Bu protokol, kültürlenmiş nöronların akson başlangıç segmentindeki membran periyodik iskeletinin çözülmesine izin verir. Proteinlerin lokalizasyonu incelenerek membrandaki periyodik iskelet fonksiyonuna dair içgörü kazanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı sağlamlığı ve kullanım kolaylığıdır.
Yapısal aydınlatma mikroskobu, membranın periyodik iskeletini çözebilir ve numune hazırlama kolay ve basittir. Floresan mikroskobunda daha önce deneyime sahip olan herkes bu tekniği kolayca uygulayabilir. Bu protokol, numune hazırlama ve görüntüleme sırasında sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır.
Başlamak için, nöronları oda sıcaklığında 12 dakika boyunca% 4 Paraformaldehit kullanarak sabitleyin. Kapak kaymasını fosfat tampon çözeltisinde %0,2 BSA'da bir kez yıkayın ve oda sıcaklığında PBS'de %1'lik bir Triton X çözeltisi içinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Kapak kaymasını fosfat tampon çözeltisinde BSA ile yıkayın, BSA kullanarak anti ankirin G antikorlarını bir fosfat tampon çözeltisinde bir ila 200 oranında seyreltin.
Kapak kaymasına antikor çözeltisi ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri BSA fosfat tampon çözeltisinde bir kez% 0.1 Triton X'te bir kez fosfat tampon çözeltisinde ve bir kez fosfat tampon çözeltisinde yıkayın. Floro 4 etiketli seyreltin, BSA fosfat tampon çözeltisine daha fazla ikincil antikor ekleyin ve kapak kaymasına ekleyin.
Hücreleri BSA fosfat tampon çözeltisinde bir kez% 0.1 Triton X'te bir kez fosfat tampon çözeltisinde, daha sonra bir kez fosfat tampon çözeltisinde yıkayın. Fosfat tampon çözeltisinde etiketli Ferodin'in bir mikromolar çözeltisini hazırlayın ve hücrelere ekleyin. Hücreleri bir kez Sığır Serumu Albümin fosfat tampon çözeltisinde% 0.1 Triton X'te bir kez fosfat tampon çözeltisinde, daha sonra bir kez fosfat tampon çözeltisinde yıkayın.
Kapak kaymasını bir cam kızağa monte etmek için, bir slayta bir damla montaj ortamı uygulayın, kapak kaymasını deiyonize suya batırın ve fazla suyu gidermek için yumuşak bir kağıt havluyla dokunun. Kapak kaymasını cam sürgü üzerine yerleştirin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Mümkünse, görüntülemeden önce mikroskopi tesisindeki personele danışın ve numuneye uygun daldırma yağını seçmek için bir daldırma yağı hesaplayıcısı kullanın.
Numuneler hazır olduğunda, kapak fişlerinin temiz olduğundan ve suya veya etanolle batırılmış bir pamuk ucu ile temizleyerek herhangi bir kalıntıdan arındırıldığından emin olun. Örneği bir 3D-SIM mikroskobuna yerleştirin ve görüntüyü yakalamak için hücreyi bulun. İlgili lazer çizgilerinin gücünü ayarlayın.
Ve numuneyi önemli ölçüde ağartmadan sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için maruz kalma süreleri. Numunenin üst ve alt sınırlarını Z boyutunda ayarlayın ve bir yığın edinmeye devam edin. Süper çözümlenmiş bir yeniden yapılandırma elde etmek için yığın üzerinde yeniden yapılandırma algoritmasını çalıştırın.
Bilinen yapılar için rekonstrüksiyonları kontrol edin ve gerekirse bunları düzeltmek için parametreleri ayarlayın. Çözünürlükteki gelişmeleri gözlemlemek için SIM yeniden yapılandırmasını geniş bir alan görüntüsüyle karşılaştırın. Çok renkli yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu gerçekleştirirken, tatmin edici bir yeniden yapılanma hazır olduğunda, farklı kanalları doğru şekilde hizalamak için hizalama algoritmasını kullanın.
Membran periyodik iskeletindeki aktin halkaları ayırt edici periyodik bir görünüme sahiptir. Aktin halkalarının görünür olduğu tüm odak düzlemlerini kullanarak görüntü analiz yazılımında maksimum yoğunlukta bir projeksiyon görüntüsü oluşturun. Maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüsünde, görünür bitişik halkalar boyunca dik bir çizgi çizin ve yazılımın çizgi çizim profili işleviyle birlikte floresan yoğunluğunu kaydedin.
Ortalama pikler arası mesafeyi hesaplamak için, çizgi profilindeki yerel maksimumu not edin ve bireysel bitişik floresan yoğunluğu zirveleri arasındaki mesafeyi ölçün. Farklı proteinlerin membran periyodik iskeletindeki aktin halkaları ile kolokalizasyonunu değerlendirmek için, aktin ve aday proteinin SIM rekonstrüksiyonları üzerinde bir kolokalizasyon analiz prosedürü çalıştırın. Yazılım platformundaki kolay birlikte yerelleştirme eklentisi için akson başlangıç segmentini ilgi alanı olarak tanımlamak üzere manuel olarak bir seçim yapın ve Pearson'ın kolokalizasyon için korelasyon katsayısını hesaplamak üzere analizi çalıştırın.
SIM görüntü analizi sırasında, görüntü yığınlarının rekonstrüksiyonları, aktin halkalarının net periyodikliğini gösterdi. Ankirin G ve aktin halkalarının kolokalizasyonu, Pearson'un korelasyon katsayısını hesaplamak için bir kolokalizasyon analiz prosedürü kullanılarak akson başlangıç segmentinde test edildi. Pearson'ın ankirin G ve aktin halkaları floresansının kolokalizasyonu için korelasyon katsayısı 0.36 artı veya eksi 0.03 idi.
Doğru daldırma yağını kullanmak ve ızgara çizgilerini görünür kılmak için lazer gücünü ve pozlama süresini ayarlamak önemlidir. Proteinin membran periyodik iskeletinin bir parçası olduğu belirlendikten sonra, membran periyodik iskeletinin korunmasında işlevi araştırılabilir ve kurulabilir. Örneğin, proteinin parçalanmasının aktin halkaları üzerindeki etkileri analiz edilebilir.
Süper çözünürlüklü mikroskopi tekniklerinin geliştirilmesi, akson başlangıç segmentinin aktin halkaları, spektrum ve ankirinden oluşan membran periyodik iskeleti içerdiğini bilmemizin nedenidir. SIM, araştırmacıların membran periyodik iskelet bileşenlerini kolayca görselleştirmelerini ve canlı hücrelerdeki aktin halkalarına bakmalarını sağlamıştır.
