Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la evaluación de efectos de fármacos terapéuticos en el campo de la endometriosis, como los efectos de los compuestos anti-androgénicos en el tamaño de las lesiones endometróticas. La principal ventaja de esta técnica es que los efectos de los fármacos específicos se pueden evaluar en modelos animales de endometriosis en tiempo real, en lugar de en el punto final. Demostrando el procedimiento estarán Jessica Martínez, que es una técnico de mi laboratorio, así como Viviana Bisbal y Nerea Marín, que son veterinarias del Centro de Investigación Príncipe Felipe y que son estrechas colaboradoras con nuestro equipo.
Dos a tres días antes de la cirugía del implante, transfiera fragmentos de biopsia de tejido endometrial sano y enjuagado en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga un medio completo, y use bisturíes para picar el tejido en trozos en cubos de cinco a 10 milímetros. Usando una micropipeta, agregue de 30 a 50 microlitro gotas de DMEM en la parte inferior de un nuevo plato de cultivo de 10 centímetros, dejando suficiente espacio entre cada gota para que no entren en contacto entre sí. Cuando se hayan colocado todas las gotas, utilice una aguja de jeringa para colocar una sola pieza de fragmento de tejido de biopsia en cada gota.
A continuación, añada de 100 a 200 microlitros de adeno-mCherry recién preparado a un pozo de una placa de 96 pozos por fragmento de tejido, más tres pozos con DMEM libre de adenovirus como control negativo. A continuación, utilice la aguja para transferir una muestra de tejido a cada pocótule de adeno-mCherry para una incubación durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de CO2. A la mañana siguiente coloque la placa en una etapa del microscopio de fluorescencia y utilice un láser de 568 nanómetros para comprobar los fragmentos para un etiquetado óptimo.
El uso de la dilución adecuada de adenovirus mCherry infecte es clave para un etiquetado eficiente del tejido. Por lo tanto, para determinar la concentración adecuada, varios para la dilución de mCherry, para cada experimento individual, tienen que ser evaluados. A continuación, transfiera los fragmentos más brillantes a pozos individuales de una nueva placa de 96 pozos que contenga un medio fresco y completo.
Al menos siete días después de la ooforectomía, decantar los fragmentos de tejido endometrial en un plato de Petri, y confirmar una falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo en un animal anestesiado, ooforectomizado. Con el ratón en posición supina desinfectar el área ventral y hacer una incisión longitudinal de 1,5 centímetros en el abdomen. Separe la piel del músculo y haga una segunda incisión de 1,5 centímetros en el músculo para acceder a la cavidad peritoneal.
Sosteniendo el borde izquierdo de la pared muscular abdominal con mini-fórceps, dobla el músculo para exponer la cara interna del peritoneo en el exterior del animal. Utilice mini pinzas para remojar brevemente un implante endometrial en adhesivo de cianoacrilato de éster de n-butilo y unir el fragmento al peritoneo. Cuando el adhesivo se seque, coloque un segundo implante en el lado contralateral del peritoneo como acaba de demostrar.
Utilice una sutura absorbible 6-0 para cerrar la capa muscular y una sutura no absorbible 6-0 para cerrar la piel. A continuación, limpie la incisión cutánea con solución antiséptica y coloque el animal en la zona de recuperación con monitorización hasta la recumbencia completa. Para la toma de imágenes fluorescentes in vivo de los fragmentos de tejido implantados, 24 a 48 horas después de la cirugía de implantación encienda el sistema de imágenes en vivo, inicialice el software y permita que la cámara CCD se enfríe durante unos minutos.
Una vez que el instrumento esté listo coloque el primer ratón anestesiado en la jaula del sistema de imágenes in-vivo, en la posición supina, con la cabeza dentro de un tubo conectado a la máquina de anestesia, y cierre la tapa. A continuación, haga clic en adquirir y guarde las cinco imágenes resultantes. Para cuantificar la fluorescencia in vivo, en el software de análisis de imágenes adecuado, haga clic en Examinar y seleccione el archivo no comprimido de interés que desea analizar.
Aparecerá una nueva ventana. Haga clic en Agregar a la lista para incluir todos los archivos no mezclados de cada animal en diferentes puntos de tiempo y haga clic en cargar como grupo. Todas las imágenes deben aparecer en una sola secuencia.
En la ventana de la paleta de herramientas, anule la selección de la casilla de verificación de escala individual para ajustar todas las imágenes a la misma escala y haga doble clic en una imagen de la secuencia. Para crear una región de interés, en la región de interés las herramientas seleccionan el contorno y las opciones automáticas una, y haz clic en la forma del círculo para colocar el círculo en el centro de la señal fluorescente. Haga clic en Crear para crear la región de interés y copiar y pegar la región de interés en un fondo donde no haya señal.
A continuación, haga clic en medir regiones de interés y seleccione todas para mostrar los valores de la intensidad de fluorescencia de cada región y copie y pegue estos valores en una hoja de cálculo. El etiquetado de los fragmentos endometriales se logra mediante una infección por adenovirus diseñado para expresar mCherry, una proteína que emite fluorescencia en la sección infrarroja cercana que es significativamente más robusta que la autofluorescencia de tejido endometrial no infectado. Durante la monitorización, además de la longitud de onda de referencia para mCherry, se toman imágenes fluorescentes con diferentes pares de filtros de longitud de onda de emisión de excitación.
Para definir los perfiles característicos de emisión de tejido fluorescente de las lesiones del fondo, y la autofluorescencia emitida por los tejidos del huésped, las imágenes de monitorización que contienen fluorescencia cruda emitida por los animales durante cada punto de tiempo se unen, sin normalizar, en un solo archivo. A continuación, la fluorescencia no se mezcla, se normaliza y se representa como una imagen de color falsa, y las regiones de intereses correspondientes a señales de legión y fondo específicas son automáticamente reconocidas por el programa y cuantificadas. La región de fondo de señalización de interés se resta de la región legión de señalización de interés.
Y los resultados de la intensidad en cada punto de tiempo se normalizan contra el punto de tiempo en el que la intensidad es máxima. Después de varias semanas de monitoreo, los implantes viables se pueden recuperar para un análisis posterior. Al intentar este procedimiento es importante recordar seleccionar la concentración de Ad-mCherry que proporciona la señal más brillante sin comprometer la viabilidad del tejido.
Después de este procedimiento, las lesiones se pueden recuperar y utilizar para estudiar parámetros distintivos adicionales. Este procedimiento está optimizado para la monitorización no invasiva de lesiones de xenointriosis humana. Sin embargo, se puede adaptar fácilmente para evaluar los efectos de un fármaco específico de interés en los sitios de un xenoinjerto en tiempo real.
