LSFM 실험 및 데이터 분석은 일부를 사용 하 여 악기 서비스의 사단의 고급 광학 현미경 학계 Sinica에서 양 슈 첸 쉔의 원조 하는 것을 수행 했다. 우리는 이미징 핵심 시설의 IMB 상당한 기술 지원 Imaris 이미지 분석에서 양 슈 핑 리 감사합니다. IMB의 과학적인 영어 편집 코어 원고 검토. 이 작품은 학계 Sinica 경력 개발 상 (CDA-107-L05), 가장 (104-2311-B-001-030-MY3), 및 NHRI (NHRI-EX106-10315NC)에 의해 자금을.

모든 살아있는 동물의 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 시설, 승인 및 학계 Sinica IACUC에 의해 감독에 유지 했다.
1입니다. 고정
<ol><li>배아 하루 12.5 (E12.5)의 배아를 수집 다음 목을 벨 하 고 그들 내장을 들어낸.</li>
	<li>수정 배아 개별적으로 24-잘 접시에 1 mL/갓된 4 %paraformaldehyde 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에서의 하룻밤. 통에 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>1 x PBS의 1 mL와 함께 x, 5-10 분, 각각 고정된 배아 적어도 3를 세척 하 고 잔여 paraformaldehyde 제거를 통에 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol>2. 전체-마운트 Immunostaining
<ol><li>0.5%의 1 mL에 각 배아를 permeabilize PBS-트리톤-X-100 (PBST) 통에 4 ° C에서 하룻밤.</li>
	<li>10 %FBS 통에 4 ° C에서 하룻밤 1 x PBS에 준비의 1 mL와 함께 각 샘플을 차단 합니다.</li>
	<li>안티-GFP 1 차적인 항 체의 1 mL와 함께 태아를 품 어 (1:1, 000 희석 10 %FBS에서) 모터 신경의 GFP 신호 강화로 지속적인 떨고 72 h 4 ° C에서.</li>
	<li>1 차적인 항 체 외피 후에 0.5%의 1 mL로 씻어 0.5%를 변경 하는 한 통에 4 ° C에서 1-2 일에 걸쳐 PBST PBST 적어도 세 번.</li>
	<li>이차 항 체의 1 mL를 적용 (1:1, 000 희석 10 %FBS에서) 및 일정 한 동요와 4 ° C에서 어둠 속에서 밤새 품 어.</li>
	<li>씻어 0.5%의 1 mL와 함께 3 x 2-3 일에 걸쳐 통에 4 ° C에서 PBST. 이미징 전날까지 4 ° C에서 1 x PBS에서 샘플 계속. 참고: 배아는 개간, 배아의 일부 것입니다 몇 군데 따라 하기 전에 작은 세그먼트로 해 부 될 수 있다. 앞 발이 실험 방법 (그림 1A)에서 유지 됩니다.</li>
	<li>이미징에 대 한 투명 한 태아를 렌더링 하룻밤 실 온에서 빛에서 보호 1.5 mL 튜브에 1.49의 굴절률을 가진 상업적인 청소 시에 태아를 품 어. 참고: 개간 시 약의 볼륨은 약 5 배 샘플 볼륨의.</li>
</ol>3. LSFM (2-3 h)
<ol><li>
샘플 설정
	<ol>
<li>5 X / 0.1 설정 조명 광학 및 5 X / 0.16 감지 광학. 샘플 홀더 및 샘플 모 세관 (1.5 m m 내부 직경, 녹색)를 조립 하십시오 하 고 현미경으로 그들을 배치. 참고: 자세한 설정 절차에 대 한 현미경의 운영 설명서를 참조 하십시오.</li>
		<li>다음과 같이 태아를 탑재.<ol>
<li>그것은 모 세관의 직경에 맞도록 위쪽 부분을 멀리 절단 하 여 P200 피 펫 팁을 준비 하 고 뾰족한 부분을 제거 (~ 3 mm) 샘플 첨부 파일에 대 한.</li>
			<li>작은 불꽃을 사용 하 여 피 펫 팁의 무딘된 끝을 녹여.</li>
			<li>불꽃을 소화 하 고 신속 하 게 녹 인된 끝에 수직으로 태아를 연결 합니다.</li>
			<li>샘플 모 세관 피 펫 팁의 위쪽 부분에 맞게.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Equilibrate 파편 또는 거품을 1 분 동안 태아와 챔버 버퍼를 수 있습니다.</li>
		<li>이미징 소프트웨어를 사용 하 여 찾기 탭 아래 모 세관 찾기 를 선택 하 고 x, y, z 축 샘플 모 세관의 위치 조정.</li>
		<li>찾기 샘플 을 선택 하 고 0.6 X 배아에 초점을 확대. 군데 사지의 긴 축 (그림 1B) 두 광원의 빛 경로와 정렬 있도록 배아를 회전 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미지 수집
	<ol>
<li>인수 탭 검출 목적 등 가벼운 경로 매개 변수 정의 차단 필터, 빔 스플리터, 카메라 및 레이저 레이저. 참고: GFP 채널은이 실험에 사용 (여기 파장: 488 nm; 방출 필터: BP 505 545 nm, 빔 스플리터: SPS LP 560).</li>
		<li>그림자 감소의 피벗 스캔 확인란을 확인 하십시오.</li>
		<li>수집 설정을 정의: 비트 수준, 16 비트; 확대/축소, 0.36-0.7 X; 단일 측면 조명 (왼쪽/오른쪽) 또는 듀얼 사이드 조명.</li>
		<li>연속 을 클릭 하 고 선명한 이미지 레이저 강도, 노출 시간, 레이저 전력 및 빛 시트 위치를 설정 합니다. 참고: 레이저 전원 photodamage 최소화 하기 위해 가능한 한 낮은 유지 됩니다.</li>
		<li>이미지 수집 끝에 중지 를 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
다차원 수집
	<ol>
<li>첫 번째 및 마지막 이미지에 대 한 Z 위치를 이동 하 여 z-스택을 정의 합니다. 최적 조각 수 설정을 클릭 합니다.</li>
		<li>선택한 z-스택 얻으려고 실험 시작 을 클릭 합니다.</li>
		<li>완료 되 면.czi 형태로 이미지를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미지 처리 (선택 사항)
	<ol>
<li>듀얼 사이드 조명을 적용 하는 경우 처리 하는 Lightsheet 채널에서 듀얼 사이드 퓨전 으로 진행 합니다. Multiview 처리 하는 것은 멀티 플레이 여러 각도에서 이미지를 결합 하 여 취득 하는 경우에 필요 합니다.</li>
		<li>최대 강도 투영 채널에서 투영 축 따라 최고 강도 픽셀에서 데이터를 사용 하 여 2D 이미지를 만듭니다.</li>
		<li>복사 채널에서 원래 집합에서 이미지의 하위 집합을 선택 하려면 하위 집합 을 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 축 삭 Arborization (30 분 각 개별 신경에 대 한)의 정량화
<ol><li>영상 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 (기본적으로 XYZ 데이터를 포함 하는 이미지 오픈 Surpass 모드에서 3D 렌더링 보기).</li>
	<li>이미지 색상, 밝기, 조정 하 고 디스플레이 조정 창을 사용 하 여 대조 (편집 | 디스플레이 조정 표시) 로컬 강도 대비에 따라 필 라 멘 트 감지 하.</li>
	<li>추가 새 필 라 멘 트 아이콘을 클릭 하 고 드롭-다운 메뉴에서 Autopath (루프) 알고리즘을 선택 합니다.</li>
	<li>(이 경우 관심의 분단 축 삭)에 관심 영역을 선택 합니다. 다음 완료를 클릭 합니다.</li>
	<li>분할 모드를 사용 하 여 측정 될 수 있는 크고 얇은 직경 측정을 할당 하 여 시작 및 씨앗 포인트를 정의 합니다.</li>
	<li>관심 영역의 가장자리에 시작점을 지정 합니다. 수동으로 추가 또는 제거 시작 지점에 달성 하기 위해, 먼저 포인터 모드 변경 (탐색 | 선택) 및 다음 shift 키를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 관심의 포인트에.</li>
	<li>보이는 arborization의 모든 표시 되도록 씨 포인트에 대 한 수동 임계값을 선택 합니다. 포인터 모드 변경 (탐색 | 선택) 다음 Shift + 왼쪽 클릭 관심의 포인트에 수동으로 추가 하거나 씨앗 포인트를 제거 하 고. 참고: 그것은 이웃 신경에서 배경 소음 및 신호를 수동으로 제거 하는 것이 중요입니다.</li>
	<li>확인란 시작 지점 주변 씨앗 포인트를 제거합니다.</li>
	<li>포인트는 너무 멀리 떨어져 있으며 배경 잡음을 나타내는 수 있습니다의 배제를 허용 하도록 제거 분리 세그먼트를 확인 합니다. 제외에 대 한 상한값을 정의 하는 다음 단계에서 최대 간격 길이 나타냅니다.</li>
	<li>모든 복의 배경 강도 추정 하는 가우스 필터를 사용 하 여 배경 빼기에 대 한 임계값을 조정 합니다.</li>
	<li>대략적인 횡단면 영역 알고리즘을 사용 하 여 모 수석 직경에 대 한 자동 임계값을 설정 합니다.</li>
	<li>척추 계산에 대 한 단계는 건너뜁니다.</li>
	<li>프로세스를 완료 하 고 원하는 스타일과 색상을 선택 합니다.</li>
	<li>볼만 재건된 축 삭을 속성 에서 볼륨 상자 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>통계 탭에서 자세히를 선택 합니다. 필 라 멘 트를 사용 하 여. 모 수석 터미널 포인트 모터 축 삭 arborization의 지표로 서 모터 신경 맨끝을 계량 하기. 참고: 통계 주석을 추가할 수 있습니다 원하는 경우.</li>
	<li>.Tif 파일로 복원된 축 삭의 이미지를 내보냅니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+spinal+motor+neurons.">How to make spinal motor neurons.</a> Development. 141, 491-501 (2014).</li><li>Stifani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+the+generation+of+spinal+motor+neuron+diversity.">Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity.</a> Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).</li><li>Kania, A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+motor+projections+in+the+limb+imposed+by+LIM+homeodomain+protein+regulation+of+ephrin-A:EphA+interactions.">Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions.</a> Neuron. 38, 581-596 (2003).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+gene+Pea3+controls+the+central+position+and+terminal+arborization+of+specific+motor+neuron+pools.">ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools.</a> Neuron. 35, 877-892 (2002).</li><li>Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+diversity+in+development+and+disease.">Motor neuron diversity in development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).</li><li>Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Nerve+Arborization+Requires+Proteolytic+Domain+of+Damage-Induced+Neuronal+Endopeptidase+(DINE)+during+Development.">Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development.</a> J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).</li><li>Nagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECEL1+mutation+implicates+impaired+axonal+arborization+of+motor+nerves+in+the+pathogenesis+of+distal+arthrogryposis.">ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis.</a> Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).</li><li>Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+Proteins+Coordinate+Motor+Neuron+Differentiation+and+Connectivity+Programs+through+Ret/Gfralpha+Genes.">Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes.</a> Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).</li><li>Bonanomi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ret+is+a+multifunctional+coreceptor+that+integrates+diffusible-+and+contact-axon+guidance+signals.">Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals.</a> Cell. 148, 568-582 (2012).</li><li>Tung, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir-17+approximately+92+Governs+Motor+Neuron+Subtype+Survival+by+Mediating+Nuclear+PTEN.">Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.</a> Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).</li><li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists.">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nat Methods. 12, 30-34 (2015).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>Hanley, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+Pbx-Dependent+Pathways+Govern+the+Coalescence+and+Fate+of+Motor+Columns.">Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns.</a> Neuron. 91, 1005-1020 (2016).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+motor+neuron+pool+identity+and+muscle+nerve+trajectory+defined+by+postmitotic+restrictions+in+Nkx6.1+activity.">Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity.</a> Neuron. 57, 217-231 (2008).</li><li>Li, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+filters+Hox+temporal+transcription+noise+to+confer+boundary+formation+in+the+spinal+cord.">MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14685 (2017).</li><li>Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet-based+fluorescence+microscopy+for+three-dimensional+imaging+of+biological+samples.">Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).</li><li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+whole-embryo+imaging:+a+quantitative+transition+is+underway.">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).</li><li>Reynaud, E. G., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+first+light+sheet+based+fluorescence+microscopy+workshop.">Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop.</a> Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).</li></ol>

저자는 공개 없다.

프로토콜의 여러 단계 특정 상황에서 변화에 대상이 될 수 있습니다. 예를 들어 고정 기간의 2 h에서 1 이상의 일 갓 만든 paraformaldehyde를 사용 하 여 다양 한 태아의 나이에 따라 달라 집니다. 고정 단백질 가교에 민감한 항 체에 대 한 전체 마운트 immunostaining 이전 실시 이후 메탄올 대체 통 요원으로 사용할 수 있습니다. 얼룩에 높은 신호 대 잡음 비율, 그것은 세제 농도 최적화 하는 데 필요한 (사?...

중앙 신경의 일부인 척수 MNs 하지만 이동을 컨트롤 하기 위해 주변 근육을 자극. 개발 척수에서 미네소타 창시자 (pMNs) notochord 그리고 인접 한 somites에서 나오는 신호에 따라 설정 됩니다. 모든 포스트 mitotic MNs 분화 다음 pMNs, 결국 척수1,2의 rostrocaudal 축 미네소타의 일련에 기한에서 생성 됩니다. 척추 MNs 지형학과 해부학 잘 구성 되어 있습니다. 그들의 형태학 배열 주변3에 그들의 각각 대상의 위치와 상관 한다. 그들의 근육 목표에 도달, axons 수신 확장 하 고 분기 하도록 유도 하는 세포와 외 인 neurotrophic 요인 근육으로. 신경 분포 및 분기 결함 neuromuscular 접속점 (NMJ)를 형성 하는 실패에 기여할 수 있습니다. 예를 들어 폐해 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF)-유도 Pea3은 축 삭 arborization 피부 막시무스 (CM)에 대 한 필수 및 latissimus dorsi (LD) 근육4,5. 또한, 식사 녹아웃 마우스 배아 탄생6,7직후 호흡 실패 및 사망률을 일으키는 횡 경 막에 인할지 신경의 결함 arborization를 표시 합니다. 따라서, 미네소타 성숙 (즉, axonal 프로젝션 및 분기)의이 마지막 단계가 신경 세포와 대상 세포 간의 통신을 보장 하기 위해 중요 합니다.
Arborization 패턴을 보려면, 연구자는 일반적으로 confocal 영상 또는 sectioned 또는 전체 마운트 샘플8,,910의 2 광자 형광 가벼운 현미경 검사 법 실시. 현미경 검사 법 기술을 둘 다 생성 허용 해상도 깊이 침투 합니다. 2-광자 형광 가벼운 현미경 검사 법11두 낮은 에너지 광자 동시 흡수 fluorophores의 흥분을 포함 한다. 두 광자 여기 근처-적외선 방사선을 사용 하 여, 이후 감소 여기 주파수 감소 산란 및 1 m m 더 큰 깊이 가진 이미징 되므로 조직에서에서 더 나은 조직 침투에 기여 한다. Confocal 현미경 검사 법 제거 필터 초점 아웃 신호 및만12초점 비행기 내에서 빛을 수집 합니다. 이 방식으로 Z-스택 기능을 통해 3 차원 (3D) 이미지를 생성 하 다른 초점 비행기에서 샘플의 이미지를 결합 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 신호 강도 빛의 대부분을 차단 하 고 높은 수치 apertures 모호한 필드의 깊이 감소 된다. 더 중요 한 것은, 두 기법 때문에 하나의 비행기는 주어진된 시간에 촬영 하는 경우에 전체 표본 조명 받는 심각한 photodamage 및 phototoxicity에 기여 한다.
이러한 단점을 우회 되 고 빠른, 빛 효율의 장점을 선호 대안 및 더 적은 phototoxic13,14LSFM 되고있다. 또한, LSFM 분할 영상이 있습니다. 이 방식은 모터 축 삭 및 그들의 분산 터미널을 시각화 하는 그들은 3D 공간을 통해 확산에 특히 적합 합니다. LSFM 샘플 수직 축과 x, y 및 z 축을 따라 움직임 회전을 허용 하는 단계에 탑재 되어 있기 때문에 다른 두 가지 옵션을 능가. 이 설정 뿐만 아니라 둘 다 요구 플랫 슬라이드 샘플 장착 샘플의 최소 차단된 보기 뿐만 아니라 바람직한 조명 경로, 2 광자 고 confocal 현미경 검사 법의 단점에 대 한 선택 수 있습니다. 따라서, LSFM는 마우스 배아에 있는 모터 신경 맨끝의 정량화 및 축 삭 arborization의 3D 영상에 대 한 가장 적합 한 도구입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hb9::GFP</td>
			<td>The Jackson labortory</td>
			<td>005029</td>
			<td>Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep polyclonal anti-GFP</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>4745-1051</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11015</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear 1.47 clearing reagent</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>RC147001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml micro tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 wells plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 SA Tweezer</td>
			<td>ideal-tek</td>
			<td>3480641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors striaght sharp/sharp</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BC110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery Scalpels, single use</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BA365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>TKS</td>
			<td>RS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightsheet Z.1 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.0 image analysis software</td>
			<td>Bitplane, Zurich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of motor axon navigation and quantification of axon arborization in mouse embryos using light sheet fluorescence microscopy

척추 모터 신경 (MNs) 확장 운동과 척추 동물에서 복잡 한 작업을 제어 함으로써 그들의 innervating 목표와 의사 소통을 그들의 축 삭. 따라서, 어떻게 모터 축 삭으로 이동, arborize, 그리고 그들의 주변 근육을 자극을 개발 및 변성 동안 대상의 분자 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 축 삭 터미널 arborization의 전체 스펙트럼에 대 한 자세한 설명은 남아 패턴 복잡성 때문에 불완전 한 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 라인 모터 축 삭 궤도 배아 개발 하는 동안 시각화를 오래 해 왔으나, 비록 고 현재 광학 현미경 검사 법의 제한입니다. 여기, 우리는 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 및 질적 및 양적 시각화 모터 축 삭을 개발 하기 위해 강력한 이미지 분석을 결합 하 여 향상 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 시스템은 교차 하는 유전 돌연변이 또는 Hb9::GFP 라인, 모터 축 삭 탐색 및 arborization 결함으로 이어질 새로운 분자 메커니즘을 드러내는 미네소타 질병 모델에 쉽게 채택 될 수 있습니다.

LSFM 배아를 마우스에서 미네소타 궤도 및 축 삭 arborization의 상세한 3D 시각화를 제공합니다. 밝은 필드 아래에서 조직 상업 개간 시 약에 몰입 되 고 후 완전히 투명 하 게 나타납니다. 수축 또는 샘플의 붓기는 이미징 하기 전에 시 약을 지우기에 스토리지의 최대 1 주일 후 발견 되었다. 형광 채널에서 모터 뉴런 transgenically 표현된 GFP (영화 1)으로 표시 되어 있?...

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Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.6K 조회수.  National Defense Medical Center. 여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

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Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is very poor 1. The failure of axon regeneration is a combined result of several factors including the hostile glial cell environment, inhibitory myelin related molecules and decreased intrinsic neuron regenerative capacity 2. Astrocytes are the most predominant glial cell type in central nervous system and play important role in axon functions under physiology and pathology conditions 3. Contrast to the homologous oligodendrocytes, astrocytes are a heterogeneous cell population composed by different astrocyte subpopulations with diverse morphologies and gene expression 4. The functional significance of this heterogeneity, such as their influences on axon growth, is largely unknown.
To study the glial cell, especially the function of astrocyte heterogeneity in neuron behavior, we established a new method by co-culturing high purified dorsal root ganglia neurons with glial cells obtained from the rat cortex. By this technique, we were able to directly compare neuron adhesion and axon growth on different astrocytes subpopulations under the same condition.
In this report, we give the detailed protocol of this method for astrocytes isolation and culture, dorsal root ganglia neurons isolation and purification, and the co-culture of DRG neurons with astrocytes. This method could also be extended to other brain regions to study cellular or regional specific interaction between neurons and glial cells.

In this protocol, we described a new method to study the influence of glial cell heterogeneity on axon growth with an in vitro co-culture system. Rat cortical glial cells were cultured to confluence and cocultured with highly purified rat dorsal root ganglia neurons. Different glial cell influence on neurons adhesion and axon growth was compared directly in the same culture. This method provides a new way to directly study the glial cell heterogeneity influence on neuron adhesion and axon growth.

새 Coculture 방법을 사용 액슨 성장에 대한 연구 Glial 세포 이질 영향

In the central nervous system of all mammals, severed axons after injury are unable to regenerate to their original targets and functional recovery is ...

연구

신경과학

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

드로소필라 멜라노가스터에서 축사 사망 시축과 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...