We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.

의료 연구 동물 윤리위원회의 월터 엘리자 홀 의학 연구소는 이러한 프로토콜에 설명 된 절차의 각을 승인했다. 실험 쥐의 1. 준비 <ol><li> 적어도 네 남녀의 실험 동료 구도를 사육과 같은 특정 병원체 무료 (SPF) 동물 시설 / 방에 보관하고 멸균 된 음식과 물을 함께 제공됩니다 6~8주 된 C57BL / 6 마우스 (M.의 musculus)을 일치. 암컷 마우스의 사용은 다른 라인 제한 상자 번호 쥐에서의 공동 주택을 허용하고, 케이지 케이지 간 변동을 감소시킬 것이다. </li><li> 3.0 mm 직경 내시경 외피를 사용하여 내시경 검사 절차를 가능하게하는 나이가 최소 6 주 생쥐를 확인합니다. </li><li> 가능한 장내 세균총과 관련된 변화를 줄이기 위해 동일한 랙에 저장된 케이지에서, 같은 마우스의 유전 적 배경을 사용하여. 동물 시설과 미생물의 변화는 고려 갔지에주의해야한다n은 각각 실험 22 적절한 대조군 마우스 및 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다. </li><li> 귀 / 발가락 스크랩, 문신, 또는 유사한로 표시 마우스는 쉽게 식별 할 수 있도록합니다. </li><li> 기준 실험 가중치를 결정하기 위해, 일 0에 마우스의 무게를. </li><li> 내시경 검사를 수행하여 기본 대장 표현형을 기록하는 일 0에 마우스 (5 장 참조). </li></ol> 상피 손상 및 급성 대장염 모델에서 2. 전 임상 시험 <ol><li> 치료제의 용액을 제조 테스트 할. 구강 투여 (PO)에 의해 전달 치료제를 들어, 100 μL의 최대 볼륨으로 솔루션을 준비합니다. 복강 내 (IP) 주입에 의해 전달 치료제를 들어, 200 μL의 최대 볼륨으로 솔루션을 준비합니다. 참고 : 시간의 연장 기간 동안 반복 IP 또는 포 약물 투여가 변경된 마우스 동작이 발생할 수 있습니다. 장시간 불편을 피하기 위해 IP 주입 사이트 번갈아. 포 투여의 경우, autoc와 마우스를 제공&#39;치료&#39;로 laved 해바라기 씨앗 위관 절차에 부정적인 연관을 최소화합니다. </li><li> 1 일에서, 관심 (2.1 단계에서 준비)하고 적절한 차량 컨트롤의 치료를 관리 할 수​​ 있습니다. 제공된 예 (도 6a), 재조합 인간 (RH) iInterleukin (IL)의 -11 단백질 5㎍을 200 ㎕의 인산 완충 식염수에 용해 하였다 (PBS) 및 IP 투여 </li><li> . 테스트중인 치료 시약 확립 약동학 프로파일에 의존한다 투여의 타이밍 및 주파수를 결정 실험 1의 과정을 통해 IP 회 주사를 이용하여 예방 적 치료를 설명도. </li><li> 대변​​의 일관성과 혈액의 존재를 포함하여, 모니터, 매일 각 마우스의 무게를. 치료의 날, 치료약의 투여와 일치해야하는 것은 계량 반복 처리에 의한 생쥐에 응력을 최소화한다. </lI&gt; <li> 3 일에, 2.5 % (2.5 g / 100 ml)을 정기적으로 동물 시설에 의해 마우스에 제공되는 식수에 DSS 솔루션을 준비합니다. 약 5 ㎖ / 마우스 / DSS 솔루션의 날 실험이 필요합니다. 동물 시설의 주위 온도가 변동하는 경우 DSS 물의 소비량은 변할 수있다. 참고 : DSS는 자극성 및 MSDS 지침에 따라 처리해야합니다. </li><li> 5 연속 일 동안 깨끗한 물을 병에 쥐 임의로 신선한 DSS를 제공합니다. 5 일 저녁에 으깬 음식 펠릿뿐만 아니라 작은 배양 접시 (100g 식품 알약 / 10g의 단백질 쉐이크 / 물 10 ㎖)에 제공되는 단백질 보충에 일반 식수를 제공합니다. 이것은 탈수를 방지하고 심한 체중 감량을 최소화으로 지원합니다. </li><li> 이산화탄소 중독으로 쥐를 안락사와 8 일, 또는 아침에 이후의 조직 학적 분석을위한 조직을 수집하는 마우스는 세 개 이상의 C에 대한 ≥15 %의 체중 감량을 경험하는 경우둘 중 먼저 발생하는 onsecutive 일. 참고 : 1-4 % 사이 DSS 량을 조정 (W / V) 동물 시설의 미생물과 DSS의 배치에 따라. 해당 DSS의 용량과 우회 배치 별 변화를 설립, 일상적인 배치 시험을 수행하십시오. 적절한 투여 량은 체중 감소 (원래의 중량의 15 % 이하)에 근거하고, 조직 병리학 장염을 확인해야한다. </li></ol> 만성 대장염이나 대장염 관련 암 모델에서 3. 전 임상 시험 <ol><li> 만성 대장염 모델의 단계 3.7에서 시작합니다. </li><li> 대장염 관련 암 (CAC) 모델의 경우 1 일에, 10 ㎎ / ㎏ (w / w) 아족시 메탄 (AOM, 250 μL, IP)와 각 마우스를 주입. 참고 : AOM 발암 물질이며, MSDS 지침에 따라 처리해야합니다. </li><li> AOM의 재고 솔루션은 10 ㎎ / ㎖ 분량으로 준비하고 -20 ° C에 저장됩니다. 주사 당일, AOM 원액을 해동하고, 1 ㎎ / m로 희석PBS의 리터. 반복 된 동결 AOM 원액 해동 피해야한다. </li><li> AOM 도즈는 8-12 ㎎ / kg 사이에서 조정될 수있다. 일상적인 배치 시험 인해 뱃치 간 변이 마우스에 대한 독성을 회피하기 위해 적절한 투여 AOM을 확립 할 필요가있다. </li><li> 1-7 일 동안 투여 AOM 무게가 안정 될 것이다 다음 이러한 이유로 중량 모니터링은 배설물에서 독성 대사 산물을 배설 할 처리 동물을 피하기 위해 1-7 일 동안 생략 될 수있다. </li><li> 7 일째 모든 세포 독성 침구 절차에 따라 변경 될 필요가있다. 침구 변경이 완료되면 더 이상 세포 독성 대사 배설되지 바와 같이, 동물은 더 이상 세포 독성 처리 절차가 필요 없다. </li><li> 제 8 일에, 2.5 % (2.5 g / 100 ㎖) (단계 2.5에 기재된 바와 같이) DSS 용액을 제조하고 마우스에 임의로 제공한다. </li><li> 러플 쿵푸를 포함, 실험을하는 동안 매일 마우스의 무게를 측정하고 질병의 징후를 모니터링R, 혈변 감소 운동을 hunching. </li><li> 날 13 일, DSS 솔루션을 제거하고 28 일 8-28 만성 대장염 / CAC 프로토콜의 하나의 &#39;주기&#39;를 구성하는 날까지 정상적인 식수와 마우스를 제공한다. </li><li> 일 13-28,에 쥐가 정상적인 식수를 제공하는 경우, 으깬 음식 펠릿와 마우스 및 작은 배양 접시 (100g 식품 알약 / 10g의 단백질 쉐이크 / 물 10 ㎖)에 제공되는 단백질 보충을 제공합니다. 이것은 탈수를 방지하고 심한 체중 감량을 최소화으로 지원합니다. 주 : 매쉬의 단백질 보충제 생쥐 DSS 소비의 일관성을 보장하기 위해 식수 DSS 함유받을 때 제공되지 않아야한다. </li><li> 날 20 일 (5 장 참조) 개별 마우스 상태를 모니터링 할 수있는 두 번째 내시경 검사를 수행합니다. </li><li> 하루 29 반복에 DSS주기 (사이클 2 : 2.5 % (V) 일 34-50시 29-33 일 정상 식수 동안 제공 DSS / W). </li><li> 날에 (40)는 생을 수행마우스 개체의 상태를 모니터하고, 종양 부하를 결정하는 내시경 검사를 RD (섹션 5 참조). </li><li> 더 종양이 날 (40)에 내시경 볼 수없는 경우, 일 50-72에 세 번째 DSS주기 시작 (사이클 3 : 2.5 %을 (/ V) 일 56-72시 50-55 일 정상 식수 동안 제공 DSS 와트). 일반적으로, 종양은 40 일에 의해 드러나게 DSS의 세번째 사이클을 생략 할 수있다. </li><li> 종양은 내시경 검사에서 볼 수있게되면, 각 마우스에게 내시경 종양 점수 (5 장 참조) 할당 및 이와 유사한 기준 종양 부담와 동료 개별 쥐를 할당합니다. </li><li> (종양 볼 수 있습니다) 경우 42 일에서 치료 화합물 또는 관련 차량 제어를 (2.2 절 참조) 관리 할 수​​ 있습니다. 투여시기는 치료의 약물 동태 학적 프로파일에 의존한다. 개입 치료의 예는 종양 확립 제공된다 (도 2)과 함께 마우스에서 세 번 매주 IP 주사. </li><li> 전자를 수행치료를 지속 시간 동안 일주일에 한 번씩 ndoscopic 시험은 종양 부하를 모니터링한다. 일반적으로, 치료 적 처치 4 주 목적은 치료 반응을 관찰하기에 충분하다. 치료의 종료 후, 마우스의 코호트 연구는 종양 재발에 대한 내시경 검사로 모니터링 할 수있다. </li><li> 이산화탄소 중독으로 쥐를 안락사와 마우스가 세 개 이상의 일 연속 ≥15 %의 체중 감량을 경험하는 경우 나, 둘 중 먼저 발생하는 날 (72)의 아침에 생화학 적 및 / 또는 조직 학적 분석을위한 조직을 수집합니다. </li></ol> 산발적 인 대장 암 모델에서 4. 전 임상 시험 <ol><li> 1 일에서 10 ㎎ / ㎏ AOM (단계 3.2 참조)에서 마우스를 사용할 때마다 IP를 주입. AOM 도즈는 8-12 ㎎ / kg 사이에서 조정될 수있다. 일상적인 배치 시험 인해 뱃치 간 변이 마우스에 대한 독성을 회피하기 위해 적절한 투여 AOM을 확립 할 필요가있다. </li><li> 매주의 첫날에 주사를 반복5 주 동안 (그림 3). 마우스 전체 육주에 대한 세포 독성 안전 절차에 따라 처리해야합니다. </li><li> 반복 처리에 의한 생쥐에게 고통을 최소화 AOM 분사의 날에 각 마우스의 무게. 참고 : AOM 발암 물질이며, MSDS 지침에 따라 처리해야합니다. </li><li> 모든 동물은이 프로토콜에 대한 요구 AOM의 IP 주사 6 주 동안 세포 독성 안전 절차에 따라 처리해야합니다. </li><li> 8 주 동안 신흥 종양 (5 장 참조) 모니터 할 내시경 검사를 수행합니다. 종양이 표시 될 때까지 내시경 검사는 모든 이주 수행해야합니다. 일반적으로, 야생형 C57BL / 6 AOM 동물의 초기 투여 후 약 40주 의해 종양을 개발하기 시작한다. </li><li> 종양은 내시경 검사에서 볼 수있게되면, 각 마우스에게 내시경 종양 점수를 할당 (5 장 참조)과 유사한으로 코호트 개별 마우스를 할당<html> 치료를 개시하기 전에 종양 부담. </li><li> (종양 제 볼 때 또는) 40 주 동안 치료 적 화합물 또는 중요한 차량 제어를 관리. </li><li> 투여 량의 타이밍이 치료제의 약물 동태 학적 프로파일에 의존한다 (단계 2.1 참조). 개입 치료의 예는 종양 확립 제공된다 (도 3)와 마우스에서 매주 3 회 IP 주사. </li><li> 종양 부담을 모니터링하는 치료 적 처치 기간 동안 매주 내시경 검사를 수행한다. 일반적으로, 치료 적 처치 4 주 목적은 치료 반응에 충분하다. 치료 중단 후, 마우스의 코호트 연구는 종양 재발에 대한 내시경 검사로 모니터링 할 수있다. </li><li> 이산화탄소 중독으로 쥐를 안락사와 주 (45), 또는 치료의 사주를 다음 중 대장 종양의 생화학 적 및 / 또는 조직 학적 분석을위한 조직을 수집합니다. </li></ol>&gt; 5 ve_title. &quot;내시경 시험 <ol><li> 내시경 장비는 표준 절차 (16)에 따라 조립해야합니다. </li><li> 멸균 및 70 % 에탄올 또는 항균 윤활제 내시경 프로브 청소. </li><li> 동영상은 iMovie와 같은 데스크톱 또는 랩톱 컴퓨터와 미디어 표준 소프트웨어를 사용하여 기록 할 수있다. 표준 컴퓨터 모니터 대신 의료용 모니터, 내시경 검사 절차 (도 4) 동안 결장을 시각화하기에 충분하다. </li><li> 0.2 ~ 0.4 L / min의 속도로 동시에 100 % O 2에서 3 % 이소 플루 란 챔버 5-6 쥐 그룹을 마취. 발가락 핀치에 의해 확인 마취 된 쥐, 일단; 이소 플루 란 수준은 유지 보수를 위해 0.5 %로 변경해야합니다. </li><li> 챔버에서 개별 마우스를 제거하고 코 콘에 고정 머리와 복부면이 위를 향하도록 놓습니다. 전체 마취 모니터링해야 그들이 S가되도록 뒷다리 조정되어야마우스 뒤를 tretched. </li><li> 건조 함을 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 놓습니다. </li><li> 이 명확하게 항문을 나타 내기 위해 낮은 척추을 충족 마우스의 꼬리를 잡으십시오. 물을 비이커에 경질 내시경 칼집을 넣고 한 번에 하나의 작은 기포의 방출을 할 수 있도록 공기 흐름을 조절합니다. </li><li> 공기 흐름은 콜론 팽창 허용됩니다. 공기 흐름이 너무 강하면, 공기가 마우스의 복부에 주입한다. 추가 윤활이 필요하지 않습니다. </li><li> 조심스럽게 직장에 경질 내시경 칼집을 넣습니다. 일반적으로, 내시경 마우스 곡선에 콜론을 지적하고 단단한 내시경에 액세스 할 수 없습니다되는 3cm, 최대 삽입 할 수 있습니다. </li><li> 내시경 검사 과정에서 공통의 어려움으로 인해 대변에 대장의 내강에 대한 접근 차단합니다. 부드럽게 FECA 주위에 내시경을 조종 조심스럽게 배변을 장려하기 전에 절차를 쥐의 뱃속의 마사지, 또는하여이를 피절차를 수행하는 동안 리터의 문제. 연동 운동은 대장 근육이 이완 될 때까지 그 동안 내시경 위치에 유지해야 발생할 수 있습니다. </li><li> 내시경 검사 절차의 모든 단계에서 동영상 촬영을 시작합니다. 질병 점수는 절차 중에 경험 조수에 의해 기록 또는 비디오 파일로부터 나중 시점에서 할 수있다. </li><li> 내시경 검사 후, 자신의 케이지에 마우스를 반환하고 마취에서 회복하는 동안을 모니터링 할 수 있습니다. 동물 이소 플루 란 관리 코 콘에서 제거 다음 2 분 이내에 일반적으로 깨어 이동합니다. </li><li> 이러한 절차는 숙련 된 과학자에 의해 수행되어 있는지 확인합니다. 각 내시경 검사 절차는 마우스 당 약 2 분 소요됩니다. </li></ol> 6. 질병 점수 <ol><li> (I)의 변화를 문서화 대장염의 심각도 뮤린 내시경 지수 (MEICS) (16)로 나타내는 투명성 결장 벽의 두께 비디오 스코어 대장염을 모니터링 할(Ⅱ) (Ⅳ)을 세분화 방식으로 존재 궤양 및 재생이 영역 (V) 예금 (도 5a)에 의해 지시 피브린 출혈 대변 일관성, (ⅲ) 혈관 무결성 및 존재. </li><li> 종양 부담을 모니터링하기 위해, 종양의 빈도와 크기에 대한 비디오를 점수. 종양 크기는 종양 (16) (도 5b)에 의해 점유 된 결장 내강의 직경에 의해 결정된다. 그것은 하나의 마우스 모두 대장염 및 종양 득점 매개 변수를 사용하는 것이 일반적입니다. 내시경, 개별 종양 및 대장 점막의 상태를 사용하면 하나의 동물에서 새로운 치료제의 성공을위한 판독을 제공하여 시간에 걸쳐 모니터링 될 수도있다. </li><li> (선택 사항) 정지 영상 대표적인 인물 (그림 6)의 생성을 위해 동영상에서 추출 할 수 있습니다. </li></ol>

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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria.">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139, 485-498 (2009).</li><li>Thiem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+inhibition+restricts+inflammation-associated+gastrointestinal+tumorigenesis+in+mice.">mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice.</a> J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).</li><li>Stuart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+inhibition+of+Jak+activity+inhibits+progression+of+gastrointestinal+tumors+in+mice.">Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice.</a> Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).</li><li>De Robertis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AOM/DSS+murine+model+for+the+study+of+colon+carcinogenesis:+From+pathways+to+diagnosis+and+therapy+studies.">The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies.</a> J Carcinog. 10, 9 (2011).</li><li>Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sodium+sulfate+inhibits+the+activities+of+both+polymerase+and+reverse+transcriptase:+lithium+chloride+purification,+a+rapid+and+efficient+technique+to+purify+RNA.">Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA.</a> BMC Res Notes. 6, 350 (2013).</li><li>Kerr, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sodium+sulfate+inhibition+of+real-time+polymerase+chain+reaction+amplification:+a+poly-A+purification+solution.">Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution.</a> Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

쥐에서 대장 질환 병리의 신뢰성과 재현성 유도의 개요 방법을 설명하는 세 가지 프로토콜을 지원합니다. 일상적인 내시경 모니터링 및 여기에 설명 된 중재 전략과 결합 할 때,이 프로토콜은 치료제의 효능에 강력한 전임상 통찰력을 제공 할 것입니다. 우리 연구소는 정기적으로 새로운 치료제 10,23,24의 성공을 모니터링하는 이러한 프로토콜을 모두 사용합니다. 전임상 동물 모델을 선택하는 새로운 치료제를 테스트 할 때 고려 사항들이있다. 이들은 인간 질병 모델의 관련성, 및 치료 대상의 동작 제안에 종양 미세 환경의 기여를 포함한다. 여기에서 우리는 설립 장내 질병 모델에서 치료 개입에 대한 세 가지 프로토콜을 제공합니다. 이러한 모델은 재현성과 질병을 유도하는 시약의 전달은 쉽게 관리 할 수​​ 있습니다. 중요한 것은, 모델은 관련성이 높은여러 측면 및 대장염의 발병 및 종양 개시 및 진행 단계에. 연구진은 상당히 25 다를 수 있습니다 DSS 및 / 또는 AOM에 의해 유도 된 질병에 대한 감수성으로, 고려 실험을 설계 할 때 사용되는 마우스 균주의 유전 적 배경을해야합니다. 또한, 다른 미생물 군집은 세균에 의해 대사된다 AOM의 컨텍스트에서 다른 대사 능력을 가질 수있다. 우리는 하나의 실험에서 (상업 업체 포함) 다른 동물 시설에 태어난 쥐의 다른 동료를 사용에 대해 경고한다. 마찬가지로, 다른 시설에서 사용 된 생쥐에서 다른 미생물은 다른 호스트 응답이 각막 상피 손상 (11)을 유도 DSS에 유도 할 수 있습니다. 또한, (예를 들어, RNA 정화용) 조직의 적절한 분석은 후속 분석 26,27 분자에 영향을 역전사 효소를 억제하는 DSS의 능력 때문에, 고려되어야한다. <p claSS = &quot;jove_content&quot;는&gt; 마우스 내시경 반복 마우스 개체에서 질환 발병과 진행을 모니터링하는 최첨단 기술이다. 동영상을 녹화 및 정지 영상을 추출 할 수있는 능력은 여러 질병의 매개 변수와 종양의 쉬운 모니터링을 허용합니다. 동물 복지 향상에 더하여, 내시경 관찰하는 것은 전통적 질병 결과를 추적하기 위해 서로 다른 시간 지점에서 발췌 한 실험 쥐의 여러 코호트에 대한 필요성을 감소시킨다. MEICS 채점 시스템은 조직 병리학 적 분석을위한 대체 아니지만 대안 살아있는 쥐 동물 건강 및 점막 손상을 모니터링하는 수단을 제공한다. 마우스 내시경 전문 실험실 기술이며, 모든 절차는 마우스의 적절한 조작 및 처리를 보장하기 위해,뿐만 아니라 질병 득점에 사용되는 이미지의 일관성있는 품질을 제공하기 위해 숙련 된 기술자가 수행해야합니다. 자격을 갖춘 개인의 손에, 우리는 내시경 검사가 tumo에 거의 또는 전혀 손상을 유도하는 것을 발견했다내 종양 대 출혈을 야기 RS. 그것은 초기 종양 부담을 결정하는 수단을 제공하고, 치료 약물의 투여 이전에 유사한 종양 부담과 동물 군 코호트 우리 할 수​​ 있으므로 약술 치료 프로토콜을 위해, 우리는, 내시경 매우 유리 고려한다. 마우스의 연속 모니터링은 적시에 실패한 실험을 종료하는 옵션을 사용하여 초기에 신규 치료법의 효능을 결정하기 위해 연구를 가능하게한다. 염증성 장 질환과 대장 암 진행에 대한 우리의 이해로, 치료를위한 새로운 목표를 식별 할 수 있습니다. 적절한 동물 모델이 가장 유망한 새로운 치료법이 임상 시험을 향해 이동되는 것을 보장에 통합 될 것이다.

대장 암 (CRC)은 악성 종양 전세계 1의 4 번째 가장 일반적인 원인이다. 이 질병의 가족 기초에 대한 우리의 이해에 상당한 진전에도 불구하고, 유전 적 소인은 CRC의 경우 2 ~ 20 %에 기여하고있다. 나머지는 만성 염증 등 다양한 외부 환경 요인에 기인한다. 인간에서 만성 염증과 대장 암 사이의 링크는 궤양 성 대장염 대장염 관련 대장 암 (CAC)을 개발하는 큰 위험을 가지고 (UC) 환자에 분명하다, 염증성 질환 (3)의 기간, 범위와 정도에 따라 -5. 따라서, 신규 한 치료법은 면역 반응 및 염증 종양 미세 환경에 의해 6-8 성장 촉진 인자 연관된 생산을 제어하는 발전에있다. 의 치료 효능을 특성화하기위한 적절한 전임상 동물 모델에 대한 증가하는 요구가있다개발 및 질병의 진행에 대한 이러한 약물. 마우스 모델은 명백히 염증 미세 환경에도 명백한 염증 9,10의 부재 하에서, CRC의 진행에 기여하고 있음을 증명하고있다. 이러한 모델은 상피 상해 및 급성 및 만성 염증성 장 질환 (IBD)을 모델링 11,12 마우스의 식수에 구비 다당류 덱스 트란 황산나트륨 (DSS)의 사용을 포함한다. DSS는 점막 손상 및 대장염을 유발하는 메커니즘이 완전히 이해되지는 않지만, 일부 연구 DSS가 셀들 내에 셀룰러 역전사 및 리보 뉴 클레아 활동을 저해하거나 결장 막이 손상 상피 선도 융합 나노 지질 복합체의 형성을 촉진하는 것이 시사 13, 14. 표준 DSS 모델에 대한 수정은 대장 상피 세포 조직의 항상성 및 regu을 유지하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다후반 점막 면역 반응 (15). 아족시 메탄 (AOM)의 복강 내 투여는 단독으로, 또는 DSS와 함께, 상피 점막 염증 및 간질 미세 환경 (16, 17)에 체세포 돌연변이 사이의 상호 작용을 조사하기위한 모델을 제공합니다. AOM 직접 D​​NA 돌연변이 발생하지 않습니다 발암 물질 1,2- 디메틸 하이드라진 (DMH)의 대사 산물이다. 대신, AOM은 MAM은 글루 쿠 론산과 접합하고 담즙 분비 부위 (18)를 통해 이송되어 간에서 시토크롬 이성체 CYP2E1 그래피 (MAM) methylazoxymethanol 가수 분해이다. 이것은 박테리아 β 글루 쿠로니다 아제는 DNA 알킬화 결과 MAM의 열화 19 상피 세포의 돌연변이의 축적에 기여하는 것으로 생각된다. 대부분 AOM 유도 결장 종양은 프로 테오 degradati에 내성 단백질 렌더링 코딩하는 유전자 β 카테닌의 과오 돌연변이 항구정식이 Wnt 신호 전달 경로 (20)의 비정상적인 활성화에 어떤 결과에. AOM의 활성에 의해 유발되는 DSS 점막 손상과 결합되면, 치유 반응 계속되는 돌연변이 된 상처가 상피 세포의 성장과 팽창에 도움이되는 미세 환경을 생성한다. 이 모델의 변형에서, 단독으로 몇 주에 걸쳐 AOM의 반복적 인 투여는 DSS 유도 10,17 대장염의 부재 하에서, 간헐적 인 대장 암을 모델링하는데 사용될 수있다. 이 두 가지 무료 모델은 염증성 종양 미세 환경 (10)과 관련된 두 가지 모두 각각 CAC 산발적 CRC를 연구하는 실험 설정을 제공합니다. 마우스에서 일련 내시경의 사용은 21 베커 동료가 개척 한 대장염 및 종양 진행의 길이 모니터링 할 수 있었다. 여기에서 우리는 DSS에 의한 점막 손상 및 / 또는 AOM 매개 TU에 따라 세 전임상 프로토콜을 제공MOR 유도 재현성 특정 대장 병변을 유도합니다. 첫 번째 프로토콜은 IBD와 관련된 조직 병리학 많은 기능을 유도하기 위해 DSS 관리에 대한 응답에서 급성 점막 손상을 유발 설명합니다. 제 2 프로토콜은 일반적 IBD 환자에서 관찰 된 염증의 플레어를 모방하는 DSS 투여 연속 3주기에 기초하고, AOM 유발 돌연변이와 함께 수행 될 수있다. 최종 프로토콜은 AOM에 의한 산발적 인 상피 돌연변이를 기반으로합니다. 이들 프로토콜 각각에 대해, 우리는 새로운 약물의 효능을 모니터링하도록 개발 예방 및 치료 적 중재 방법을 포함하는 관련 표준 절차에 대한 확장.

<table><tbody><tr><td>Dextran sulfate sodium (MW 36,000-50,000)</td><td>MP Biochemicals</td><td>160110</td><td>Requires batch testing.</td></tr><tr><td>Azoxymethane</td><td>Sigma</td><td>A5486-100MG</td><td>Requires batch testing.</td></tr><tr><td>Vanilla protein shake</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Available from hospital pharmacies.</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>PPC</td><td>M60303</td><td>This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key.</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Standard lab reagent.</td></tr><tr><td>Coloview miniendoscopic system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endovision Tricam</td><td>Karl Storz</td><td>20212001-020</td><td></td></tr><tr><td>Xenon 175 light source with anti-fog pump</td><td>Karl Storz</td><td>20134001</td><td></td></tr><tr><td>HOPKINS straight Forward Telescope</td><td>Karl Storz</td><td>64301AA</td><td></td></tr><tr><td>Endoscopic sheath (total diameter 3 mm)</td><td>Kalr Stroz</td><td>61029C</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic light cable</td><td>Kalr Stroz</td><td>69495ND</td><td></td></tr><tr><td>Computer and media player software</td><td>Apple</td><td></td><td>iMovie</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Any</td><td></td><td>Any scale suitable for weighing mice.</td></tr></tbody></table>

non-invasive assessment of the efficacy of new therapeutics for intestinal pathologies using serial endoscopic imaging of live mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

체중 감량 일상적 마우스의 전반적인 건강을 모니터링하는 데 사용되는 대장염과 관련된 질환에 대해 모니터링 표준 매개 변수로서 사용된다. 동물 DSS가 함유에 물을 투여하는 동안 일반적으로 자신의 체중을 유지하고 정상적인 식수로 돌아 경우에만 느슨한 무게로 시작합니다. 허용 가능한 중량 손실 파라미터는 동물 기관의 윤리위원회에 따라 확립되어야한다. , 장기간 설사와 관련된 탈수를 방지 매쉬의 일상적인 조항을 사용하려면 (음식 펠릿 으깬 마시는 물 혼합) 정상 마시는 물뿐만 아니라 단백질 쉐이크로 보충. 대안 마취, 케타민 / 자일 라진 또는 유사한 제제를 사용할 수있다, 만약 이소 플루 장비를 사용할 수 없습니다. 때문에 내시경의 단단한 특성으로,이 절차는 마우스 대장의 가장 말단 3cm의 시각화 할 수 있습니다. 와 최신 내시경<html> (유연성 및 형광을 포함)의 추가 기능은 실험의 필요에 따라 가능하다. DSS의 해로운 영향은 주로 중간 결장에서 관찰되는 온화한 병리 마우스의 원위 결장에 한정되어 있기 때문에, 강성 내시경 개별 마우스의 점막 상태 모니터링을 방해하지 않는다. 우리가 DSS 유발 급성 대장염의 예방 적 치료를위한 프로토콜을 기술했지만,이 프로토콜은 쉽게 개입 치료 전략을 시험하기 위해 수정 될 수있다. 상피 성 대장염 및 손상을 완화하기위한 약물의 효능은 생쥐에서 종 방향으로 개개의 모니터링되고 설명 스코어링 파라미터들 (도 5)에 기초하여 정량화 될 수있다. 이 실험 프로토콜 중 특정 시점에서 마우스의 컬링을 필요 전통적인 실험 디자인 유리한이고, 시간이 지남에 따라 치료에 대한 질병 반응의 특성화를 허용하지 않는다. <html> t &quot;&gt; 인간에서 임상 연구는 개개의 환자 치료에 어떻게 반응하는지 종양에서의 상당한 변화를 강조 하였다. 여기에서 설명하는 절차는 전체 종양 부담뿐만 아니라 과정을 통해 개개의 종양의 치료 반응을 모니터링하기위한 수단을 제공한다 실험. 그것은 암 모델에 설명 된 중재 프로토콜 고려 종양 개시에 대한 치료 효과를 고려하지 않는다는 것을 고려하는 것이 중요하다. 예방 적 프로토콜, 종양 내시경으로 표시 될 때, 이전에 제공된 치료, 이 정보를 얻기 위해 요구된다. 여기에 설명 된 프로토콜을 진행에서의 치료 효과에 대한 정보를 제공하는 각각의 종양 (종양 크기에 의해 측정). 종양 퇴행이 보일 종양의 수의 감소에 의해 표시 될 수있다. g &quot;/&gt; 도 1 :. 급성 대장 손상 모델에서 예방 적 치료 요법의 효능을 모니터링 (a) 실험 프로토콜은 시작부터 종료까지 8 일이 필요하다. 치료법은 예방 치료를 위해 1 일에서 (나) 관리됩니다. DSS는 실험 프로토콜의 3 일에서 식수 (c)에 제공된다. 내시경 동물에서 질병의 진행을 모니터하기 위해 (d)를 행한다. 제안 시점들은 5 일, 8 (질병 부담을 결정하는) 일 0 (치료)과 2 일 (상태 모니터링)를 포함한다. 실험은 야생형 마우스 (F)은 시간이지나면서 증가 질환의 진행에있어서의 날 (8)의 (E) 아침 종료된다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig2highres.jpg" /> 도 2 : O 모델에서 중재 요법의 효능을 모니터링F 암 대장염 관련. () 실험 프로토콜은 시작부터 완료 72 일이 필요합니다. (b)는 치료제가 개입 트리트먼트의 날 (46)로부터 설립 종양 마우스에 투여된다. AOM (c)는 제 1 일에 주입되고, DSS 8. 내시경 (d)는 동물에서 질병의 진행을 모니터하기 위해 수행되는 날부터, 실험 프로토콜의 3주기의 과정을 통해 음용수 제공된다. 제안 시점들은 (그룹 동물에 종양 부담에 따라)의 날 (치료) 0, 20 일 (상태 모니터링), 일 (40)를 포함한다. 내시경 질병 결과를 모니터링하는 치료 적 처치에 걸쳐 매주 수행된다. 실험 (E)는 40 일 이후부터 증가 야생형 마우스 (F), 종양 부하 (72)의 하루를 아침 종료된다. <img alt="그림 3"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52383 / 52383fig3highres.jpg&quot;/&gt; 그림 3 :. 자연 대장 암의 모델에 개입 치료의 효과를 모니터링 실험 프로토콜 (a)는 시작부터 완료까지&gt; 50주이 필요합니다. (b)는 치료제가 개입 치료에 대한 설립 종양 마우스에 투여된다. AOM (c)는 실험 프로토콜의 과정을 통해, 그 후 6 주간 연속 주입을위한 제 1 일에 주입하고있다. 내시경 (d)는 동물에서 질병의 진행을 모니터하기 위해 수행된다. 제안 시점들은 격주이 (종양 부담을 설정) 후 0 일 (치료)와 8 주 (종양 모니터링) 등이 포함됩니다. 내시경 치료 결과를 모니터링하는 치료 과정 동안 매주 수행된다. 실험 (E)는 40 주째에서 증가 야생형 마우스 (F) 종양 부담을 50 주에 종결된다. </<html> P&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig4highres.jpg" width="650" /> 그림 4 :. 장비 설정 개별 장비와 내시경 장치에 대한 실험 장치 (A)는 지적했다. 개별 구성 요소와 경질 내시경 (b)가 나타났다. 스케일 바 = 2.5 cm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52383/52383fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig5highres.jpg" width="650" /> 그림 5 :. 내시경에 의한 득점 질병 매개 변수 개요 () 성 대장염 심각도의 쥐 내시경 지수 (MEICS)의. 개별 종양 스코어링 파라미터 윤곽 (b).ES / ftp_upload / 52383 / 52383fig5highres.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig6highres.jpg" width="650" /> 그림 6 : 대표 치료 트리트먼트 대표 체중 감량, 내시경 이미지와 점수 :. () 급성 점막 손상을 DSS는 유도 (b)는 순차에 따라 개발 된 AOM / DSS 프로토콜 다음 개발 종양 (C) 종양.. AOM 프로토콜입니다. 그룹 당 N은 = 3 마우스. * P &lt;0.05, *** P &lt;0.001 (학생의 T-시험). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52383/52383fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

라이브 마우스의 직렬 내시경 이미징을 사용하여 소장 병변에 대한 새로운 치료제의 효능의 비 침습적 평가

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K 조회수.  The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research. We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

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Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell proliferation and increased nutrient absorption, are critical in recovery, yet poorly understood. Understanding the molecular mechanism behind the adaptive responses is crucial to facilitate the identification of nutrients or drugs to enhance adaptation. Different approaches and models have been described throughout the literature, but a detailed descriptive way to essentially perform the procedures is needed to obtain reproducible data. Here, we describe a method to estimate important endpoints and proliferative markers of small intestinal injury and compensatory hyperproliferation using a model of chemotherapy-induced mucositis in mice. We demonstrate the detection of proliferating cells using a cell cycle specific marker, as well as using small intestinal weight, crypt depth, and villus height as endpoints. Some of the critical steps within the described method are the removal and weighing of the small intestine and the rather complex software system suggested for the measurement of this technique. These methods have the advantages that they are not time-consuming, and that they are cost-effective and easy to carry out and measure.

Here, we present a protocol to establish important endpoints and proliferative markers of small intestinal injury and compensatory hyperproliferation using a model of chemotherapy-induced mucositis. We demonstrate the detection of proliferating cells using a cell cycle specific marker and using small intestinal weight, crypt depth, and villus height as endpoints.

화학요법 유도점막염의 마우스 모형을 사용하여 작은 장 상해 그리고 적응을 평가하기 위하여 중요한 종점 및 증식 마커

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

연구

암 연구학

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

장 조작의 표준화 된 모델의 분석 : 쥐의 장 운동성 및 내장 벽의 염증의 기능 평가

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

의학

Flexible Colonoscopy in Mice to Evaluate the Severity of Colitis and Colorectal Tumors Using a Validated Endoscopic Scoring System

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental endoscopy has been highly useful for studies that require repeated assessments in a single laboratory animal, such as those evaluating mechanisms of chronic inflammatory bowel disease and the progression of colorectal cancer. However, the methods used across studies are highly variable. At least three endoscopic scoring systems have been published for murine colitis and published protocols for the assessment of colorectal tumors fail to address the presence of concomitant colonic inflammation. This study develops and validates a reproducible endoscopic scoring system that integrates evaluation of both inflammation and tumors simultaneously. This novel scoring system has three major components: 1) assessment of the extent and severity of colorectal inflammation (based on perianal findings, transparency of the wall, mucosal bleeding, and focal lesions), 2) quantitative recording of tumor lesions (grid map and bar graph), and 3) numerical sorting of clinical cases by their pathological and research relevance based on decimal units with assigned categories of observed lesions and endoscopic complications (decimal identifiers). The video and manuscript presented herein were prepared, following IACUC-approved protocols, to allow investigators to score their own experimental mice using a well-validated and highly reproducible endoscopic methodology, with the system option to differentiate distal from proximal endoscopic colitis (D-PECS).

Over the past few years, new generation endoscopes have emerged as important diagnostic research aids for evaluating murine colitis and colorectal tumors. We present herein a detailed protocol for endoscopic assessment of inflammation and colorectal tumors in mice, as well as a novel scoring system that uses decimal identifiers to document the endoscopic severity of colitis and colorectal tumors.

검증 된 내시경 채점 시스템을 사용하여 대장염과 대장 종양의 위험을 평가하기 위해 마우스의 유연한 대장 내시경 검사

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

에 대한 쥐의 내시경<em&gt; 생체</em&gt; 발암 및 소장의 평가의 멀티 모달 이미징 상처 치유 및 염증

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

비디오 이미징 및 시공간지도는 마우스에서 위장관 운동성을 분석하는

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

신경과학

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) face and is frequently associated with a poor clinical outcome. While, for instance, GvHD manifestations of the skin are usually responsive to established immune-suppressive therapies and are, hence, not taking a fatal course, the presence and the intensity of intestinal GvHD, especially of the mid-to-lower parts of the gut, strongly influence the outcome and overall survival of patients with acute GvHD. Therapeutic options are essentially limited to the classic immune-suppressive agents yielding only moderate disease-mitigating effects. Hence, detailed knowledge about the tissue-resident immune cascade, changes in the intestinal microbiota, and the stromal response prior, upon, and after intestinal GvHD onset are urgently needed to understand the events and mechanisms underlying its pathogenesis and to develop innovative therapeutic options. Murine models of GvHD are frequently employed to identify and functionally assess molecules and pathways putatively driving intestinal GvHD. However, means to specifically monitor and evaluate intestinal inflammation over time are essentially lacking since established scores to assess and grade acute GvHD are routinely comprised of various parameters which rather reflect&#160;systemic GvHD manifestations. The detailed evaluation of intestinal GvHD has been restricted to studies using euthanized mice, thereby essentially excluding longitudinal (i.e., kinetic) analyses of the colonic compartment under a given experimental condition (e.g., antibody-mediated blockade of a proinflammatory cytokine) in live mice (i.e., in vivo). The mini-endoscopic in situ assessment of the distal colon of allo-HCT-treated mice described here allows a) a detailed macroscopic evaluation of different aspects of intestinal inflammation and b) the option to collect tissue samples for downstream analyses at various time points over the course of the observation period. Overall, the mini-endoscopic approach provides a major advance in preclinical noninvasive monitoring and assessment of intestinal GvHD.

Here, we present a protocol that describes allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and allows repetitive mini-endoscopic evaluations of the distal colon in situ for the presence, characteristics, and severity of colonic inflammation within live mice suffering from intestinal graft-versus-host disease.

장 이식-비교-호스트 질병 및 라이브 쥐에서 미니 내 시경 평가의 유도

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

면역학 및 감염병학

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. Therefore, the intestinal mucosa of anesthetized mice is topically stained with unspecific staining (acriflavine) and a fluorescent tracer (rhodamine-B dextran), mounted on a saline solution-rinsed plate and directly imaged using a confocal microscope. This technique can complement other non-invasive techniques to identify leakage of intestinal permeability, such as transmucosal passage of orally administered tracers. Besides this, the approach presented here allows the direct observation of cell shedding events at real-time. In combination with appropriate fluorescent reporter mice, this approach is suitable for shedding light into cellular and molecular mechanisms controlling intestinal epithelial cell extrusion, as well as to other biological processes. In the last decades, interesting studies using intravital microscopy have contributed to knowledge on endothelial permeability, immune cell gut homing, immune-epithelial communication and invasion of luminal components, among others. Together, the protocol presented here would not only help increase the understanding of mechanisms controlling epithelial cell extrusion, but could also be the basis for the developmental of other approaches to be used as instruments to visualize other highly dynamic cellular process, even in other tissues. Among technical limitations, optical properties of the specific tissue, as well as the selected imaging technology and microscope configuration, would in turn, determine the imaging working distance, and resolution of acquired images.

Taking advantage of intravital microscopy, the method presented here enables real-time visualization of intestinal epithelial cell shedding in living animals. Therefore, topically stained intestinal mucosa (acriflavine and rhodamineB-dextran) of anesthetized mice is imaged up to single-cell resolution using confocal microscopy.

장 내 투과성 및 상피 세포 흘리기 성능을 평가하기 위한 인트라바이탈 현미경 기반 접근법

Intravital microscopy of the gut using confocal imaging allows real time observation of epithelial cell shedding and barrier leakage in living animals. ...

Performing Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice and Evaluating Subsequent Tissue Changes

Understanding the tissue and cellular changes that occur in the acute injury response as well as during the wound healing process is of paramount importance when studying diseases of the gastrointestinal (GI) tract. The murine colonic pinch biopsy model is a useful tool to define these processes. Additionally, the interplay between gut luminal content (e.g., microbes) and the colon can be studied. However, wound induction and the ability to track wound closure over time in a reliable manner can be challenging. Moreover, tissue preparation and orientation must be carried out in a standardized way to optimally interrogate histologic and molecular changes. Here, we present a detailed method describing biopsy-induced injury and the monitoring of wound closure through repeat colonoscopies. An approach is described that ensures consistent and reproducible measurements of wound size, the ability to collect the wound bed for molecular analyses as well as visualize the wound bed upon sectioning of tissues. The ability to successfully carry out these techniques allows for studies of the acute injury response, wound healing and luminal-host interactions within the colon.

Here, we provide a detailed description of the procedure to induce colonoscopic-guided pinch biopsies in mice and track wound closure in real time. Additionally, methods for the preparation of tissues for histological, immunohistochemical and molecular analyses of the wound bed are provided.

마우스에서 대장 내 시경 유도 핀치 생검을 수행하고 후속 조직 변화를 평가

Understanding the tissue and cellular changes that occur in the acute injury response as well as during the wound healing process is of paramount ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...