Name: evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection at JoVE.com

이 연구 재정적으로 일부 의학-생물학 연구 (미국적)를,는 고트프리트 줄리아 Bangerter-Rhyner-재단 (MW 미국적)를, 그리고 Fribourg의 대학 (에 미국적)의 연구 수영장에 대 한 노바 티 스 재단에 의해 지원 되었다. 추가 보조금 외국 학자 (갑과 SM) 스위스 정부 우수 장학금 포함 됩니다. 우리 기술 지원에 대 한 이자벨 Fellay와 Solange Kharoubi 헤스 감사합니다.

인간의 Rbc는 Swissethics (swissethics.ch)의 지침에 따라 건강 한 기증자의 혈액에서 얻은 했다.
참고: P. falciparum 기생충 문화 (3D 7)와 EV 생산은 이전에 설명 된 Mbagwu, 외 알. 11 P. falciparum 인간의 병원 체 이기 때문에 처리에 대 한 현지 규정을 참조 하십시오. 문화는 유지 되어야 한다 살 균 전체 시간.
1. 형광 EVs의 라벨
참고: 다음 절차는 EV 막의 지질 지역에서 큰 지방 족 꼬리와 안정적으로 녹색 형광 염료 (PKH67)를 통합 하는 라벨 기술 이용 합니다. 반응은 200 µ L PKH67의 20 µ M 최종 농도 포함 하는 볼륨을 얼룩 마지막에 수행 됩니다. 주위 온도 (20-25 ° C)에서 모든 단계를 수행
<ol><li>장소 100 µ g EVs의 microcentrifuge 튜브에 PBS의 1 mL에.</li>
	<li>펠 렛를 7 분에 대 한 최대 속도 (20000 x g) microcentrifuge 관에서 EVs 원심 참고: 말라리아 EVs에 존재 이므로, 레드-어두운 갈색 펠 릿 관찰 해야. 경우는 상쾌한 붉은, 다음 EVs 있다 lysed.</li>
	<li>원심, 후 어떤 EVs를 제거 피하기 위하여는 상쾌한을 신중 하 게, 발음. 참고: 재현성 및는 얼룩의 효율성을 증가 하기 위하여 희석제 C에 EVs를 resuspending 하기 전에 나머지 버퍼의 양을 최소화 합니다.</li>
	<li>희석제 C의 100 µ L에서 EV 펠 릿 resuspend (EV 정지 X 2)와 완전 한 분산을 막으려고 피펫으로 부드럽게.</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 튜브를 준비 하 고 희석제 C. 소용돌이 잘 혼합의 100 µ L을 PKH67 ethanolic 염료 솔루션의 4 µ L를 추가 합니다. 얼룩이 지기 직전이 2 배 염료 솔루션 (40 µ M)를 준비 합니다. 참고: 이기종 얼룩을 방지 하려면 추가 하지 마십시오 PKH67 ethanolic 염료 솔루션 EV 펠 릿에 직접.</li>
	<li>빠르게, 염료 솔루션 (단계 1.5) X 2의 100 µ L EV 정지 (단계 1.4) X 2의 100 µ L 결합 되어 있습니다. 그런 다음 10 번 위아래로 pipetting으로 샘플을 혼합.</li>
	<li>빛과 믹스에서 vortexing에 의해 3-4 회 동안 보호 5 분 인큐베이션 단계 1.6 5 분에서에서 EV/염료 정지를 품 어. 참고: 긴 시간에 대 한 EV/염료 정지 잠복기 때문에 얼룩이 지는 그래서 빠른 이점이, 제공 합니다.</li>
	<li>혈 청의 동일한 볼륨 (200 µ L)를 추가 하 여 착 색 반응 중지 하 고 과잉 염료의 바인딩 수 있도록 1 분 동안 품 어. 참고: 얼룩이 지는 중지 하기 전에 20 분 20000 x g에서 원심 분리 하 여 EVs에서 혈 청을 고갈 합니다.</li>
	<li>PBS로 3 번 세척 하 고 스핀 다운 5 분에 대 한 20000 x g에서 1 µ g / µ L의 최종 농도 도달 하는 PBS의 100 µ L에 EVs를 Resuspend.</li>
</ol>2. Confocal 현미경 검사 법에 의해 EVs의 시각화
참고: 다음 프로토콜 설명 유리 coverslips에 성장 하는 내 피 세포에 의해 EV 국제화의 추적을 합니다. 내 피 세포는 반 불멸 하 게 인간의 골 수 내 피 세포12에 설명 된 대로.
<ol><li>메 마른 환경에서 working coverslips 0.01% 폴 리-L-리 신 실 온 (RT)에서 10 분의 초과 코트.</li>
	<li>폴 리-L-리 신 솔루션을 발음 하 고 완전히 말리는 것을 coverslips 허용.</li>
	<li>Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 내 피 세포 수를 수행 합니다.</li>
	<li>완전 한 내 피 세포 성장 매체 폴 리-L-리 신-코팅 coverslips에 보충 혼합을 포함 하 고는 단층에 성장 하는 세포의 1 mL에 1 x 105 내 피 세포를 전송 합니다. 참고: 매체 성장 인자 세포는 단층을 형성 하 고 꽉 접합을 형성 있도록 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>세포는 단층을 형성, 일단 신중 하 게 매체를 발음 하 고 셀을 씻어 신선한 매체의 1 mL를 추가 합니다. 한 번 더 세척을 반복 합니다. PKH67 표시 된 EVs의 50 µ g을 추가 하 고 4 시간 품 어. 참고: 통풍 관에 대 한 최적의 시간 포인트를 찾으려고 한 시간 코스 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>4 h 후 매체, 발음 하 고 3 회 초과 및 언바운드 EVs를 제거 하는 PBS 가진 세포를 씻어. 15 분에 대 한 PBS에 3 %paraformaldehyde 솔루션 셀을 수정 합니다. 참고: 메탄올 중단 될 수 있습니다 걸 고정 과정; 따라서, fixatives 또는 다른 용 매 기반 fixatives 포함 된 어떤 메탄올을 피하기 위해 최상 이다. 메탄올-무료 포 름 알 데히드는 정착 액으로 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>3 회 PBS로 세포 세척. 0.1%의 신중 하 게 250 µ L 추가 세포를 permeabilize에 PBS에 트라이 톤 X-100. 5 분에 대 한 RT에서 품 어.</li>
	<li>PBS로 3 회 세척. 일반적인 바인딩을 차단 하는 RT에 30 분 동안 차단 버퍼 (PBS에 5 %BSA)의 400 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>PBS 한번 셀을 씻어. 5 µ L의 각 커버 슬립 당 200 µ L PBS/1% BSA의 phalloidin 재고 솔루션 diluting 하 여 얼룩 솔루션을 준비 합니다. 피펫으로 200 µ L는 coverslip에 얼룩 솔루션의 실시간에서 20 분 동안 품 어 고</li>
	<li>PBS로 3 회 세척. 30에 대 한 DNA counterstain 2 µ g/mL PBS의 200 µ L에서의 최종 농도에 Hoechst 33342 s.</li>
	<li>PBS의 400 µ L을 추가 하 여 2는 coverslip 배를 씻어. 조심 스럽게 집게는 coverslip 잡아 하 고 유리 슬라이드에 미디어를 마운트 하는 antifade의 드롭 상단 반전. 부드럽게 휴지로 초과 미디어를 제거 하 고 매니큐어와 양쪽 인감.</li>
	<li>4 ° c.에 빛에서 보호 하는 슬라이드 저장</li>
	<li>레이저 업무가 405, 488, 543 nm와 63 X, 형광 방출 450-470 nm (파란색), 505-530 nm (녹색), 및 620에서 1.3 나 오일 목표에 confocal 현미경을 사용 하 여 셀을 시각화 nm. 참고: 일반적인 F-말라 얼룩 결과 그림 1에 표시 됩니다.</li>
</ol>3. 내 피 세포 침투성
참고: 내 피 세포 침투성 내 피 세포 단층에 걸쳐 rhodamine B isothiocyanate-dextran (평균 MW 70000)의 이전을 측정 하 여 평가입니다. Dextran 혈관 침투성을 공부 하는 훌륭한 도구를 제공 합니다.
<ol><li>0.4 %Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 내 피 세포를 계산 합니다.</li>
	<li>24-잘 조직 문화 삽입 (0.4 µ m 기 공 크기)와 차별화 된 monolayers를 적어도 5 일 동안 그대로 두고 합류 105 셀 x 0.6의 밀도에서 내 피 세포 격판덮개 두 번째 매일 매체를 새로 고칩니다.</li>
	<li>세포는 단층에 도달, 로드 EVs (1 mL에서 50 µ g) 상단 챔버에. 20 mg/mL의 최종 농도에서 최고 잘 rhodamine dextran을 추가 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>40 µ L 중간 aliquots에서 형광 방출 측정에 의해 잘 아래 형광 dextran의 이전을 모니터링 합니다. 544 nm 여기 및 측정에 대 한 590 nm 방출에서 다중 레이블 microplate 리더를 설정 합니다. 참고: 확산된 dextran 양의 수 측정할 수 재고 솔루션 설립 보정 곡선을 사용 하 여. 또한, 운동 실험 시간 과정 (그림 2) 외부 챔버 매체의 작은 샘플을 제거 하 여 수행할 수 있습니다. 어떤 치료 없이는 dextran 셀 단층을 통해 무마 합니다.</li>
</ol>4. 결정 Puromycin 감도
참고: lentivirus와 셀 라인을 시험 하기 전에 그것은 그 특정 셀 라인에 대 한 선택 된 약물의 kill 곡선을 결정 하는 것이 중요. 모든 셀, 선택 된 약물의 증가 복용량을 사용 하는 복용량 응답 실험을 수행 하는 데 필요한 약물 농도의 최소 금액을 결정 합니다. 각 포유류 세포 라인 실험, 전에 다른 감도 있기 때문에 항생제의 최적 농도 아래 서 kill 곡선 적정 개발 하 여 결정 되어야 합니다.
<ol><li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 완전 한 내 피 세포 성장 매체 포함 하는 보충 믹스에에서 1 x 105 셀/mL의 농도에서 내 피 세포 resuspend</li>
	<li>내 피 세포 성장 매체의 100 µ L의 최종 볼륨에서 96 잘 접시로 플레이트 1 x 104 셀.</li>
	<li>0.1-10 µ g/mL의 농도 얻기 위해 항생제를 포함 하는 매체의 100 µ L를 추가 ( 그림 3참조).</li>
	<li>세포 생존 능력 20 X 목표를 사용 하 여 가벼운 현미경 2 일 마다 검사 합니다. 10 월 14 일에 대 한 셀을 문화 고 puromycin 세포 성장에 따라 매 2-3 일을 포함 하는 미디어를 대체 합니다.</li>
	<li>10 µ L/잘 MTS 시 약 각 잘 믹스에 추가 하 고 표준 문화 조건에서 37 ° C에서 4 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>짧게 통에 접시를 흔들 및 490에서 플레이트 리더를 사용 하 여 치료 및 치료 세포의 흡 광도 측정 nm (그림 3).</li>
</ol>5. 변환 Lentiviral 벡터와 내 피 세포의
<ol><li>플레이트 1 x 10의 완전 한 매체 변환 전에 하루 1 mL에 내 피 세포를5 . 셀에는 50-80 %confluency 도달 했습니다 때 변환을 수행 합니다.</li>
	<li>얼음, lentivirus 녹여 그리고 freeze-thaw 주기를 피하기 위해 바이러스의 aliquots. 스핀 30 200 x g에서 자료 다운 유출 피하기 위하여 열기 전에 튜브에 s.</li>
	<li>Hexadimethrine 브 로마 이드 8 µ g/mL의 최종 농도에 셀을 추가 합니다. 그러나 참고: Hexadimethrine 브 로마 이드 어떤 경우에는 셀에 대 한 독성이 있을 수 있습니다 변환 효율을 도움이 됩니다. 따라서, 변환 하기 전에 죽이 곡선을 수행 하 여 최적의 농도 결정 한다.</li>
	<li>부드럽게 혼합 하 판을 소용돌이 친다. 감염 (MOI)의 적당 한 복합성에 (0.5-2 x 106 입자) 사이 바이러스 성 입자의 적절 한 수량을 추가 하 고 부드럽게 30 대 판 소용돌이를 섞어 s.</li>
	<li>변환 효율을 높이 300 x g에서 45 분 RT에서 원심 분리기에서 셀 바이러스 성 입자 혼합 원심 37 ° C에서 셀 바이러스 성 입자 혼합물을 밤새 품 어.</li>
	<li>신중 하 게 바이러스 입자에 포함 된 매체를 제거 하 고 적절 하 게 삭제. 신선 하 고, 미리 데워 진 완전 한 문화 매체 바꿉니다.</li>
	<li>두 번째 날에 puromycin 선택 시작: 매체를 제거 하 고 신선한 매체 puromycin 섹션 4 (그림 3)에서 이전 결정의 정확한 농도 포함 하.</li>
	<li>Puromycin 선택 후 세포를 수확 하 고 RNA는 RNA 키트 제조업체의 지침에 따라 격리를 사용 하 여 분리.</li>
	<li>선택 된으로 cDNA 합성을 수행 miRNAs 반전 녹음 방송을 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>13인용된 프로토콜 따라 정량 반응을 설정 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas 등 여러 기생충 감염 된 주인 세포에 의해 EVs의 석방을 트리거합니다. 병원 체에 따라 출시 된 EVs 호스트 면역 반응을 조절 하거나 기생충6사이 셀룰러 통신을 중재 수 있습니다. 그러나, 이러한 작은 소포 말라리아 질병에 기여 하는 방법을 제안 하는 조금 기록이 있다. 여기, 우리는 변형 체 감염 동안 EVs의 기능을 조사 하기 위해 여러 ...

세계 보건 기구에 따르면 말라리아의 212 백만 새로운 경우 2015 년에 전세계 있었고 약 429,000 명이 사망, 주로 어린이 나이1의 5 년. 종종 연관 된 혈관 부전, 심한 질병으로 이어지는 메커니즘 남아 병이 정의2. 변형 체iRBCs extracellular 소포 (EVs)로 알려진 작은 이중 지질 막 분야 분 비. 그것은 알려져 이러한 EVs는 잠재적으로 관련 감염 프로세스 및 호스트 면역 반응 감염; 그러나, 약간 말라리아 감염3동안 이러한 작은 소포의 정확한 기능에 대 한 알려져 있다. 그들은 두 가지 중요 한 역할을 재생 가능: 한 반면에, 그들은 수 있습니다 기여할 병 인 세포4,5;를 활성화 하 여 그리고 다른 한편으로, 그들은 셀룰러 통신 기생충 및 기생충과 호스트6,7을 중재할 수 있습니다. 사실, EVs를 통해 서로 간의 기생충 단백질 또는 핵 산을 전송할 수 있습니다. 예를 들어 Trypanosoma brucei rhodesiense EVs 독성 요소 Serum Resistance-Associated (SRA)를 전송할 수 있습니다 그리고 다른 T. brucei 와 호스트 모두 적혈구8타겟팅 할 수 있습니다. 또한, P. falciparumiRBCs EVs 내의 핵 산을 전송 하 여 서로 간에 통신 합니다. 기생충을 최적화 하 고의 성장을 동기화 수 있습니다. 사실, EVs gametocyte 변환의 주요 레 귤 레이 터 수 되 고 따라서 전송 단계7의 규정에 기여.
뿐만 아니라 EVs는 기생충을 통제, 그들은 또한 기생충-호스트 상호 작용을 중재. 우리는 최근에 iRBCs에서 EVs 호스트 파생 microRNAs (miRNAs; 21-25의 뉴클레오티드9의 범위에 작은 RNA 종) 인간의 내 피 세포에 의해 채택 되었다을 포함 발견 했다. EVs에 miRNAs 안정 Ago2와 복잡 한 형성 (구성원 RNA 유도 침묵의 복잡 한), 받는 사람 세포에 전달 되 면 구체적으로 유전자 발현을 침묵 하 고 셀10의 장벽 속성에 영향을 미치는입니다. 표준 프로토콜 EVs의 기능을 조사 하기 위해 개발 되었습니다. 자, 먼저 받는 사람 세포에 의해 그들의 통풍 관을 조사 하기 위해 EVs의 형광 라벨 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, confocal 현미경을 사용 하 여 셀 내부 EV의 운명을 추적 수는. 여러 형광 염료 EVs를 추적을 사용할 수 있습니다. 아민-반응성 염료, 5-(and-6) Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 그리고는 소포 안에 한 번 Calcein-오전 될 형광. 밝게 하 고 더 많은 일정 한 신호를 제공 하기 때문에 우리 PKH, amphiphilic 레이블을 사용을 선호 합니다. 이 방법은 EVs와 받는 사람 세포 간의 상호 작용을 이해 하는 중요 한 정보를 제공 합니다. 경우에 따라 EVs는 세포의 표면에 묶는, 하는 동안 일부 소포는 급속 하 게 채택 되었다. 글귀, 시 EVs는 그들은 그들의 규정 하는 기능을 발휘 하는 세포에 그들의 화물을 제공 합니다.
여기, 우리는 세포 단층을 통해 형광 dextran의 전송을 측정 하 여 체 외에서 내 피 세포의 장벽 기능을 측정 하는 프로토콜을 설명 합니다. 방사선된 마커 같은 더 민감한 추적기를 사용할 수 있습니다. 그러나, 그들은 사용 하기 위해 특별 한 안전 조치를 요구 한다. 다른 분석 실험 꽉 접합 무결성 측정 transendothelial 전기 저항 (TEER) 같은 생체 외에서 의 장벽 기능을 측정 하기 위해 존재 한다. 마지막으로 조로-1, 긴밀 접합 단백질 면역 형광에 의해 시각화 뿐만 아니라10으로 꽉 접합 무결성 평가 수 있습니다. EVs 잠재적인 규정 특성을 가진 여러 화물을 포함 하는 복잡 하 고 유형이 다른 엔터티 있기 때문에, 그것을 받는 사람 세포에 미치는 영향을 연구 하는 특정 RNA overexpress 유용 합니다. 따라서, 우리는 또한 관심10의 miRNA를 표현 안정적 셀 라인을 생성 하는 것을 목표로 하는 프로토콜을 정의 합니다.

<table><tbody><tr><td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Diluent C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin CF594</td><td>Biotium</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&amp;ndash;Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Insert with PET membrane transparent Falcon&amp;nbsp;for plate 24 wells</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth&amp;nbsp;Medium MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>hsa-mir-451a&amp;nbsp;RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

말라리아는 변형 체 기생충으로 인 한 생명이 질병, P. falciparum 되 가장 아프리카 대륙에서 우세 하 고 대부분 말라리아 관련 사망자에 대 한 책임 세계적으로. 조직, 혈관 부전, 및 염증 응답 기생충 격리 등 여러 가지 요인 말라리아에 감염 된 사람들에 있는 질병의 진화에 영향. P. falciparum-감염 된 적혈구 (iRBCs) 출시 작은 extracellular 소포 (EVs) 기생충과 호스트 사이의 pathogenesis 및 휴대 통신을 중재 하는 화물 분자의 다른 종류를 포함. EVs는 효율적으로 있는 그들은 그들의 기능을 조절 하는 세포에 의해 촬영. 여기 우리는 기생충-호스트 상호 작용에서 EVs의 역할을 해결 하기 위해 전략을 논의. 첫째, 우리는 녹색 셀 링커 염료를 사용 하 여 레이블 및 내 피 세포에 의해 EV 국제화를 추적 간단 방법을 설명 합니다. 둘째, 우리 보고 붙일 레이블된 dextran을 사용 하 여 내 피 세포 단층에서 침투성을 측정 하는 간단한 방법. 마지막으로, 우리 내 피 세포 기능에 작은 비 코딩 RNA 분자의 역할을 조사 하는 방법을 보여 줍니다.

여기, 우리 호스트 셀 EVs의 상호 작용을 조사 하는 프로토콜을 설명 합니다. 붙일 레이블된 EVs의 글귀는 confocal 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 모니터링 됩니다. 그러나 내 피 세포 효율적으로 차지 EVs, EVs와 보육 시간 통풍 관을 추적 하기 위해 낙관 될 수 있다. 셀 내부 EVs의 더 나은 지역화, phalloidin와 말라 얼룩. 다음, 우리는 내 피 세포의 단층 성장...

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Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

이 작품에서는, 우리는 변형 체 falciparum 감염 적혈구에 의해 발표 하는 extracellular 소포 (EVs)의 역할을 조사 하기 위해 프로토콜 설명 합니다. 특히, 우리는 내 피 세포와 EVs의 상호 작용에 초점.

말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

evaluation-of-extracellular-vesicle-function-during-malaria-infection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K 조회수.  University of Fribourg. 이 작품에서는, 우리는 변형 체 falciparum 감염 적혈구에 의해 발표 하는 extracellular 소포 (EVs)의 역할을 조사 하기 위해 프로토콜 설명 합니다. 특히, 우리는 내 피 세포와 EVs의 상호 작용에 초점.

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

연구

면역학 및 감염병학

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA에 감염된 마우스

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

높은 수익률 정화<em&gt; 변형체 falciparum의</emOpsonizing 항체 분석 실험에 사용하기 위해&gt; Merozoites

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

유동 세포 계측법에 의해 쥐 말라리아 기생충의 생체 내 평가와 Merozoite 침공

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

방법은 작은 RNA를과의 리보솜 점유 규제 역할을 조사하기 위해<em&gt; 말라리아 원충</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

자기 공명 영상을 이용한 실험용 뇌 말라리아 모델에서의 부종 발달 및 미세 혈관 병리학 적 추적

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

의학

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

유동 세포측정 기반 분석체에 의한 플라스모듐 팔시파룸 기생충에 자연적으로 획득된 식세포증-유도 항체 측정

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

요약

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비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석

높은 수익률 정화

유동 세포 계측법에 의해 쥐 말라리아 기생충의 생체 내 평가와 Merozoite 침공

방법은 작은 RNA를과의 리보솜 점유 규제 역할을 조사하기 위해

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리

자기 공명 영상을 이용한 실험용 뇌 말라리아 모델에서의 부종 발달 및 미세 혈관 병리학 적 추적

유동 세포측정 기반 분석체에 의한 플라스모듐 팔시파룸 기생충에 자연적으로 획득된 식세포증-유도 항체 측정