Name: evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection at JoVE.com

Bu çalışmada mali kısmen tıbbi ve biyolojik araştırma (PYM için) Gottfried ve Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (için MW ve PYM) ve araştırma havuzu Fribourg Üniversitesi (PYM için) Novartis Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ek hibe İsviçre hükümetinin mükemmellik burs (için KAFİLE ve SM) yabancı bilim adamları için içerir. Isabelle Fellay ve Solange Kharoubi Hess teknik destek için teşekkür ederiz.

İnsan RBCs Swissethics (swissethics.ch) yönergeleri doğrultusunda sağlıklı bağış kan elde.
Not: P. falciparum parazit kültür (3D 7) ve EV üretim daha önce Mbagwu tarif edildi ve ark. 11 P. falciparum insan bir patojen olduğundan, işleme için yerel düzenlemelere bakın. Kültürler tüm steril tutulmalıdır zaman.
1. Floresans EVs etiketleme
Not: Aşağıdaki yordam, stabil bir yeşil flüoresan boya (PKH67) dahil etmek için etiketleme teknolojisi EV membran lipid bölgesinin büyük Alifatik kuyruklu yararlanır. Reaksiyon 200 µL PKH67 20 µM son konsantrasyon içeren birim boyama son gerçekleştirilir. Tüm adımları izleyerek, ortam sıcaklığında (20-25 ° C)
<ol><li>PBS 1 ml microcentrifuge tüp içinde yer 100 µg EVs.</li>
	<li>Cips için EVs 7 min için maksimum hızda (20.000 x g) bir microcentrifuge tüp santrifüj kapasitesi. Not: hemozoini EVs içinde mevcut olduğu için kırmızı-koyu kahverengi Pelet dikkat edilmelidir. EVs lysed ise o zaman süpernatant kırmızımsı.</li>
	<li>Santrifüjü sonra süpernatant dikkatli bir şekilde, herhangi bir EVs kaldırma önlemek için Aspire edin. Not: kalan arabellek EVs Dilüent C'de tekrarlanabilirlik ve boyama verimliliği artırmak için resuspending önce mevcut miktarını en aza indirmek.</li>
	<li>EV Pelet Dilüent C 100 µL içinde resuspend (2 X EV süspansiyon) ve yavaşça damlalıklı tam dağılım sigorta için.</li>
	<li>Yeni bir microcentrifuge tüp hazırlayın ve PKH67 ethanolic boya çözüm 4 µL karıştırmak için seyreltici C. girdap iyi 100 µL için ekleyin. Hemen boyama önce bu 2 x boya çözüm (40 µM) hazırlayın. Not: heterojen boyama önlemek için PKH67 ethanolic boya çözüm doğrudan EV Pelet eklemeyin.</li>
	<li>Hızla, 2 EV süspansiyon (Adım 1.4) X 100 µL 2 boya çözüm (Adım 1.5) X 100 µL ile birleştirir. Sonra aşağı yukarı 10 kez pipetting tarafından örnek karıştırın.</li>
	<li>Işık ve mix 3 - 4 kez 5 dk kuluçka sırasında vortexing tarafından korunan EV/boya süspansiyon adım 1.6 5 min için kuluçkaya. Not: boyama çok hızlı olduğundan EV/boya süspansiyon için daha uzun süreleri kuluçka hiçbir avantaj sağlar.</li>
	<li>Serum eşit bir hacmi (200 µL) ekleyerek boyama reaksiyonu durdurmak ve 1dk için fazla boya bağlantısına izin kuluçkaya. Not: boyama durdurmadan önce EVs üzerinden serum Santrifüjü 20.000 x g 20 dk için de tarafından tüketmek.</li>
	<li>3 kez PBS ile yıkama ve 20.000 x g 5 dakika süreyle aşağı spin Resuspend EVs 1 µg/µL son bir konsantrasyon ulaşmak için PBS 100 µL içinde.</li>
</ol>2. EVs Confocal mikroskobu tarafından alımını görselleştirmek
Not: EV içselleştirilmesi cam coverslips üzerinde yetiştirilen endotel hücreleri tarafından izlenmesine aşağıdaki protokolünü açıklar. Endotel hücreleri12' açıklandığı gibi yarı ölümsüzleştirdi insan kemik iliği endotel hücreleri vardır.
<ol><li>Steril bir ortamda çalışmaya, coverslips % 0,01 Poli-L-lizin, oda sıcaklığında (RT) 10 min için bir fazlalığı ile kat.</li>
	<li>Poli-L-lizin çözüm Aspire edin ve coverslips tamamen kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanan bir uygun endotel hücre sayısı gerçekleştirin.</li>
	<li>Tam endotel hücre büyüme Poli-L-lizin-kaplı coverslips ek karışıma içeren ve bir monolayer büyümek hücreleri izin orta 1 mL 1 x 105 endotel hücrelerinde aktarın. Not: Orta hücreleri bir monolayer oluşturmak için ve sıkı kavşaklar oluşturmak için izin büyüme faktörleri içerir.</li>
	<li>Hücreleri bir monolayer formu, dikkatli bir şekilde orta Aspire edin ve hücreleri yıkamak için taze orta 1 mL ekleyin. Yıkama bir kez daha yineleyin. PKH67 etiketli EVs 50 µg ekleyin ve 4 h için kuluçkaya. Not: alımı için en uygun zaman noktası bulmak için bir zaman ders gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>4 h sonra orta Aspire edin ve aşırı ve ilişkisiz EVs kaldırmak için 3 kez PBS hücrelerle yıkayın. Hücreleri 15dk için PBS içinde % 3 paraformaldehyde çözüm ile düzeltmek. Not: Metanol fiksasyon işlemi sırasında aktin kesintiye uğratabilir; Bu nedenle, herhangi bir metanol Fiksajlar veya diğer solvent bazlı Fiksajlar içeren kaçınmak en iyisidir. Formaldehit metanol-Alerjik bir sabitleştirici kullanılması önerilir.</li>
	<li>Hücreleri 3 kez PBS ile yıkayın. Dikkatle 250 µL % 0.1 eklemek PBS hücreleri permeabilize Triton X-100. RT 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>3 kez PBS ile yıkayın. RT non-spesifik bağlama engellemek için 30 dk 400 µL engelleme arabelleği (PBS %5 BSA) ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Boyama çözüm sulandrarak 5 µL 200 µL PBS/1% BSA her kapak notu başına phalloidin hisse senedi çözümün hazırlayın. Damlalıklı 200 µL boyama çözüm coverslip Tarih ve 20 dk RT. az için kuluçkaya</li>
	<li>3 kez PBS ile yıkayın. DNA için 30 counterstain s Höchst 33342 adlı PBS 200 µL 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile.</li>
	<li>2 coverslip x 400 µL PBS ekleyerek yıkayın. Dikkatle coverslip Forseps ile kapmak ve üst kısmında bir cam slayt üzerinde ortam takma antifade bir damla tersine çevirin. Yavaşça bir doku ile aşırı medyayı çıkarın ve her tarafı oje ile mühür.</li>
	<li>4 ° C'de ışık korunuyorsunuz slaytları depolama</li>
	<li>Lazer uyarilmalar 405, 488 ve 543 nm ve 63 X, 1.3 NA petrol amacı ile floresan emisyonlarının 450-470 nm (mavi), 505-530 nm (yeşil) ve 620 confocal mikroskop kullanarak hücreleri görselleştirmek nm. Not: Tipik F-aktin boyama sonuçları şekil 1' de gösterilmiştir.</li>
</ol>3. endotel hücre geçirgenliği
Not: Endotel hücre geçirgenliği rodamine B isothiocyanate-dextran (ortalama MW 70.000) transferini ölçerek endotel hücre monolayer değerlendirilir. Dextran vasküler geçirgenliği eğitim için mükemmel bir araç sağlar.
<ol><li>%0,4 Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanarak uygun endotel hücreleri saymak.</li>
	<li>İzdiham 24-iyi doku kültürü ekler (0.4 µm gözenek boyutu) ve izin bozulmamış farklılaşmış monolayers oluşturmak en az 5 gün için 105 hücrelere x 0.6 yoğunluğu, endotel hücreleri plaka. Orta iki günde yenileyin.</li>
	<li>Hücreleri bir monolayer ulaştığınızda, EVs yük (1 ml 50 µg) üst odası üzerinde. Rodamine-dextran 20 mg/mL nihai bir konsantrasyon üst kuyuda ekleyin. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Floresan dextran transfer altına de floresan emisyon 40 µL orta aliquots üzerinden ölçerek izlemek. Çok etiketli Mikroplaka okuyucu 544 nm uyarma ve 590 nm emisyon ölçümleri için ayarlayın. Not: Dağınık dextran miktarda hisse senedi çözüm ile kurulan kalibrasyon eğrileri kullanarak sayısal. Buna ek olarak, Kinetik deney süresi boyunca (Şekil 2) dış Kamara orta küçük örnekleri kaldırarak gerçekleştirilebilir. Bile herhangi bir tedavi, dextran hücre monolayer yaygın.</li>
</ol>4. puromisindir duyarlılık belirlemek
Not: hücre hatları ile lentivirus transducing önce o belirli hücre satır için seçili bir ilacın öldürmek eğrisi belirlemek önemlidir. İlaç konsantrasyonu bütün hücreleri öldürmek gerekli en az miktarını belirlemek için seçilen ilaç artan dozlarda kullanılarak bir doz yanıt deneme gerçekleştirin. Çünkü her memeli hücre satırı önce deneme, farklı bir duyarlılık antibiyotik en iyi konsantrasyon öldürmek eğrisi titrasyon aşağıda ayrıntılı olarak geliştirerek tespit edilmelidir.
<ol><li>Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 1 x 105 hücre/mL tam endotel hücre büyüme ek karışımı içeren ortamda bir konsantrasyon, endotel hücreleri resuspend.</li>
	<li>Plaka 1 x 104 100 µL endotel hücre büyüme ortamının son hacmi bir 96-şey plaka hücrelere.</li>
	<li>0.1-10 µg/mL konsantrasyonu elde etmek için antibiyotik içeren orta 100 µL ekleyin (bkz. şekil 3).</li>
	<li>Hücre canlılığı 2 günde 20 X amacı istimal ışık mikroskop altında incelemek. 10-14 gün için hücreleri kültür ve puromisindir bağlı olarak hücre büyümesini her 2-3 gün içeren ortamı değiştirin.</li>
	<li>10 µL/iyi MTS reaktif her kuyuya, mix, eklemek ve standart kültür koşullarında 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Plaka kısaca üzerinde bir sallayıcı ve Absorbans 490 bir plaka okuyucu kullanarak tedavi ve tedavi edilmezse hücrelerinin ölçmek nm (şekil 3).</li>
</ol>5. iletim Lentiviral vektör ile endotel hücrelerinin
<ol><li>Tam orta 1 mL 1 x 105 endotel hücrelerinde iletim önceki gün plaka. Hücreleri 50-%80 confluency ulaştığında iletim gerçekleştirir.</li>
	<li>Lentivirus buz erime ve donma-çözülme döngüsü önlemek için viral stoklarının aliquots olun. Spin aşağı 200 x g de malzeme için 30 s, tüpler üzerinde yayılımı önlemek için açmadan önce.</li>
	<li>Hexadimethrine bromür 8 µg/mL nihai bir konsantrasyon hücreleri ekleyin. Not: bazı durumlarda hücreler için zehirli olabilir ancak Hexadimethrine bromür iletim verimliliği yardımcı olur. Bu nedenle, en iyi toplama bir öldürme eğrisi iletim önce gerçekleştirerek tespit edilmelidir.</li>
	<li>Karışımı yavaşça için plaka girdap. Enfeksiyon (MOI) uygun bir çeşitlilik viral parçacıkların (0,5-2 x 106 parçacıklar arasında) uygun miktarı ekleyin ve hafifçe 30 plaka girdap karışımı s.</li>
	<li>RT, santrifüj iletim verimliliği artırmak için 300 x g de 45 dakika için hücre viral parçacık karışımda santrifüj kapasitesi. 37 ° C hücre viral parçacık karisimin gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde viral partikül içeren orta çıkarın ve uygun şekilde atın. Eski yerine koymak o ile taze, Önceden ısıtılmış tam kültür orta.</li>
	<li>Başlangıç seçimi ile puromisindir ikinci gün: Orta kaldırmak ve taze orta bölüm 4 (şekil 3) önceden belirlendiği gibi puromisindir doğru konsantrasyon içeren ile değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri puromisindir seçimden sonra hasat ve üreticinin yönergeleri izleyerek kiti izole bir RNA kullanarak RNA yalıtır.</li>
	<li>Seçili cDNA sentezini gerçekleştirmek bir ters transkripsiyon kullanarak miRNAs Kiti ( Tablo reçetesigörmek).</li>
	<li>QPCR tepki gösterdi protokolü13göre ayarlayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Malaria Report 2015. , (2015).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites.">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li><li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation.">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system.">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li><li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles.">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li><li>Szempruch, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+from+Trypanosoma+brucei+Mediate+Virulence+Factor+Transfer+and+Cause+Host+Anemia.">Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia.</a> Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria.">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727 (2016).</li><li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria.">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li><li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line:+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li><li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs.">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake.">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+docking+at+the+cellular+port:+Extracellular+vesicle+binding+and+uptake.">Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake.</a> Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).</li><li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes.">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li><li>Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis,+clinical+features,+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria.">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li><li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions.">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis.">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Çeşitli parazitler, Toxoplasma, Trypanosoma, LEISHMANIA ve Trikomonas gibi EVs virüslü konak hücre sürümü tetikler. Patojenler bağlı olarak yayımlanan EVs konak immün yanıt modüle veya hücresel iletişim parazitler6arasında arabuluculuk. Henüz, bu küçük veziküller sıtma hastalığı için nasıl katkıda bulunduğunu düşündüren çok az kanıt var. Burada, EVs fonksiyonu Plasmodium enfeksiyon sırasında araştırmak için çeşitli yollar anlatmıştık. Örneği...

Dünya Sağlık Örgütü göre 2015 yılında dünya çapında sıtma 212 milyon yeni vaka vardı ve yaklaşık 429,000 kişi öldü, esas olarak yaş1beş yaş altı çocuklar. Genellikle vasküler disfonksiyonu ile ilişkili olan, ağır hastalıklar için önde gelen mekanizmalar kötü tanımlanmış2kalır. Plasmodium- iRBCs küçük bi-lipid membran küreler ekstraselüler veziküller (EVs) bilinen salgılar. Bu EVs potansiyel enfeksiyon enfeksiyon süreci ve konak immün yanıt ilgili bilinir; Ancak, az sıtma enfeksiyon3sırasında bu küçük veziküller özdeş işlevini hakkında bilinir. Bu iki önemli roller oynamak mümkündür: bir yandan, makrofajlar4,5; aktive ederek patogenezinde katkıda ve öte yandan, hücresel iletişim parazitler arasında parazitler ve ana bilgisayar6,7arasında arabuluculuk. Aslında, parazitler proteinler veya nükleik asitler birbirleriyle EVs üzerinden aktarabilirsiniz. Örneğin, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs virülans faktörü Serum Resistance-Associated (SRA) aktarabilir ve diğer T. brucei ve ana bilgisayar eritrositler8hedefleyebilirsiniz. Ayrıca, P. falciparum- iRBCs arada her diğer nükleik asitler EVs içinde aktarma tarafından iletişim. Bu parazitler optimize etmek ve onun büyüme eşitlemek sağlar. Aslında, EVs, gametocyte dönüşüm büyük düzenleyici olmak ve bu nedenle iletim sahne7düzenlenmesi için katkıda bulunmak.
Sadece EVs parazitleri düzenleyen, onlar da parazit ana bilgisayar etkileşimi aracılık. Biz son zamanlarda EVs iRBCs gelen insan endotel hücreleri tarafından gerçekleştirilen ana bilgisayar kaynaklı mikroRNA (miRNAs; 21-25 nükleotit9aralığındaki küçük RNA türü) içeren keşfetti. EVs miRNAs Ago2 ile karmaşık istikrarlı bir form (RNA kaynaklı damping üye karmaşık), hangi bir kez alıcı hücrelere teslim kabil özellikle gen ifadesinin susturulması ve hücre10bariyer özelliklerini etkileyen. Standart protokolleri EVs işlevi araştırmak için geliştirilmiştir. Burada, biz ilk tarif onların alımını alıcı hücreleri tarafından araştırmaya EVs floresan etiketlemeyi sağlayan bir protokol. Buna ek olarak, confocal mikroskop kullanarak, bu EV'ın kaderi hücre içindeki izlemek mümkündür. Çeşitli floresan boyalar EVs izlemek için kullanılabilir. Amin-reaktif boya, 5-(and-6) Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) ve Calcein-AM olmak floresan bir kez veziküller içinde. Daha parlak ve daha düzgün bir sinyal verir, çünkü biz amfifilik etiket, PKH, kullanmayı tercih eder. Bu yaklaşım EVs ve alıcı hücreler arasındaki etkileşimleri anlamak için önemli bilgiler sağlar. Bazı durumlarda EVs hücreleri yüzeye bağlamak iken, bazı veziküller hızla alınır. Alımı EVs hangi onlar yasal işlevlerini uygularlar hücrelere onların yükleri teslim.
Burada, endotel hücreleri vitro bariyer fonksiyonu bir floresan dextran hücresel monolayer aracılığıyla transfer miktarının ölçmek için bir protokol açıklayın. Daha hassas tarayıcıları gibi radiolabeled işaretleri kullanılabilir. Ancak, onlar için özel güvenlik önlemleri gerektirir. Vitro bariyer fonksiyonu gibi sıkı bağlantı bütünlüğü ölçen transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ), ölçmek için diğer deneyleri adlı biri yok. Sonunda ZO-1, sıkı kavşak protein ayirt tarafından görüntülenmesi iyi10olarak sıkı kavşak dürüst değerlendirme sağlar. EVs potansiyel düzenleyici özelliği ile birkaç yükleri içeren karmaşık ve türdeş olmayan varlıklar olduğundan, alıcı hücreye üzerindeki etkisini incelemek için belirli bir RNA overexpress yararlıdır. Bu nedenle, ayrıca faiz10miRNA ifade istikrarlı hücre satırlarını oluşturmak için amaçlayan bir iletişim kuralını tanımlar.

<table><tbody><tr><td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Diluent C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin CF594</td><td>Biotium</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&amp;ndash;Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Insert with PET membrane transparent Falcon&amp;nbsp;for plate 24 wells</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth&amp;nbsp;Medium MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>hsa-mir-451a&amp;nbsp;RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

Sıtma bir yaşamı tehdit eden hastalık Plasmodium parazitler tarafından neden, P. falciparum ile en yaygın Afrika kıtasında ve en sıtma ile ilgili boyunca genel olarak varlık. Doku, vasküler disfonksiyon ve inflamatuar yanıt parazit tutma gibi birçok etkene sıtma enfekte kişilerde hastalığın evrim etkilemek. P. falciparum-virüslü kırmızı kan hücreleri (iRBCs) yayın çeşitli türde Patogenez ve hücresel iletişim parazitler ve ev sahibi arasında arabuluculuk kargo molekülleri içeren küçük hücre dışı veziküller (EVs). EVs verimli bir şekilde hangi onlar işlevlerine modüle hücreleri tarafından alınır. Burada EVs rolde parazit-ana etkileşimler adrese stratejileri tartışmak. İlk olarak, biz bir yeşil hücre bağlayıcı boya kullanarak etiketleme ve endotel hücreleri tarafından EV içselleştirilmesi izlemek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. İkinci olarak, biz geçirgenliği endotel hücre monolayer fluorescently etiketli dextran kullanarak ölçmek için basit bir yol raporu. Son olarak, biz küçük kodlamayan RNA molekülleri endotel hücre işlevindeki rolünü araştırmak nasıl göstereceğim.

Burada, konak hücreleri ile EVs etkileşimleri araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Fluorescently etiketli EVs alımını confocal mikroskobu (şekil 1) tarafından kontrol edilmektedir. EVs kuluçka zamanla alımını izlemek için optimize edilebilir ancak endotel hücreleri verimli EVs götür. Bir daha iyi yerelleştirme EVs için hücrelere, aktin phalloidin ile leke. Sonra hangi üst kısmında bir monolayer endotel hücrelerinin büy?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection at JoVE.com

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Bu çalışmada, enfekte Plasmodium falciparum eritrositler tarafından yayımlanan ekstraselüler veziküller (EVs) rolünü araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Özellikle, endotel hücreleri ile EVs etkileşimleri odaklanmak.

Sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

evaluation-of-extracellular-vesicle-function-during-malaria-infection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Görüntüleme.  University of Fribourg. Bu çalışmada, enfekte Plasmodium falciparum eritrositler tarafından yayımlanan ekstraselüler veziküller (EVs) rolünü araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Özellikle, endotel hücreleri ile EVs etkileşimleri odaklanmak.

Video: Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Tıp

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

Bir

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

Bir

Yöntemler Küçük RNA'ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu

Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak Deneysel Serebral Sıtma Bir Modelinde Ödem Gelişimi ve Mikrovasküler Patolojinin İn Vivo Takibi

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi