Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella valutazione degli effetti terapeutici dei farmaci nel campo dell'endometriosi, come gli effetti dei composti anti-androgeni sulle dimensioni delle lesioni endometriotiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli effetti dei farmaci specifici possono essere valutati nei modelli animali di endometriosi in tempo reale, piuttosto che all'endpoint. A dimostrare la procedura saranno Jessica Martinez, che è una tecnico del mio laboratorio, così come Viviana Bisbal e Nerea Marin, che sono veterinari del Centro de Investigacion Principe Felipe e che sono stretti collaboratori del nostro team.
Da due a tre giorni prima dell'intervento chirurgico dell'impianto, trasferire frammenti di biopsia del tessuto endometriale risciacquati e sani in una piastra di Petri di 10 centimetri contenente mezzo completo e utilizzare bisturi per tritare il tessuto in pezzi a cubetti da cinque a 10 millimetri. Utilizzando una micropipetta, aggiungere da 30 a 50 gocce di microliter di DMEM sul fondo di un nuovo piatto di coltura di 10 centimetri, lasciando abbastanza spazio tra ogni goccia in modo che non entrano in contatto tra loro. Quando tutte le gocce sono state posizionate, utilizzare un ago per siringhe per posizionare un singolo pezzo di frammento di tessuto di biopsia in ogni goccia.
Successivamente, aggiungere da 100 a 200 microlitri di adeno-mCherry appena preparati a un pozzo di una piastra da 96 porri per frammento di tessuto, più tre pozzi con DMEM privo di adenovirus come controllo negativo. Quindi utilizzare l'ago per trasferire un campione di tessuto in ogni pozzo di soluzione adeno-mCherry per un'incubazione notturna a 37 gradi celsius e 5%CO2. La mattina seguente posizionare la piastra su uno stadio di microscopio a fluorescenza e utilizzare un laser da 568 nanometri per controllare i frammenti per un'etichettatura ottimale.
L'uso dell'appropriata diluizione dell'infezione da adenovirus mCherry è fondamentale per un'etichettatura efficiente del tessuto. Pertanto, per determinare la concentrazione appropriata, è necessario valutarsi diversi per la diluizione di mCherry, per ogni singolo esperimento. Quindi trasferire i frammenti più brillanti in singoli pozzi di una nuova piastra da 96 pozza contenente mezzo fresco e completo.
Almeno sette giorni dopo l'oophorectomia, decantare i frammenti di tessuto endometriale in una piastra di Petri e confermare la mancanza di risposta al pizzico in un animale anestetizzato e ooforrectomizzato. Con il topo in posizione supina disinfettare l'area ventrale e fare un'incisione longitudinale di 1,5 centimetri nell'addome. Separare la pelle dal muscolo e fare una seconda incisione di 1,5 centimetri nel muscolo per accedere alla cavità peritoneale.
Tenendo il bordo sinistro della parete muscolare addominale con mini-forcep, piegare il muscolo per esporre la faccia interna del peritoneo all'esterno dell'animale. Utilizzare mini-pinzette per immergere brevemente un impianto endometriale nell'adesivo cianoacrilato n-butile estere e attaccare il frammento al peritoneo. Quando l'adesivo viene asciugato, posizionare un secondo impianto sul lato conlaterale del peritoneo come appena dimostrato.
Utilizzare una sutura assorbibile 6-0 per chiudere lo strato muscolare e una sutura 6-0 non assorbibile per chiudere la pelle. Quindi pulire l'incisione cutanea con soluzione antisettica e posizionare l'animale nella zona di recupero con il monitoraggio fino alla piena rimescenza. Per l'imaging fluorescente in vivo dei frammenti di tessuto impiantato, da 24 a 48 ore dopo l'intervento chirurgico di impianto accendere il sistema di imaging in vivo, inizializzare il software e consentire alla fotocamera CCD di raffreddarsi per alcuni minuti.
Una volta che lo strumento è pronto posizionare il primo mouse anestetizzato nella gabbia del sistema di imaging in vivo, in posizione supina, con la testa all'interno di un tubulo collegato alla macchina per anestesia e chiudere il coperchio. Quindi fare clic su acquisisci e salva le cinque immagini risultanti. Per quantificare la fluorescenza in vivo, nell'apposito software di analisi delle immagini fare clic su sfoglia e selezionare il file non mixed di interesse da analizzare.
Verrà visualizzata una nuova finestra. Fare clic su Aggiungi all'elenco per includere tutti i file non mesati di ogni animale in diversi punti di tempo e fare clic su Carica come gruppo. Tutte le immagini devono essere visualizzate in un'unica sequenza.
Nella finestra della tavolozza degli strumenti deselezionare la casella di controllo Scala singola per regolare tutte le immagini sulla stessa scala e fare doppio clic su un'immagine della sequenza. Per creare un'area di interesse, nella regione di interesse gli strumenti selezionano le opzioni contorno e auto una e fate clic sulla forma cerchio per posizionare il cerchio al centro del segnale fluorescente. Fare clic su crea per creare l'area di interesse e copiare e incollare l'area di interesse su uno sfondo in cui non è disponibile alcun segnale.
Quindi fare clic su misura aree di interesse e selezionare tutto per visualizzare i valori per l'intensità di fluorescenza di ogni regione e copiare e incollare questi valori in un foglio di calcolo. L'etichettatura dei frammenti endometriali è ottenuta per infezione da adenovirus progettato per esprimere mCherry, una proteina che emette fluorescenza nella sezione del vicino infrarosso che è significativamente più robusta dell'autofluorescenza del tessuto endometriale non infetto. Durante il monitoraggio, oltre alla lunghezza d'onda di riferimento per mCherry, vengono scattate immagini fluorescenti con diverse coppie di filtri di lunghezza d'onda di emissione di eccitazione.
Per definire i caratteristici profili di emissione dei tessuti fluorescenti delle lesioni dallo sfondo e l'autofluorescenza emessa dai tessuti ospiti, le immagini di monitoraggio contenenti fluorescenza grezza emessa dagli animali durante ogni punto di tempo vengono riunite, non normalizzate, in un unico file. Successivamente, la fluorescenza viene unmixed, normalizzata e rappresentata come una falsa immagine a colori, e le regioni di interesse corrispondenti a specifici segnali di legione e sfondo vengono automaticamente riconosciute dal programma e quantificate. La regione di fondo di segnalazione di interesse viene sottratta dalla regione legione di segnalazione di interesse.
E i risultati dell'intensità in ogni punto di tempo sono normalizzati rispetto al punto di tempo in cui l'intensità è massima. Dopo diverse settimane di monitoraggio, gli impianti vitali possono essere recuperati per ulteriori analisi a valle. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di selezionare la concentrazione di Ad-mCherry che fornisce il segnale più brillante senza compromettere la vitalità del tessuto.
Seguendo questa procedura, le lesioni possono essere recuperate e utilizzate per studiare ulteriori parametri distintivi. Questa procedura è ottimizzata per il monitoraggio non invasivo delle lesioni dell'endometriosi umana xenograft. Tuttavia, può essere facilmente adatto per valutare gli effetti di uno specifico farmaci di interesse sui siti di uno xenograft in tempo reale.
