이 방법은 자궁 내막증 병변의 크기에 항 안드로겐 화합물의 효과와 같은 자궁 내막증 분야에서 치료 약물 효과를 평가하는 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 약물의 효과가 종점보다는 실시간으로 자궁 내막증의 동물 모델에서 평가 될 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자인 제시카 마르티네즈뿐만 아니라 센트로 드 Investigacion Principe 펠리페의 수의사이며 우리 팀과 긴밀한 협력자인 비비아나 비스발과 네레아 마린이 될 것입니다.
임플란트 수술 2~3일 전에, 완전한 배지를 함유한 10센티미터 페트리 접시로 헹구고 건강한 자궁내막 조직 생검 조각을 옮기고, 메스를 사용하여 조직을 5~10mm 의 큐브 조각으로 다진다. 마이크로파이프를 사용하여 새로운 10센티미터 배양 접시 바닥에 30~50마이크로리터 방울을 추가하여 각 방울 사이에 충분한 공간을 남겨두어 서로 접촉하지 않습니다. 모든 방울이 놓였을 때 주사기 바늘을 사용하여 생검 조직 단편을 각 방울에 배치하십시오.
다음으로, 100~200마이크로리터의 갓 준비된 아데노-mCherry를 조직 단편당 96개의 웰 플레이트에 추가하고, 아데노바이러스가 없는 DMEM을 음의 대조군으로 3개의 우물에 추가합니다. 그런 다음 바늘을 사용하여 1개의 조직 샘플을 아데노-mCherry 용액의 각 우물로 전송하여 섭씨 37도 및 5%CO2에서 하룻밤 배양을 합니다. 다음 아침, 형광 현미경 단계에 플레이트를 놓고 568 나노미터 레이저를 사용하여 최적의 라벨링을 위해 조각을 확인합니다.
감염mCherry 아데노 바이러스의 적절 한 희석을 사용 하 여 조직의 효율적인 라벨에 대 한 열쇠. 따라서 적절한 농도를 결정하기 위해, mCherry 희석을 위한 몇몇은, 각 개별 실험에 대해, 평가되어야 한다. 그런 다음 신선하고 완전한 매체를 포함하는 새로운 96 웰 플레이트의 개별 우물로 가장 화려한 조각을 옮킨다.
난미 절제술 후 적어도 7 일, 페트리 접시에 자궁 내막 조직 조각을 데산, 마취, 전모 동물에 발가락 핀치에 대한 응답의 부족을 확인합니다. 마우스를 supine 위치에 있는 것은 복부 부위를 소독하고 복부에 있는 1.5 센티미터 세로 절개를 합니다. 근육에서 피부를 분리 하 고 복 막 구멍에 액세스 하는 근육에 두 번째 1.5 센티미터 절개를.
복부 근육 벽의 왼쪽 가장자리를 미니 집게로 잡고 근육을 접어 동물의 바깥쪽에 복막의 내부 얼굴을 노출시합니다. 미니 핀셋을 사용하여 n-butyl ester cyanoacrylate 접착제에 자궁내막 임플란트 1개를 잠깐 담그고 복막에 조각을 부착하십시오. 접착제가 건조되면 복막의 모순된 면에 두 번째 임플란트를 놓습니다.
흡수성 6-0 봉합사를 사용하여 근육 층과 흡수성이 없는 6-0 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다. 그런 다음 방부제 용액으로 피부 절개를 청소하고 완전한 침전이 될 때까지 모니터링하여 동물을 회복 영역에 배치하십시오. 이식된 조직 단편의 생체 내 형광 화상 진찰의 경우, 이식 수술 후 24~48시간 후에 생체 내 이미징 시스템을 켜고, 소프트웨어를 초기화하고, CCD 카메라가 몇 분 동안 냉각되도록 합니다.
기기가 준비되면 첫 번째 마취 마우스를 생체 내 이미징 시스템 케이지에 넣고, 수핀 위치에, 뇌가 마취 기계에 연결된 튜블러 내부의 경우 뚜껑을 닫습니다. 그런 다음 획득을 클릭하고 결과 5개의 이미지를 저장합니다. 생체 내 형광을 정량화하기 위해 적절한 이미지 분석 소프트웨어에서 분석할 혼합되지 않은 관심 파일을 찾아찾아찾아봅을 클릭합니다.
새 창이 나타납니다. 각 동물의 혼합되지 않은 파일을 서로 다른 시간에 포함시키고 그룹으로 로드를 클릭하여 목록에 추가하려면 추가를 클릭합니다. 모든 이미지는 단일 시퀀스에 표시되어야 합니다.
도구 팔레트 창에서 개별 배율 확인란을 선택 해제하여 모든 이미지를 동일한 배율로 조정하고 시퀀스의 한 이미지를 두 번 클릭합니다. 관심 영역을 만들려면 관심 영역도구 영역에서 윤곽선 및 자동 옵션을 선택하고 원 모양을 클릭하여 형광 신호의 중심에 원을 배치합니다. 만들기를 클릭하여 관심 영역을 만들고 신호가 없는 백그라운드에서 관심 영역을 복사하고 붙여넣습니다.
그런 다음 관심 영역을 측정하고 모든 것을 선택하여 각 영역의 형광 강도에 대한 값을 표시하고 이러한 값을 스프레드시트에 복사하여 붙여 넣습니다. 자궁내막 단편의 라벨링은 비감염된 자궁내막 조직 자동형광보다 훨씬 더 견고한 근적외선 섹션에서 형광을 방출하는 단백질인 mCherry를 발현하도록 설계된 아데노바이러스감염에 의해 달성된다. 모니터링 하는 동안, mCherry에 대 한 참조 파장 이외에, 형광 이미지는 여기 방출 파장 필터의 다른 쌍으로 촬영.
배경으로부터 병변의 특징적인 형광 조직 방출 프로파일을 정의하기 위해, 호스트 조직에 의해 방출되는 자동 형광, 각 시간 점 동안 동물에 의해 방출되는 원시 형광을 포함하는 모니터링 이미지는 단일 파일에서 정규화되지 않고 함께 가져온다. 다음으로, 형광은 혼합되지 않고, 정규화되고, 거짓 색 이미지로 표현되며, 특정 군단 및 배경 신호에 대응하는 관심 영역은 프로그램에 의해 자동으로 인식되고 정량화된다. 관심 신호의 배경 영역은 관심 신호의 군단 영역에서 뺍니다.
그리고 각 시점에서 강도의 결과는 강도가 최대인 시점에 대해 정규화됩니다. 몇 주 간의 모니터링 후, 실행 가능한 임플란트는 추가 다운스트림 분석을 위해 복구할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 조직의 생존가능성을 손상시키지 않으면서 가장 화려한 신호를 제공하는 Ad-mCherry의 농도를 선택하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 병변을 복구하고 추가 적인 독특한 매개 변수를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차는 이종이이식 인간 자궁내막증 병변의 비침습적 모니터링에 최적화되어 있습니다. 그러나, 그것은 쉽게 실시간으로 xenograft의 사이트에 관심있는 특정 약물의 효과 평가에 대 한 적응 될 수 있습니다.
