연구 추진 하는 사업 (F Q를 수 여. Z.) NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), 크레이그 H. Neilsen 재단 및 BrightFocus 재단.

모든 동물 실험 동물 프로토콜 존스 홉킨스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인에 따라 수행 했다.
1. 재료 및 시 약
<ol><li>
동물
	<ol>
<li>6 주 된 여성 CF1 쥐 실험에 대 한 30-35 g의 무게를 사용 합니다. 참고: 쥐 그룹 보관 (5 쥐 감 금 소 당) 1/4"옥수수 옥수수 속 침구와 2" 광장 nestlets 중첩에 대 한 개별적으로 통풍이 소독 장에 있었다. 감 금 소 제어 12 h 빛 어두운 주기의 유지 되었다 그리고 실내 온도 19.4 ° C와 25 ° C 사이 생쥐는 글로벌 설치류 다이어트와 시스템을 공급 하는 자동 물 먹이 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
악기
	<ol>
<li>다음과 같은 수술 도구를 사용 하 여 효율적으로 수술을 실시: 일회용 주사기 (27 G, 1.0 mL) 복 주입, 클리퍼, 스테레오 해 부 현미경, 마이크로 수술 집게, 마이크로 수술이 위, 그리고 작은 뼈 rongeurs 모피 그리고 소독된 직 스폰지입니다. 참고: 모든 악기와 자료는 수술 전에 압력가 또는 생산자에 의해 전 멸 균. 수술 동안 악기 75% 알코올 살 균을 유지 하기 위해 뿌리는.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마 취 솔루션
	<ol>
<li>마 취 솔루션 # 1을 사용 하 여 마 취 유도 및 DRG 주입 하기 전에 마 취 솔루션 # 2를 사용 하 여 마 취를 유지.<ol>
<li>마 취 솔루션 # 1을 하려면 마 취 제 및 xylazine 10 mg/mL 및 1.2 mg/mL의 최종 농도에 멸 균 식 염 수에 희석.</li>
			<li>마 취 솔루션 # 2을 하려면 avertin 20 mg/mL의 최종 농도에 멸 균 식 염 수에 희석.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
플라스 미드 DNA 및 RNA Oligos
	<ol>
<li>따라 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 키트를 사용 하 여 플라스 미드를 준비 합니다. 플라스 미드 DNAs 2.0 µ g / µ L의 농도에 살 균 이온된 수에 희석.</li>
		<li>0.005-0.01의 최종 농도 도달 빨리 녹색 염료 솔루션 추가 % (v/v) 주입 중 DRG 개요의 더 나은 시각화.</li>
		<li>최종 농도 50 µ M에 도달 하는 제조사에서 제공 하는 해당 버퍼에 siRNA 또는 예측에 관한 oligos을 디졸브.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마이크로 주입 피 펫
	<ol>
<li>당겨 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 모 세관 유리 하 고 미세가 위는 대략 50 µ m 외부 직경으로 개방을 생성 하기 위해 가져온된 모 세관 유리 피 펫의 끝을 잘라. 다음 약 20-30 분 동안 깨끗 한 벤치에 UV 빛에서 유리 피 펫을 살 균.</li>
		<li>멸 균된 유리 피 펫 피 펫 홀더에 세포내 microinjection에 연결 하는 마운트 시스템을 분배. 30 psi의 압력 및 기간 8 ms에서 microinjection 시스템의 매개 변수를 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroporation 시스템
	<ol>
<li>구형 파 electroporation 시스템에 전극을 연결 하 고 다음 매개 변수를 설정: electroporation 비보에 대 한 950 ms 간격 35 V 15 ms 펄스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
관류 및 솔루션을 해결
	<ol>
<li>1 x 4% (w/v)의 농도에 PBS에 paraformaldehyde (PFA) 분말을 용 해. 4 ° c.에 PFA 솔루션 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 실험 절차
<ol><li>
L4 그리고 L5 Drg의 외과 노출
	<ol>
<li>마 취 솔루션 #1 이전 (와 케 타 민 100 mg/kg 몸 무게 xylazine 12 mg/kg 체중) 준비의 복 주사를 사용 하 여 마우스 anesthetize</li>
		<li>털 깎기로 외과 영역을 면도. 참고: 왼쪽된 좌 골 신경 호감에 대 한 다른 수술 될 것입니다, 이후 왼쪽된 후부 허벅지의 모피 수 있습니다 수 면도 동시에.</li>
		<li>열띤된 담요 (35.0 ° C)에 마우스를 놓고 온도 프로브와 직장 온도 모니터링 합니다.</li>
		<li>마 취를 테스트 하려면 발가락과 마우스의 꼬리를 꼬 집 고 행동 반응 관찰.</li>
		<li>코르크 판에서 마우스의 4 개의 사지를 테이프.</li>
		<li>외과 영역을 iodophor 솔루션 그리고 피부를 절단 하기 전에 iodophor 제거 하려면 75% 알코올로 닦아냅니다.</li>
		<li>마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.</li>
		<li>절 개를 하기 전에 좋은 마커 펜으로 장 골 볏의 양쪽 모두를 표시 합니다. L5 Drg의 위치 식별 용이 하 장 골 볏의 두 점을 연결 하는 선을 그립니다.</li>
		<li>마이크로-가 위 낮은 뒤로의 중간 선 따라 3cm 절 개를 확인 합니다. 또한, paraspinous 근육 생쥐 multiﬁdus 등 생쥐 longissimus lumborum S1 spinous 프로세스, L3에서 분리 하 고 L4-5와 L5-6의 패싯 관절을 노출.</li>
		<li>L4-5와 L5-6의 패싯 관절을 제거 하는 마이크로-rongeur를 사용 합니다. 또한, L4 및 L5는 Drg의 등 쪽 노출의 왼쪽된 신경 아치를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DRG 주입
	<ol>
<li>주입 마 취 솔루션 #2 (200 mg/kg 몸 무게 avertin) DRG 주입 하기 전에 마 취를 유지 하는 것을 intraperitoneally.</li>
		<li>유리 모 세관 피 펫에 플라스 미드 DNA 또는 RNA oligos (DRG 당 1 µ L)를 로드 합니다.</li>
		<li>신중 하 게는 DRG에 모 세관 유리 피 펫의 끝을 삽입 합니다.</li>
		<li>점차적으로 삽입 DNA 플라스 미드의 1.0 µ L 솔루션 또는 세포내 microinjection를 사용 하 여 DRG에 RNA oligos 분배 시스템 (30 psi, 8 ms). 참고: 주사의 지속 시간 5 분 이상 지 속해야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroporation
	<ol>
<li>전극의 팁에 PBS를 드롭.</li>
		<li>멸 균된 평방 면 거 즈와 출혈 정리.</li>
		<li>부드럽게 전극과 대상 DRG를 꼬 집으 십시오 고 electroporation 시스템 5 사각 전기 펄스를 적용 합니다.</li>
		<li>근육과 피부 레이어 각각 5-0 나일론 봉합을 닫습니다.</li>
		<li>그것은 완전히 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 세심 한 관심 아래 온수 담요 (35.0 ° C)에 마우스를 놓습니다. 후 마 취에서 완전히 복구는 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다. 참고: 마우스를 37 ° C 담요에 마 취에서 완전히 복구에 대 한 약 60 분 소요 됩니다. 수술 후 통증 완화를 매일 먹이 대 한 1000 ml 물 (0.2 mg/ml)로 1 알 (200mg)이 부 프로펜을 디졸브.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
좌 골 신경 호감
	<ol>
<li>(실험 설계)에 따라 2 ~ 3 일 후에 DRG electroporation 마우스 마 취 솔루션 #2 (400 mg/kg 몸 무게 avertin)와 intraperitoneally anesthetize.</li>
		<li>코르크 판에서 마우스의 4 개의 사지를 테이프.</li>
		<li>중간 선 따라 왼쪽에 1cm 절 개를 0.5 c m를 확인 합니다. 경도 대 둔 근 근육과 piriformis 근육, 등 근육을 잘라. 큰 좌 골 구멍 및 좌 골 노치 사이 좌 골 신경의 세그먼트를 표시 합니다.</li>
		<li>호감 12 s와 마크는 10-0 나일론 epineural 봉합으로 호감 사이트에 대 한 미세 집게와 신경. 호감 사이트를 표시 하는 경 막 막에 매듭을 만듭니다.</li>
		<li>5-0 나일론 봉합 근육과 피부 레이어를 닫습니다.</li>
		<li>그것은 완전히 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 세심 한 주의와 온수 담요 (35.0 ° C)에 마우스를 놓습니다. 후 마 취에서 완전히 복구는 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다. 참고: 마우스를 37 ° C 담요에 마 취에서 완전히 복구에 대 한 약 60 분 소요 됩니다. 수술 후 통증 완화를 매일 먹이 대 한 1000 ml 물 (0.2 mg/ml)로 1 알 (200mg)이 부 프로펜을 디졸브.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 관류, DRG와 좌 골 신경 수확
	<ol>
<li>좌 골 신경 후 2 ~ 3 일 (실험 설계)에 따라 호감, 마 취 솔루션 # 2와 intraperitoneally 마우스를 anesthetize.</li>
		<li>뒤에 PBS에 얼음 4 %paraformaldehyde (PFA) (pH 7.5) PBS (pH 7.4)와 마우스 transcardially perfuse</li>
		<li>관류, 후 마이크로 위 및 해 부 현미경 아래 마이크로 포 셉으로 신경 뿌리 및 좌 골 신경 무릎 앞 Drg을 신중 하 게 구분 합니다. 좌 골 신경 4% PFA 4 ° c.에서 하룻밤에 직접 배치</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미징 및 측정 형광 표시 감각 축 삭
	<ol>
<li>연결 된 조직 및 마이크로 위 및 해 부 현미경 아래 신중 하 게 마이크로 포 셉 고정된 좌 골 신경에 막 떨어져 스트립. 다음, 4% 교환 PBS와 세척 PFA 신경 3 번.</li>
		<li>좌 골 신경을 슬라이드에 놓고 그것을 똑바로 유지 합니다. 그것에 coverslip 누워 다음 신경 주위 antifade 솔루션의 80 µ L를 추가 합니다. 압력을 가진 전체 탑재 된 조직에 평평 하 게.</li>
		<li>ﬂattened 조직 모자이크 수집 및 이미지 처리에 대 한 액세서리를 갖춘 거꾸로 epiﬂuorescent 현미경에 놓습니다. 참고: 여기 및 방출 길이 488 nm와 509 nm. 그것은 또한 여러 개의 이미지를 겹치는 수동으로 플러그인 모자이크와 함께 ImageJ를 사용 하 여 이미지를 꿰 매 고 수입니다.</li>
		<li>재생성 된 축 삭의 길이 측정 하면 모든 identiﬁable ﬂuorescently 표시 된 축 삭 원심 축 삭 끝에 호감 사이트 (10-0 epineural 봉합으로 표시)에서 좌 골 신경에 추적.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Saijilafu, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K-GSK3+signalling+regulates+mammalian+axon+regeneration+by+inducing+the+expression+of+Smad1.">PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1.</a> Nature Communications. 4, 2690 (2013).</li><li>Zhang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt-independent+GSK3+inactivation+downstream+of+PI3K+signaling+regulates+mammalian+axon+regeneration.">Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).</li><li>Jiang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+supports+mammalian+axon+regeneration+in+vivo+by+suppressing+GSK3beta+expression.">MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1865 (2015).</li><li>Krames, E. 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R., Leirdal, M., Sioud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Systemic+Delivery+of+Synthetic+siRNAs+in+Adult+Mice.">Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여러 수술 단계 특히 주의 필요합니다. L4 그리고 L5 Drg (somas의 위치), 좌 골 신경 지배, 올바르게 식별 하 고 유전자 구조와 주입을 해야 합니다. 그렇지 않으면, GFP 레이블링 됩니다 결 석 좌 골 신경 축 삭에. 장 골 볏 L4 및 L5 Drg를 정확 하 게 유용한 해부학 적 랜드마크로 서 볼 수 있습니다. 대부분의 마우스에 L5, L6 척추 사이 관절 면은 장 골 볏12인접. 또는, L3 DRG 선택할 수 있습?...

신경 외상으로 인 한 신 경계에서 부상 또는 다양 한 신경 퇴행 성 질환은 보통 모터, 감각 및 인지 기능에 결함에 결과. 최근, 많은 노력 복원 생리 functionsof 부상 신경1,2,3성인 신경 재생 효능 다시 설립에 헌신 하고있다. DRG에 감각 신경은 통증, 온도, 터치, 또는 몸 자세, 뇌 등 다른 감각 자극을 전달 하는 신경 세포의 클러스터. 이러한 뉴런의 각각 의사 유 니 폴라 이며 주변으로 확장 한 분기와 척수4향하고 다른 분기를 분기 하는 단일 축 삭을 포함 합니다. Drg의 성인 감각 신경 세포는 부상 후 적극적으로 그들의 축 삭을 재생성 하기 위해 알려진 몇 가지 성숙한 포유류 뉴런 중입니다. 따라서, 감각 축 삭의 상해는 광범위 하 게 고용 되었다 중요 한 모델로 axonal 재생 비보의 메커니즘을 연구.
Vivo에서 유전자 transfection 기법, 일반적으로 덜 설정 시간과 유전자 변형 동물을 사용 하 여 보다는 유전자의 기능을 공부 하 고 신 경계에 경로 신호에 필수적인 역할을 연주 하고있다. 주요 기술 두 가지 방법으로 분류 될 수 있다: 악기 및 바이러스 기반5. 성인 신경 세포에 유전자 배달 vivo에서 바이러스 성 기반 유전자 식6의 정확한 spatiotemporal 조작을 제공할 수 있습니다. 그러나, 노동 집약적인 프로세스는 바이러스-기반 방법, 생산 등 원하는 유전자를 포함 하는 바이러스 성 입자의 정화에서에서 포함 된다. 또한, 많은 바이러스 성 벡터 데이터 수집, 데이터 분석을 방해 하 고 실험 결과의 해석 가능성이 오해 수 있습니다 호스트의 면역 시스템을 활성화 수 있습니다. Electroporation, 일반적인 악기에 기초를 둔 transfection 접근 유전자 벡터 또는 세포7 외부 공간에서 작은 RNA oligos의 호의 정도, 세포와 핵 막의 침투성을 증가 하는 전기 펄스를 사용 하 여 . 생체 외에서 electroporation 널리 많은 세포 유형에 타겟된 유전자 발현을 조작 하기 위한 과도 하지만 매우 효율적인 전략으로 인식 된다. Vivo에서 electroporation만 일시적인 유전자 발현 바이러스 성 벡터에 비해 낮은 transfecting 효율 리드, 바이러스 접근 다양 한 장점이 있다. 예를 들어, 그것은 거의 모든 조직 및 세포7,,89에 적용할 수 있습니다. 또한, 특정 성적 증명서에 대 한 관심사의 유전자 또는 작은 RNA oligos (예: siRNAs, microRNAs) 인코딩 중 플라스 미드 대상 조직에 직접 주입 하 고 수 다음 전기적 펄스, 절차 하 게 하는 더 적은 노동-고 시간-소모입니다. 또한, 여러 개의 플라스 미드 및 단일 electroporation와 동시에 RNA oligos transfecting 가능 하다.
우리 성인 마우스 감각 신경 세포에 유전자 발현 조작 하 비보에 electroporation 접근 설립 및 성공적으로 적용 하 고 수많은 개척자 연구1,2,3 같은 접근 검증 ,8,10. 여기, 우리 포유류 축 삭 재생의 미래 연구를 위한이 방법의 사용을 촉진 하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Square wave electroporation system</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; electroporation</td></tr><tr><td>Tweezertrodes electrodes</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0524</td><td>For &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; electroporation, 1 mm flat</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Instrumentation</td><td>1096</td><td>Intracellular Microinjection Dispense Systems</td></tr><tr><td>Glass Capillary Puller</td><td>NARISHIGE</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1902328</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Dissection Microscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgery Rongeur</td><td>F.S.T</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgery Forceps</td><td>FST by DUMONT, Switzerland</td><td>11255-20</td><td>Only for sciatic nerve crush</td></tr><tr><td>Glass Capillary</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-4</td><td>10 cm, standard wall</td></tr><tr><td>Tape</td><td>Fisherbrand</td><td>15-901-30</td><td>For fixing the mouse on the corkboard</td></tr><tr><td>2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin stock solution</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Avertin stock solution</td></tr><tr><td>siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIC003</td><td>Non-target siRNA with fluorescence</td></tr><tr><td>microRNA Mimic Transfection Control with Dy547</td><td>Dharmacon</td><td>CP-004500-01-05</td><td>Non-target microRNA with fluorescence</td></tr><tr><td>Plasmids preparation kit</td><td>Invitrogen Purelink</td><td>K210016</td><td>GFP-coding plasmid preparation</td></tr><tr><td>Fast Green Dye</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F7252</td><td>For better visualization of the DRG outline during injection</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-731-51</td><td>Anesthesia induction</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Anesthesia induction</td></tr><tr><td>Acetaminophen</td><td>McNeil Consumer Healthcare</td><td>NDC 50580-449-36</td><td>Post-surgical pain relief</td></tr></tbody></table>

investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion

Electroporation 세포로 DNA 플라스 미드 또는 작은 RNA 분자를 소개 하는 필수적인 비 바이러스 성 유전자 transfection 접근 이다. 지 루트 신경 절 (Drg)에 감각 신경 두와 단일 축 삭을 확장합니다. 1 개 분 지가 주변 신경 (주변 지점), 그리고 다른 지점 입력 지 루트 (중앙 지점)를 통해 척수. 신경 손상 후 주변 지점 중앙 지점에 다시 생성 하지 않습니다 반면 견고 하 게 재생성 합니다. 높은 재생 능력으로 인해 감각 축 삭 재생 널리 사용 되었습니다 모델 시스템으로 서 말 초 신 경계 (PNS)에 중앙 신경 조직 (CNS) 포유류 축 삭 재생을 공부. 여기, 우리는 성숙한 감각 뉴런에서 vivo에서 electroporation 통해 유전자 발현 조작 하 이전 설립된 접근 프로토콜을 설명 합니다. Transfection 플라스 미드 또는 작은 RNA oligos (siRNAs 또는 microRNAs)을 바탕으로, 접근 방식 모두 손실 및 이득-의-기능 실험 연구 관심사의 유전자 또는 축 삭 재생 비보의 규제 microRNAs의 역할을 수 있습니다. 또한, 유전자 표현에 vivo에서 의 조작 제어할 수 있습니다 공간 및 일시적으로 비교적 짧은 시간 과정 내에서. 이 모델 시스템은 포유류 축 삭 재생 규제 vivo에분자 메커니즘을 조사 하는 독특한 도구를 제공 합니다.

세포 독성 transfection DRG electroporation vivo에서 의 속도가 높은 만큼, 우리 주입의 유효성을 검사 하 고 현재 프로토콜 및 electroporated 붙일 태그가 예측에 관한 siRNA L4 및 L5 Drg로 계량 하기. 분리 된 Drg cryo 단면화 및 immunohistochemistry (그림 1A-B)를 통해 처리 되었습니다. 주입 및 electroporation 후 세포 생존 율을 추정, L4와 L5에서 그대로 Drg ?...

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Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation 셀에 관심사의 유전자를 전달 하는 효과적인 접근 이다. 적용 하 여이 접근에서 vivo에서 성인 마우스 지 루트 신경 절 (DRG)의 신경에, 축 삭 재생 비보를 공부 하는 모델을 설명 합니다.

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

investigating-mammalian-axon-regeneration-vivo-electroporation-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

8.2K 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine. Electroporation 셀에 관심사의 유전자를 전달 하는 효과적인 접근 이다. 적용 하 여이 접근에서 vivo에서 성인 마우스 지 루트 신경 절 (DRG)의 신경에, 축 삭 재생 비보를 공부 하는 모델을 설명 합니다.

비디오: Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

의학

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, neurons and Schwann cells engage in a complex interaction to control the myelination of axons. Disturbances of this interaction and breakdown of the myelin sheath are hallmarks of inflammatory neuropathies and occur secondarily in neurodegenerative disorders. Here, we present a coculture model of dorsal root ganglion explants and Schwann cells, which develops a robust myelination of peripheral axons to investigate the process of myelination in the peripheral nervous system, study axon-Schwann cell interactions, and evaluate the potential effects of therapeutic agents on each cell type separately. Methodologically, dorsal root ganglions of embryonic rats (E13.5) were harvested, dissociated from their surrounding tissue, and cultured as whole explants for 3 days. Schwann cells were isolated from 3-week-old adult rats, and sciatic nerves were enzymatically digested. The resulting Schwann cells were purified by magnetic-activated cell sorting and cultured under neuregulin and forskolin-enriched conditions. After 3 days of dorsal root ganglion explant culture, 30,000 Schwann cells were added to one dorsal root ganglion explant in a medium containing ascorbic acid. The first signs of myelination were detected on day 10 of coculture, through scattered signals for myelin basic protein in immunocytochemical staining. From day 14 onward, myelin sheaths were formed and propagated along the axons. Myelination can be quantified by myelin basic protein staining as a ratio of the myelination area and axon area, to account for the differences in axonal density. This model provides experimental opportunities to study various aspects of peripheral myelination in vitro, which is crucial for understanding the pathology of and possible treatment opportunities for demyelination and neurodegeneration in inflammatory and neurodegenerative diseases of the peripheral nervous system.

In the coculture system of dorsal root ganglia and Schwann cells, myelination of the peripheral nervous system can be studied. This model provides experimental opportunities to observe and quantify peripheral myelination and to study the effects of compounds of interest on the myelin sheath.

쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

면역패닝에 의한 성체 마우스 배근 신경절 뉴런 배양의 농축

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...