라이드 위에 놓고 실온에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 가능하다면 이미징 전에 현미경 검사 시설의 직원과 상담하고 침지 오일 계산기를 사용하여 샘플에 적합한 침지 오일을 선택하십시오.
샘플이 준비되면 물이나 에탄올에 담근 면봉으로 청소하여 커버 슬립이 깨끗하고 잔류 물이 없는지 확인하십시오. 샘플을 3D-SIM 현미경에 넣고 이미지를 캡처할 셀을 찾습니다. 관련 레이저 라인의 파워를 조정하십시오.
그리고 노출 시간은 시료를 크게 표백하지 않고 신호 대 잡음비를 최대화한다. 샘플의 상한과 하한을 Z 치수로 설정하고 스택 획득을 진행합니다. 스택에서 재구성 알고리즘을 실행하여 수퍼 솔렉션 재구성을 가져옵니다.
알려진 아티팩트에 대한 재구성을 확인하고 필요한 경우 매개 변수를 조정하여 수정합니다. SIM 재구성을 광역 필드 이미지와 비교하여 해상도 향상을 관찰합니다. 다색 구조화된 조명 현미경을 수행할 때는 만족스러운 재구성이 준비되면 정렬 알고리즘을 사용하여 서로 다른 채널을 올바르게 정렬합니다.
막의 주기적 골격 내의 액틴 고리는 특유의 주기적 외관을 갖는다. 액틴 링이 보이는 모든 초점 평면을 사용하여 이미지 분석 소프트웨어에서 최대 강도 프로젝션 이미지를 생성합니다. 최대 강도 프로젝션 이미지에서 눈에 보이는 인접한 링에 수직 선을 그리고 소프트웨어의 라인 플롯 프로파일 기능과 함께 형광 강도를 기록합니다.
평균 인터 피크 거리를 계산하려면 라인 프로파일에서 로컬 최대값을 기록하고 인접한 개별 형광 강도 피크 사이의 거리를 측정합니다. 막 주기적 골격에서 액틴 고리를 갖는 상이한 단백질의 공동국재화를 평가하기 위해, 액틴 및 후보 단백질의 SIM 재구성에 대한 공동국소화 분석 절차를 실행한다. 수동으로 선택 영역을 그려 축삭 초기 세그먼트를 관심 영역으로 정의하고, 소프트웨어 플랫폼에서 쉽게 공동 현지화 플러그인을 만들고, 분석을 실행하여 공동 지역화에 대한 Pearson의 상관 계수를 계산합니다.
SIM 이미지 분석 동안, 이미지 스택의 재구성은 액틴 링의 명확한 주기성을 보여주었습니다. 안키린 G.The 안키린 G와 액틴 고리의 공국소화를 가시화하기 위해 항안키린 G 항체를 사용하여 피어슨의 상관계수를 계산하기 위해 공동국재화 분석 절차를 사용하여 축삭 초기 세그먼트에서 시험하였다. 안키린 G와 액틴 고리 형광의 공국재화에 대한 피어슨의 상관계수는 0.36 플러스 또는 마이너스 0.03이었다.
올바른 침수 오일을 사용하고 레이저 파워와 노출 시간을 조정하여 그리드 라인을 볼 수 있도록하는 것이 중요합니다. 단백질이 막 주기적 골격의 일부라고 결정되면, 그 기능을 조사하고 막 주기적 골격을 유지하는 데 확립 할 수 있습니다. 예를 들어, 액틴 고리에 대한 단백질을 녹다운시키는 효과를 분석할 수 있다.
초분해능 현미경 기술의 개발은 축삭 초기 세그먼트가 액틴 고리, 스펙트럼 및 안키린으로 구성된 막 주기적 골격을 포함한다는 것을 알고있는 이유입니다. SIM을 통해 연구자들은 멤브레인 주기적 골격 구성 요소를 쉽게 시각화하고 살아있는 세포에서 액틴 고리를 볼 수있었습니다.
