Name: evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection at JoVE.com

Financeiramente, este estudo foi suportado em parte pela Fundação Novartis medical - pesquisa biológica (para PYM), o Gottfried e Julia Bangerter-Naraa-Stiftung (para MW e PYM) e a piscina de pesquisa da Universidade de Friburgo (para PYM). Subsídios adicionais incluem as bolsas de excelência de governo suíço para estrangeiros os estudiosos (KAB e SM). Agradecemos a Isabelle Fellay e Solange Kharoubi Hess para suporte técnico.

Hemácias humanas foram obtidas a partir do sangue de doadores saudáveis, em conformidade com as diretrizes da Swissethics (swissethics.ch).
Nota: Culturas de parasita por p. falciparum (3 7) EV produção foram anteriormente descritas em Mbagwu, et al. 11 porque por p. falciparum é um patógeno humano, consulte os regulamentos locais para manipulação. As culturas devem ser mantidas estéril todo o tempo.
1. a fluorescência rotulagem de EVs
Nota: O procedimento a seguir aproveita a tecnologia de rotulagem estàvel incorporar uma tintura fluorescente verde (PKH67) com grandes caudas de alifáticas na região lipídica da membrana EV. A reação é realizada em um final de coloração volume contendo uma concentração final de 20 µM de PKH67 200 µ l. Executar todas as etapas, à temperatura ambiente (20-25 ° C)
<ol><li>Lugar de 100 µ g de EVs em 1 mL de PBS em um tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Centrifugue o EVs em um tubo de microcentrifugadora na velocidade máxima (20.000 x g) durante 7 min a pelota. Nota: Desde que o hemozoin está presente no EVs, uma pelota de vermelho-escuro acastanhada deve ser observada. Se o sobrenadante é avermelhado, então tenho lysed o SVE.</li>
	<li>Após a centrifugação, Aspire o sobrenadante cuidadosamente, para evitar a remoção de qualquer EVs. Nota: Minimize a quantidade de buffer restante presente antes resuspending EVs em diluente C a fim de aumentar a reprodutibilidade e a eficiência da coloração.</li>
	<li>Resuspenda o pellet EV em 100 µ l de diluente C (2 X suspensão EV) e pipeta suavemente para segurar a dispersão completa.</li>
	<li>Prepare um novo tubo de microcentrifugadora e adicionar 4 µ l da solução etanólica de tintura PKH67 a 100 µ l de diluente C. Vortex bem para misturar. Prepare esta solução de tintura de 2x (40 µM) imediatamente antes da coloração. Nota: Para evitar coloração heterogênea, não adicione a solução etanólica de tintura de PKH67 diretamente para a pelota de EV.</li>
	<li>Rapidamente, combine a 100 µ l de 2 X suspensão EV (etapa 1.4) com a 100 µ l de 2 X solução corante (passo 1.5). Em seguida, misture a amostra pipetando acima e para baixo 10 vezes.</li>
	<li>Incube a suspensão de EV/corante da etapa 1.6 por 5 min, protegida da luz e a mistura vortexing 3 - 4 vezes durante a incubação de 5 min. Nota: Incubando a suspensão EV/corante para tempos mais longos não fornece nenhuma vantagem, pois a coloração é tão rápida.</li>
	<li>Parar a reação de coloração pela adição de um volume igual (200 µ l) de soro e incubar durante 1 min permitir a ligação de corante em excesso. Nota: Antes de parar a coloração, empobrecem o soro de EVs por centrifugação a 20.000 x g por 20 min.</li>
	<li>Lavar 3 vezes com PBS e spin-down a 20.000 x g durante 5 min. Ressuspender o SVE em 100 µ l de PBS para atingir uma concentração final de 1 µ g / µ l.</li>
</ol>2. visualize a absorção de EVs por microscopia Confocal
Nota: O seguinte protocolo descreve o rastreamento de EV internalização pelas células endoteliais, cultivadas em lamelas de vidro. As células endoteliais são semi imortalizadas células endoteliais da medula óssea humanas, conforme descrito em12.
<ol><li>Trabalhando em um ambiente estéril, revesti as lamelas com um excesso de 0,01% poli-L-lisina, durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Aspirar a solução de poli-L-lisina e permitir as lamelas secar completamente.</li>
	<li>Realize uma contagem de células endoteliais viável usando Trypan azul exclusão e um hemocytometer.</li>
	<li>Transferi 1 x 105 células endoteliais em 1 mL de endotelial célula crescimento meio completo contendo a mistura de suplemento para as lamelas de poli-L-lisina-revestido e deixar que as células crescem a uma monocamada. Nota: O meio contém fatores de crescimento que permitem que as células para formar uma monocamada e para formar junções apertadas.</li>
	<li>Uma vez que as células formam uma monocamada, cuidadosamente Aspire o meio e adicione 1 mL de meio fresco para lavar as células. Repeti a lavagem mais uma vez. Adicionar 50 µ g de PKH67-rotulado EVs e incubar durante 4 h. Nota: Para localizar o ponto de tempo ideal para absorção, um curso de tempo pode ser executado.</li>
	<li>Após 4 h, Aspire o meio e lavar as células 3 vezes com PBS para remover o excesso e desacoplados EVs. Fixe as células com 3% de solução de paraformaldeído em PBS por 15 min. Nota: Metanol pode disrupt actina durante o processo de fixação; Portanto, é melhor evitar qualquer metanol contendo álcool ou outro fixador base solvente. É recomendável usar o formaldeído livre de metanol como um fixador.</li>
	<li>Lave as células 3 vezes com PBS. Adicionar cuidadosamente 250 µ l de 0,1% Triton X-100 em PBS para permeabilize as células. Incube a RT por 5 min.</li>
	<li>Lavar 3 vezes com PBS. Adicione 400 µ l de tampão de bloqueio (5% BSA em PBS) por 30 min em RT para bloquear a ligação não-específica.</li>
	<li>Lave as células uma vez com PBS. Prepare a solução de coloração por diluição 5 µ l de solução-mãe faloidina em 200 µ l PBS/1% BSA por cada lamela. Pipetar 200 µ l da solução de coloração na lamela e incube por 20 min no RT</li>
	<li>Lavar 3 vezes com PBS. Counterstain o DNA por 30 s com Hoechst 33342 em uma concentração final de 2 µ g/mL em 200 µ l de PBS.</li>
	<li>Lave 2 x lamela adicionando 400 µ l de PBS. Cuidadosamente pegue a lamela com fórceps e invertê-lo no topo de uma gota de media mídia de montagem sobre uma lâmina de vidro. Remover suavemente a mídia em excesso com um lenço e selar cada lado com as unhas pintadas.</li>
	<li>Armazenar os slides protegidos contra a luz a 4 ° C.</li>
	<li>Visualizar as células usando um microscópio confocal a laser excitações 543, 488 e 405 nm e um 63 X, objectivo de óleo at 1.3 com emissões fluorescentes em 450-470 nm (azul), 505-530 nm (verde) e 620 nm. Nota: Resultados de coloração típica F-Actina são mostrados na Figura 1.</li>
</ol>3. endothelial da pilha permeabilidade
Nota: Permeabilidade da célula endotelial é avaliada medindo-se a transferência de rodamina B isotiocianato-dextrano (média MW 70.000) através da monocamada de células endoteliais. Dextrano fornece uma excelente ferramenta para estudar a permeabilidade vascular.
<ol><li>Contagem células endoteliais viáveis usando exclusão de azul de Tripan 0,4% e um hemocytometer.</li>
	<li>Placa em uma densidade de 0,6 x 105 células de confluência no inserções 24-poço de cultura de tecidos (0,4 µm de tamanho de poro) e deixar intacta durante pelo menos 5 dias formar monocamadas diferenciadas, as células endoteliais. Atualize o meio cada segundo dia.</li>
	<li>Uma vez que as células de alcançar uma monocamada, carregar o EVs (50 µ g em 1 mL) na câmara alta. Adicione o dextran-rodamina para o poço de cima de uma concentração final de 20 mg/mL. Incube a 37 ° C com 5% CO2células.</li>
	<li>Monitore a transferência do dextran fluorescente ao fundo bem pela medição de emissão de fluorescência de alíquotas médias de 40 µ l. Configure o leitor de microplacas multi rótulo em 544 nm de excitação e emissão de 590 nm para medições. Nota: A quantidade de dextrano difusa pode ser quantificada usando as curvas de calibração estabelecidas com a solução-mãe. Além disso, experimentos cinéticos podem ser realizados através da remoção de pequenas amostras do meio exterior da câmara durante um curso de tempo (Figura 2). Mesmo sem qualquer tratamento, o dextran vai difundir através da monocamada de células.</li>
</ol>4. determinar a sensibilidade de puromicina
Nota: Antes de transducing linhas celulares com lentivirus, é importante determinar a curva de matar de uma droga selecionada para essa linha de célula específica. Para determinar a quantidade mínima de concentração de fármaco necessária para matar todas as células, execute um experimento de resposta de dose usando doses incrementais da droga selecionada. Porque cada linha de células de mamíferos tem uma sensibilidade diferente, antes a experimentação, a concentração ideal do antibiótico deve ser determinada pelo desenvolvendo a titulação de curva de matar conforme detalhado abaixo.
<ol><li>Conte as células usando o hemocytometer. Ressuspender as células endoteliais em uma concentração de 1 x 105 células/mL no meio que o crescimento endotelial completo célula contendo a mistura de suplemento.</li>
	<li>Placa 1 x 104 células em uma placa de 96 poços em um volume final de 100 µ l do meio de crescimento de célula endotelial.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de meio contendo o antibiótico para obter uma concentração de 0,1-10 µ g/mL (ver Figura 3).</li>
	<li>Examine a viabilidade celular a cada 2 dias sob um microscópio de luz usando um objectivo X 20. Cultura das células por 10-14 dias e substituir a mídia contendo puromicina cada 2-3 dias dependendo do crescimento celular.</li>
	<li>Adicionar 10 µ l/poço MTS reagente em cada poço, mistura e incube por 4 h a 37 ° C em condições de cultura padrão.</li>
	<li>Agitar a placa brevemente num agitador e medir a absorvância de células tratadas e não tratadas usando um leitor de placas em 490 nm (Figura 3).</li>
</ol>5. transdução de células endoteliais com vetor de Lentivirus
<ol><li>Placa 1 x 105 células endoteliais em 1 mL de meio completo no dia anterior a transdução. Execute a transdução quando as células chegaram a confluência de 50-80%.</li>
	<li>Descongelar o lentivirus no gelo e fazer alíquotas dos estoques virais para evitar ciclos de congelamento e descongelamento. Spin para baixo o material a 200 x g por 30 s, em tubos antes de abrir para evitar derramamento.</li>
	<li>Adicione brometo de hexadimethrine para as células em uma concentração final de 8 µ g/mL. Nota: Brometo de Hexadimethrine ajuda a eficiência de transdução, no entanto em alguns casos, pode ser tóxico para as células. Portanto, a concentração ideal deve ser determinada através da realização de uma curva de matança antes da transdução.</li>
	<li>Agite a placa suavemente para misturar. Adicionar a quantidade apropriada de partículas virais (entre 0,5-2 x 106 partículas) em um multiplicity apropriado de infecção (MOI) e agite a placa suavemente durante 30 s para misturar.</li>
	<li>Centrifugue a mistura de partícula viral-célula na centrifugar RT por 45 min a 300 x g para aumentar a eficiência de transdução. Incube a mistura de partícula viral-célula a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o meio contendo partículas viral e descartar adequadamente. Substituí-lo com meio de cultura completo fresco, previamente aquecido.</li>
	<li>Iniciar a seleção com puromicina no segundo dia: remover o meio e substituí-lo por meio fresco contendo a concentração correta de puromicina conforme determinado previamente na seção 4 (Figura 3).</li>
	<li>Colher células após puromicina e isolar o RNA usando um RNA isolando kit seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Realizar a síntese do cDNA com o selecionado miRNAs usando uma transcrição reversa kit (veja a Tabela de materiais).</li>
	<li>Configure a reação de qPCR de acordo com o citado protocolo13.</li>
</ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Malaria Report 2015. , (2015).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites.">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li><li>Couper, K. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system.">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li><li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles.">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li><li>Szempruch, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line:+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li><li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs.">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Mulcahy, L. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Diversos parasitas, incluindo Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania e Trichomonas desencadear a liberação de EVs pela célula hospedeira infectada. Dependendo dos patógenos, os EVs lançados podem modular a resposta imune do hospedeiro ou mediar a comunicação celular entre os parasitas6. No entanto, há poucas evidências sugerindo como essas pequenas vesículas contribuam para a doença da malária. Aqui, descrevemos várias maneiras de investigar a função do EVs durante a infecção de ...

De acordo com a Organização Mundial de saúde, havia 212 milhões de novos casos de malária em todo o mundo em 2015 e aproximadamente 429.000 pessoas morreram, principalmente de crianças menores de cinco anos de idade1. Os mecanismos, levando a doença grave, que é frequentemente associada com disfunção vascular, permanecem mal-definidas2. Plasmodium- iRBCs secretam esferas pequenas membrana bi-lipídica conhecidas como vesículas extracelulares (EVs). Sabe-se que esses EVs são potencialmente relevantes para o processo de infecção e a resposta imune do hospedeiro à infecção; no entanto, pouco se sabe sobre a função exata destas pequenas vesículas durante a infecção de malária3. É possível que eles desempenham duas funções importantes: por um lado, eles possam contribuir para a patogênese ativando os macrófagos4,5; e, por outro lado, eles podem mediar a comunicação celular entre parasitas e entre parasitas e anfitrião6,7. Na verdade, parasitas podem transferir proteínas ou ácidos nucleicos entre si através de EVs. Por exemplo, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs pode transferir factor de virulência Serum Resistance-Associated (SRA) e pode ter como alvo outros T. brucei e o host de eritrócitos8. Além disso, por p. falciparum- iRBCs se comunicar entre si através da transferência de ácidos nucleicos dentro EVs. Isso permite que os parasitas otimizar e sincronizar o seu crescimento. Na verdade, EVs podem ser o grande regulador da conversão de Gametócito e, portanto, contribuir para o Regulamento da transmissão etapa7.
Não só fazem EVs regulam os parasitas, eles também mediam interações parasita-hospedeiro. Recentemente, descobri que EVs de iRBCs contenham derivados de anfitrião microRNAs (miRNAs; pequenas espécies de RNA no intervalo de 21-25 nucleotides9) que foram retomadas por células endoteliais humanas. Os miRNAs em EVs formam complexos com Ago2 um estábulo (membro o silenciamento de RNA-induced complex), que uma vez entregue para as células de destinatário, é capaz de especificamente silenciar a expressão de gene e que afetam as propriedades de barreira dos10células. Protocolos padrão foram desenvolvidos para investigar a função do EVs. Aqui, primeiro descrevemos um protocolo que permite que a rotulagem fluorescente do EVs para investigar sua absorção pelas células do destinatários. Além disso, usando um microscópio confocal, é possível rastrear o destino o EV no interior da célula. Vários corantes fluorescentes podem ser usados para rastrear EVs. O corante reativo-amina, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster (CFSE) e fluorescentes de calceína-AM se tornar uma vez dentro de vesículas. Nós preferimos usar o rótulo anfifílica, PKH, porque dá um sinal mais brilhante e mais uniforme. Essa abordagem fornece informações importantes para compreender as interações entre células destinatários e EVs. Enquanto em alguns casos EVs se ligam à superfície das células, algumas vesículas rapidamente são retomadas. Após absorção, EVs entregam suas cargas para as células, em que exercem suas funções reguladoras.
Aqui, descrevemos um protocolo para medir a função de barreira de células endoteliais em vitro quantificando a transferência de uma fluorescente dextran através de uma monocamada celular. Marcadores mais sensíveis podem ser usados como marcadores radiolabeled. No entanto, eles exigem precauções especiais de segurança para uso. Outros ensaios existem para medir a função de barreira em vitro como resistência elétrica transendothelial (TEER), que mede a integridade da junção apertada. Finalmente, Visualizar ZO-1, uma proteína da junção apertada, por imunofluorescência permite a avaliação da integridade da junção apertada como bem10. Desde EVs são entidades complexas e heterogêneas, contendo várias cargas com característica potencial de regulamentação, é útil para overexpress um RNA específico para estudar seu efeito sobre a célula de destinatário. Portanto, nós também definir um protocolo que visa gerar linhas de células estáveis expressando a miRNA de juros10.

<table><tbody><tr><td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Diluent C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin CF594</td><td>Biotium</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&amp;ndash;Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Insert with PET membrane transparent Falcon&amp;nbsp;for plate 24 wells</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth&amp;nbsp;Medium MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>hsa-mir-451a&amp;nbsp;RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

A malária é uma doença fatal causada por parasitas Plasmodium , por p. falciparum sendo a mais prevalente no continente africano e responsável pela maioria das mortes relacionadas com a malária globalmente. Vários fatores, incluindo a fixação do parasita em tecidos, disfunção vascular e respostas inflamatórias influenciam a evolução da doença em pessoas infectadas por malária. Por p. falciparum-glóbulos vermelhos infectados (iRBCs) liberar pequenas vesículas extracelulares (EVs) contendo diferentes tipos de moléculas de carga que medeiam a comunicação celular e patogênese entre parasita e hospedeiro. SVE eficientemente é ocupados por células na qual eles modulam sua função. Aqui vamos discutir estratégias para abordar o papel do EVs em interações parasita-hospedeiro. Primeiro, nós descrevemos um método simples para a rotulagem e rastreamento EV internalização pelas células endoteliais, usando um corante de vinculador de célula verde. Em segundo lugar, nós relatamos uma maneira simples de medir a permeabilidade através de uma monocamada de células endoteliais usando um fluorescente etiquetado dextrano. Finalmente, mostramos como investigar o papel de pequenas moléculas de RNA não-codificante em função da célula endotelial.

Aqui, descrevemos os protocolos para investigar as interações de EVs com células hospedeiras. A absorção de fluorescente etiquetadas EVs é monitorada pela microscopia confocal (Figura 1). Células endoteliais eficientemente pegam EVs, porém o tempo de incubação com EVs pode ser otimizado para controlar a absorção. Para uma melhor localização de EVs no interior das células, mancha actina com faloidina. Em seguida, usamos um filtro de membrana no ...

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Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Neste trabalho, descrevemos os protocolos para investigar o papel das vesículas extracelulares (EVs), lançado pelo Plasmodium falciparum infectado hemácias. Em particular, enfocamos as interações de EVs com células endoteliais.

Avaliação da função de vesículas extracelulares durante a infecção da malária

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K visualizações.  University of Fribourg. Neste trabalho, descrevemos os protocolos para investigar o papel das vesículas extracelulares (EVs), lançado pelo Plasmodium falciparum infectado hemácias. Em particular, enfocamos as interações de EVs com células endoteliais.

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Imunologia e Infecção

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

A avaliação in vivo de Rodent Plasmodium parasitemia e Merozoito Invasion por citometria de fluxo

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Métodos para investigar o papel de Regulamentação dos Pequenos RNAs e Ribosomal Ocupação de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em&gt; Plasmodium</em&gt; Esporozoítos

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Medicina

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Avaliação da função de vesículas extracelulares durante a infecção da malária

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Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo

Um

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos

High Yield purificação

A avaliação in vivo de Rodent Plasmodium parasitemia e Merozoito Invasion por citometria de fluxo

Um

Métodos para investigar o papel de Regulamentação dos Pequenos RNAs e Ribosomal Ocupação de

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo