使用3D结构照明显微镜（3D-SIM）测量轴突初始段的膜周期性骨架的性质

该协议允许解析培养神经元轴突初始片段中的膜周期性骨架。通过检查蛋白质的定位，可以获得对膜周期性骨骼中功能的洞察力。这种技术的主要优点是其坚固性和易用性。

结构化照明显微镜能够分辨膜周期性骨架，样品制备简单明了。任何具有荧光显微镜经验的人都可以很容易地实现这种技术。该协议旨在最大限度地提高样品制备和成像过程中的信噪比。

首先，在室温下使用4%多聚甲醛固定神经元12分钟。在磷酸盐缓冲溶液中将盖玻片在0.2%BSA中洗涤一次，并在室温下在PBS中在1%的Triton X溶液中孵育10分钟。在磷酸盐缓冲溶液中用BSA洗涤盖玻片，在磷酸盐缓冲溶液中以1比200的比例使用BSA稀释抗强直剂G抗体。

将抗体溶液加入盖玻片中，并在四摄氏度下孵育过夜。在磷酸盐缓冲液中洗涤细胞一次，在磷酸盐缓冲溶液中的0.1%Triton X中洗涤一次，在磷酸盐缓冲溶液中洗涤一次。稀释荧光4标记，在BSA磷酸盐缓冲液中加入更多的二抗并添加到盖玻片中。

在磷酸盐缓冲溶液中洗涤细胞一次，在磷酸盐缓冲溶液中0.1%Triton X中洗涤一次，然后在磷酸盐缓冲溶液中洗涤一次。在磷酸盐缓冲溶液中制备标记的Ferodin的一微摩尔溶液，并将其添加到细胞中。在牛血清磷酸白蛋白缓冲液中洗涤细胞一次，在磷酸盐缓冲溶液中的0.1%Triton X中洗涤一次，然后在磷酸盐缓冲溶液中洗涤一次。

要将盖玻片安装在载玻片上，请在载玻片上滴上一滴安装介质，将盖玻片浸入去离子水中，然后用柔软的纸巾轻拍以除去多余的水分。将盖玻片放在载玻片上，并在室温下孵育24小时。如果可能，请在成像前咨询显微镜设备的人员，并使用浸油计算器选择适合样品的浸油。

样品准备就绪后，用浸入水或乙醇的棉签清洁盖玻片，确保盖玻片清洁并清除任何残留物。将样品置于3D-SIM显微镜中，找到细胞以捕获图像。调整相关激光线的功率。

并且曝光时间最大化了信噪比，而不会明显漂白样品。在 Z 维度中设置样品的上限和下限，然后继续获取堆栈。在堆栈上运行重构算法，获取超解析重构。

检查重建中是否有已知的伪影，如有必要，请调整参数以更正它们。将 SIM 重建与宽视场图像进行比较，以观察分辨率的提高。在执行多色结构照明显微镜检查时，一旦准备好令人满意的重建，请使用对齐算法正确对齐不同的通道。

膜周期性骨架中的肌动蛋白环具有独特的周期性外观。使用可见肌动蛋白环的所有焦平面在图像分析软件中创建最大强度投影图像。在最大强度投影图像上，在可见的相邻环上绘制一条垂直线，并记录荧光强度以及软件的线图轮廓功能。

要计算平均峰间距离，请注意线轮廓中的局部最大值，并测量单个相邻荧光强度峰之间的距离。为了评估膜周期性骨架中具有肌动蛋白环的不同蛋白质的共定位，请对肌动蛋白和候选蛋白的SIM重建运行共定位分析程序。手动绘制一个选择，将轴突初始段定义为感兴趣的区域，以便在软件平台中使用简单的共定位插件，并运行分析以计算共定位的Pearson相关系数。

在SIM图像分析过程中，图像堆栈的重建显示出肌动蛋白环的明显周期性。使用抗ankyrin G抗体可视化ankyrin G.使用共定位分析程序在轴突初始片段中测试了ankyrin G和肌动蛋白环的共定位，以计算Pearson的相关系数。皮尔逊对ankyrin G和肌动蛋白环荧光共定位的相关系数为0.36加或减0.03。

必须使用正确的浸油并调整激光功率和曝光时间，以使网格线可见。一旦确定蛋白质是膜周期性骨架的一部分，就可以研究并建立其维持膜周期性骨架的功能。例如，可以分析敲低蛋白质对肌动蛋白环的影响。

超分辨率显微镜技术的发展是我们知道轴突初始片段包含由肌动蛋白环，光谱和ankyrin组成的膜周期性骨架的原因。SIM使研究人员能够轻松可视化膜周期性骨骼成分，并观察活细胞中的肌动蛋白环。