Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen bei der Bewertung der therapeutischen Arzneimittelwirkungen im Bereich der Endometriose zu beantworten, wie die Auswirkungen von anti-androgenen Verbindungen auf die Größe der endometriotischen Läsionen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Wirkung der spezifischen Medikamente in Tiermodellen der Endometriose in Echtzeit und nicht am Endpunkt beurteilt werden kann. Demonstriert wird das Verfahren von Jessica Martinez, einer Technikerin aus meinem Labor, sowie Viviana Bisbal und Nerea Marin, die Tierärzte vom Centro de Investigacion Principe Felipe sind und eng mit unserem Team zusammensind.
Zwei bis drei Tage vor der Implantatoperation übertragen Sie die biotrizierten, gesunden Endometriumgewebe-Biopsiefragmente in eine 10 Zentimeter lange Petrischale, die ein komplettes Medium enthält, und verwenden Sie Skalpelle, um das Gewebe in fünf bis zehn Millimeter gewürfelte Stücke zu zerkleinern. Mit einer Mikropipette 30 bis 50 Mikroliter Tropfen DMEM über den Boden einer neuen 10-Zentimeter-Kulturschale hinzufügen, so dass genügend Platz zwischen jedem Tropfen, so dass sie nicht miteinander in Kontakt kommen. Wenn alle Tropfen platziert wurden, verwenden Sie eine Spritzennadel, um ein einzelnes Stück Biopsiegewebefragment in jeden Tropfen zu legen.
Als nächstes fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter frisch zubereitetes Adeno-mCherry zu einem Brunnen einer 96-Well-Platte pro Gewebefragment hinzu, plus drei Brunnen mit Adenovirus-freiem DMEM als Negativkontrolle. Dann verwenden Sie die Nadel, um eine Gewebeprobe in jeden Brunnen der adeno-mCherry-Lösung für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 zu übertragen. Am nächsten Morgen die Platte auf eine Fluoreszenzmikroskop-Bühne stellen und mit einem 568-Nanometer-Laser die Fragmente auf eine optimale Kennzeichnung überprüfen.
Die Verwendung der geeigneten Verdünnung der Infektion mCherry Adenovirus ist der Schlüssel für eine effiziente Kennzeichnung des Gewebes. Um die entsprechende Konzentration zu bestimmen, müssen für jedes einzelne Experiment mehrere für die mCherry-Verdünnung bewertet werden. Dann übertragen Sie die brillantesten Fragmente in einzelne Brunnen einer neuen 96-Well-Platte mit frischem, komplettem Medium.
Mindestens sieben Tage nach der Oophorektomie dekantieren Sie die Endometriumgewebefragmente in eine Petrischale und bestätigen einen Mangel an Reaktion auf Zehenkniff in einem anästhesierten, oophorrectomisierten Tier. Mit der Maus in der Supine-Position desinfizieren Sie den ventralen Bereich und machen Sie einen 1,5 Zentimeter längsigen Schnitt im Bauch. Trennen Sie die Haut vom Muskel und machen Sie einen zweiten 1,5-Zentimeter-Schnitt im Muskel, um auf die Peritonealhöhle zuzugreifen.
Halten Sie den linken Rand der bauchigen Muskelwand mit Mini-Zange, falten Sie den Muskel, um das Innengesicht des Peritoneums auf der Außenseite des Tieres zu belichten. Verwenden Sie Mini-Pinezer, um kurz ein Endometriumimplantat in n-Butylester Cyanoacrylat-Klebstoff einweichen und befestigen Sie das Fragment am Peritoneum. Wenn der Klebstoff getrocknet ist, legen Sie ein zweites Implantat auf die kontralaterale Seite des Peritoneums, wie gerade gezeigt.
Verwenden Sie eine resorbierbare 6-0 Naht, um die Muskelschicht zu schließen und eine nicht resorbierbare 6-0 Naht, um die Haut zu schließen. Reinigen Sie dann den Hautschnitt mit antiseptischer Lösung und legen Sie das Tier in die Erholungszone mit Überwachung bis zur vollständigen Reemumbency. Für die in-vivo fluoreszierende Bildgebung der implantierten Gewebefragmente schalten 24 bis 48 Stunden nach der Implantationsoperation das In-vivo-Bildgebungssystem ein, initialisieren die Software und lassen die CCD-Kamera für einige Minuten abkühlen.
Sobald das Instrument bereit ist, legen Sie die erste beästhesierte Maus in den In-vivo-Bildgebungssystemkäfig, in der Rückenposition, mit dem Kopf in einem Tubuli, der mit der Anästhesiemaschine verbunden ist, und schließen Sie den Deckel. Klicken Sie dann auf Erfassen und Speichern der fünf resultierenden Bilder. Um die In-vivo-Fluoreszenz zu quantifizieren, klicken Sie in der entsprechenden Bildanalysesoftware auf Durchsuchen und wählen Sie die zu analysierende ungemischte Datei aus.
Ein neues Fenster wird angezeigt. Klicken Sie auf Zur Liste hinzufügen, um alle nicht gemischten Dateien von jedem Tier zu unterschiedlichen Zeitpunkten einzuschließen, und klicken Sie auf Als Gruppe laden. Alle Bilder sollten in einer einzigen Sequenz angezeigt werden.
Deaktivieren Sie im Werkzeugpalettenfenster das Kontrollkästchen für den einzelnen Maßstab, um alle Bilder auf den gleichen Maßstab anzupassen, und doppelklicken Sie auf ein Bild der Sequenz. Um einen Bereich von Interesse zu erstellen, wählen Werkzeuge im Bereich von Interesse die Optionen Kontur und Auto 1 aus, und klicken Sie auf die Kreisform, um den Kreis in der Mitte des Fluoreszenzsignals zu platzieren. Klicken Sie auf Erstellen, um den Interessenbereich zu erstellen, und kopieren und fügen Sie den Interessenbereich auf einem Hintergrund ein, in dem kein Signal vorhanden ist.
Klicken Sie dann auf "Interessierte Bereiche" und wählen Sie alle aus, um Werte für die Fluoreszenzintensität jeder Region anzuzeigen, und kopieren und fügen Sie diese Werte in eine Kalkulationstabelle ein. Die Kennzeichnung der Endometriumfragmente erfolgt durch eine Infektion mit dem Adenovirus, das entwickelt wurde, um mCherry auszudrücken, ein Protein, das Fluoreszenz im Nahinfrarotbereich aussendet, das deutlich robuster ist als die nicht infizierte Endometriumgewebe-Autofluoreszenz. Während der Überwachung werden zusätzlich zur Referenzwellenlänge für mCherry fluoreszierende Bilder mit verschiedenen Anregungsemissionswellenlängenfiltern aufgenommen.
Um die charakteristischen fluoreszierenden Gewebeemissionsprofile der Läsionen aus dem Hintergrund und die vom Wirtsgewebe emittierte Autofluoreszenz zu definieren, werden die Überwachungsbilder, die rohe Fluoreszenz enthalten, die von den Tieren während jedes Zeitpunkts emittiert werden, unnormalisiert in einer einzigen Datei zusammengefasst. Als nächstes wird die Fluoreszenz ungemischt, normalisiert und als falsches Farbbild dargestellt, und die Interessengebiete, die bestimmten Legions- und Hintergrundsignalen entsprechen, werden vom Programm automatisch erkannt und quantifiziert. Die Hintergrundregion, die von Interesse signalisiert wird, wird von der Legionsregion von Interesse abgezogen.
Und die Ergebnisse der Intensität zu jedem Zeitpunkt werden gegen den Zeitpunkt normalisiert, an dem die Intensität maximal ist. Nach mehrwöchiger Überwachung können die lebensfähigen Implantate für weitere nachgelagerte Analysen zurückgewonnen werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Konzentration von Ad-mCherry auszuwählen, die das brillanteste Signal liefert, ohne die Lebensfähigkeit des Gewebes zu beeinträchtigen.
Nach diesem Verfahren können die Läsionen wiederhergestellt und verwendet werden, um zusätzliche Unterscheidungsparameter zu untersuchen. Dieses Verfahren ist für die nicht-invasive Überwachung von xenograft menschlichen Endometrioseläsionen optimiert. Jedoch, Es kann leicht angepasst werden, um die Auswirkungen eines bestimmten Arzneimittels von Interesse auf die Standorte eines Xenograft in Echtzeit zu bewerten.
