저자는 기술 지원을 위해 양을 리아나 Mackiewicz 감사드립니다. 이 작품은 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원 및 호주 정부 국립 보건 의학 연구위원회 IRIISS 및 프로젝트 기금 1,031,212을 통해 가능하게되었다.

1. P.있는 마우스의 감염 berghei - ANKA <ol><li> 녹이 cryopreserved P.의 나누어지는 berghei ANKA pRBC. </li><li> 두 손으로 구속 기법을 사용하여 뇌성 말라리아에 저항력이 BALB / C 공여 마우스를 (8-12주짜리) 구속. 1 ML의 인슐린 주사기 (28G 바늘을)를 사용 pRBC의 100-200 μl와 마우스를 주입. 일상적으로, 1-2 기증자 마우스가 주입되어 있습니다. </li><li> 후 감염 4~5일에서 (PI) 케이지에서 기증자 마우스를 제거하고 워크 스테이션이나 일회용 작업 패드에 놓으십시오. </li><li> 부드럽게 꼬리의 끝 부분에 마우스를 구속하고 작은 가위를 사용하여 (약 1mm) 꼬리 끝을 잘라. 또는 25 G 바늘을 사용하여 작은 꼬리 구멍이 수행 될 수 있습니다. </li><li> 불투명 엔드 현미경 슬라이드의 끝 부분 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액 한 방울을 넣으십시오. </li><li> 45 ° 각도에 두 번째 슬라이드 (확장기)를 놓고 피 드롭으로 다시. 피가 가장자리를 따라 펼쳐지되면, 확장기 - 슬라이드 이브를 밀어핏자국을 할 수있는 현미경 슬라이드에 걸쳐 nly. 비방은 건조한 공기 할 수 있습니다. </li><li> 10 분에 신선하게 조리 된 Giemsa에서 슬라이드를 착색 한 후 30 초 100 %의 메탄올에 피 묻은 얼룩을 수정합니다. </li><li> 1 분에 물을 실행에 핏자국을 씻어, 공기 건조 할 수 있으며 현미경 (100x, 석유 침적)에서 슬라이드를 검사합니다. 1000 적혈구 내에서 pRBC을 열거하고 %의 parasitemia를 계산합니다. 그들이 실험 동물의 감염 출혈이되기 전에 기증자 마우스는 2.5-5 % 사이 parasitemia 수준에 도달해야합니다. </li><li> heparinized 마이크로 혈소판 모세관을 사용하여 복고풍 궤도 출혈에 의해 기증 마우스에서 혈액을 수집합니다. 모든 실험은 월터 엘리자 홀 연구소 및 동물 윤리위원회의 요구 사항을 준수 수행됩니다. 지역 동물 윤리위원회의 요구에 따라 다른 출혈이 절차를 사용할 수 있습니다. 1X10 6 pRBC/0.2 ML의 최종 농도에 RPMI 매체에서 혈액 필요한 양을 분해. 그을 고려일반 마우스 혈소판 ~ 6x10 9 적혈구 / 1 ML입니다. </li><li> intraperitoneally (IP) 1x10 6 pRBC/0.2 ML을 주입하여 실험 C57BL / 6 마우스 (8-12주 이전)를 감염. </li><li> 감염된 쥐 parasitemia 수준을 모니터링하려면 단계 1.3-1.8를 따르십시오. Parasitemia는 하루에 2 ~ 3 파이부터 2-3일 모든 결정해야 </li><li> 쥐가 hunched 모양과 같은 매니페스트 수도 C57BL에서 / 6 심한 말라리아의 증상은, 모피 및 낮은 활동을 주름 옷깃이 달린. 일부 마우스는이 단계에서 복구 할 수 있지만, 자기 righting 반사 손실에 진행은 돌이킬 수없는 질병을 나타냅니다과 동물은 euthanized해야합니다. </li></ol> 2. 마우스 및 뇌 추출의 Intracardial 재관류 <ol><li> 60cm 열 스탠드 상단에 부착 된 열 홀더에 500 ML 저장소를 확보하여 수동 중력 재관류 시스템을 조립. 저수지의 바닥 끝 부분에 플라스틱 튜브를 연결하고 버퍼 흐름을 제어 할 수있는 튜브 클램프를 고정하십시오. 23 G 바늘에 튜브를 연결합니다. FilPBS (22 ° C에 보관)과 저수지까지 내 말은, 클램프 및 모든 기포를 제거하는 튜브를 통해 실행하는 버퍼를 허용 엽니 다. </li><li> 안락사시켜야 P. CO 2 흡입하여 berghei ANKA에 감염된 마우스. 페달, 궤도 및 호흡기 반응의 부재에 의해 죽음을 확인합니다. </li><li> dorsally 플라스틱 트레이에 포함 된 스티로폼 분해 보드에 뒷다리와 앞 손으로 euthanized 마우스를 핀. 지역 동물 윤리위원회 요구 사항 마취에 따라 intracardial pefusion의 사전 개시를 관리 할 수​​있다. </li><li> 70 %의 에탄올과 복부 측면을 닦아주십시오. </li><li> 흉강을 노출하는 중간 선을 따라 피부를 열고 대형 가위와 집게를 사용하십시오. 측면에 접어 핀 피부. </li><li> 고급 집게로 가슴을 잡고 가로막을 절감하고 가슴의 양쪽을 따라 갈비뼈를 severing. 대용량의 혈관을 손상 않도록주의보십시오. </li><li> 머리를 느슨하게 옆에있는 흉골에 의해 흉곽을 고정. </li><li> 심실의 지혜를 개최H 고급의 포셉, 고급 가위로 조심스럽게 절개 우심방. </li><li> PBS가 실행되는 동안 오름차순 대동맥으로 왼쪽 심실에 비중 재관류 시스템에 부착 23G 바늘을 삽입합니다. 바늘 끝의 0.5 cm를 삽입합니다. </li><li> 5 분 또는 유출 될 때까지 마우스를 Perfuse 것은 분명하다. </li><li> 고정 해제 마우스와 복부에 놓여 있었다. 70 %의 에탄올과 머리를 닦아주십시오. </li><li> 큰 가위를 사용하여, 그냥 자궁 경부 척추 영역 위에 몫을합니다. </li><li> 중간 꼬리 - 뱃 부리 장식이있는 컷이 두개골을 노출 떨어져 두개골의 기지에서 시작, 피부 껍질을 벗기면하기 위해 고급 가위를 사용합니다. </li><li> 머리 개최, 각 궤도 구멍에 작은 가위 블레이드를 배치하고 궤도 사이의 몫을합니다. </li><li> 시상 봉합을 따라 길이 방향 절단을 확인하고 조심스럽게 바깥쪽으로 각각의 뇌 반구에있는 두개골 껍질을 벗기면. </li><li> 주걱 사용하여 부드럽게 뇌를 들고 RPMI 매체를 포함하는 10 ML의 원심 분리기 튜브에 넣습니다. </li></ol>3. 뇌 - 분리 된 백혈구의 절연 (BSL) <ol><li> 안전 캐비닛에서 근무 곳 갓 RPMI 조직 문화 매체 3-5 ML을 포함하는 배양 접시에있는 스테인리스 스틸 셀 스트레이너 (40-60 메쉬 크기)의 상​​단에 뇌를 수확. </li><li> 작은 조각으로 뇌 조직을 잘라 버릴거야. </li><li> 크리스탈 플런저를 사용하여 셀 스트레이너를 통해 뇌 조직의 작은 조각을 밀어 넣습니다. </li><li> 4에 10 분 ° C.에 250 XG에서 10 ML 튜브와 원심 분리기에 뇌 homogenate를 전송 </li><li> 0.05 % Collagenase D 및 2U/ml DNAse I.를 포함 RPMI 매체의 3 ML에서 펠렛을 분해 </li><li> 실온에서 30 분을위한 혼합물을 회전합니다. 70 μm 나일론 셀 스트레이너 및 /를 통해 혼합물을 눌러 5 분 동안 얼음에 잠복기에 의한 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 실온에서 20 분 400 XG (브레이크)에서 7 ML 30 % Percoll 쿠션과 원심 분리기에 뇌 homogenate를 놓는다. </li><li> 5 분에 대한 얼음에 붉은 혈액 세포 용해 버퍼와 품다 1 ML에 Resuspend 펠릿intracardial 재관류에 의해 뇌에서 제거 할 수 없습니다 자기편 pRBC을 lyse. </li><li> RPMI 매체 9 ML을 추가, 4 ° C.에 10 분을 위해 250 XG에서 세포와 원심 분리기를 씻어 </li><li> RPMI 매체와 Eppendorf 튜브에 전송 세포의 50-100 μl에 Resuspend BSL 함유 펠렛. </li><li> 가능한 세포의 식별 Trypan 파란색으로 셀 샘플의 5-10 μl 나누어지는 1시 2분을 희석. </li><li> hemocytometer를 사용하여 현미경으로 가능한 셀을 계산합니다. 6 일 파이 (Π) 이후, P.에서 berghei ANKA에 감염된 마우스는 20,000-100,000 BSLs을 복구 할 수 있습니다, 신경 증상을 표시합니다. </li></ol> 4. 여러 가지 빛깔의의 유동 세포 계측법에 의해 BSL의 Immunophenotyping <ol><li> 4에 10 분 ° C에 250 XG에서 세포를 원심 분리기 (PBS, 1 % 태아 송아지 혈청 (FCS), 2mm EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 착색 버퍼 50 μl의 표면에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 대기음. </li><li> anti-CD16/32 항체 (Fcblock)를 정화의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 1 세포를 배양얼음에 0 분. </li><li> 얼룩 버퍼 1 ML과 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기와 표면에 뜨는을 대기음. </li><li> 필요한 형광 항체의 미리 정해진 최적의 dilutions 즉, 안티 - CD4, 항 CD8, 안티 TCR 및 안티 NK1.1를 포함하는 버퍼를 착색의 50 μl에 Resuspend 세포. </li><li> 얼음에 1 시간에 품다. </li><li> 얼룩 버퍼 1 ML과 세포를 씻으십시오. 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기와 표면에 뜨는을 대기음. </li><li> PBS 100 μl에 세포를 Resuspend. </li><li> 유동 세포 계측법 플라스틱 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 흐름 cytometer를 사용, 적어도 5,000-10,000 이벤트를 취득. 필요에 따라 적절한 흠없는 셀 컨트롤과 fluorochrome 보상 샘플이 포함되어야합니다. </li><li> 적절한 유동 세포 계측법 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다. </li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

BSL의 절연 및 분석은 특성화 및 실험 마우스 모델에서 조직 부상이나 감염에 대한 응답으로 뇌에 이주하는 염증 세포의 정량화 할 수있는 방법입니다. 장기 추출 및 후속 전지 분리하기 전에 혈액 구획의 제거를위한 intracardial 재관류 단계의 도입은 비 염증성 순환 백혈구와 염증 세포의 오염을 방지하기 위해 유용합니다. 이 염증 세포가 뇌 실질 5 침투하는 등 손쥐 뇌척수염 바이러스 등?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션 및 버퍼 </td></tr><tr><td> Giemsa의 다 쥐르 eosin의 메틸렌 블루 용액 </td><td> 머크 Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> 증류수에 희석 1시 10분 </td></tr><tr><td> RPMI 배지 </td><td></td><td></td><td> 마우스 tonicity </td></tr><tr><td> 마우스 tonicity PBS </td><td></td><td></td><td> 20 밀리미터 인산 나트륨, 0.149 NaCl, pH를 7.3 </td></tr><tr><td> 0.4 % Trypan 파랑 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> T-8154 </td><td> 1시 2분 희석 </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> 생물 화학 워딩 턴 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAse) I </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> D4263-5VL </td><td> 소 췌장에서 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-0891-01 </td><td> PBS의 30 % 솔루션 </td></tr><tr><td> Ultrapure 트리스 </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> 염화 암모늄 (NH 4 망할 CIA) </td><td> AnalaR </td><td> 10,017 </td><td></td></tr><tr><td> 적혈구 용해 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 17 MM 트리스, 14nM NH 4 CIA 같으니, pH를 7.2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 나트륨 소금 </td><td> 머크 </td><td> 10093.5V </td><td> 0.1M, pH를 7.2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 항체 conjugates </td></tr><tr><td> 안티 마우스 CD16/CD32 (FC 블록), 클론 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;TD&gt; 553142 </td><td> 50 μl 착색 버퍼 1 μl (0.5mg/50 ML) </td></tr><tr><td> FITC - 안티 - 마우스 CD4, 클론 H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-안티 - 마우스 NK1.1, 클론 PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 - 안티 - 마우스 CD8, 클론 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC - 반 마우스 TCR-β, 클론 H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-안티 - 마우스 CXCR3, 클론 220,803 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated - 안티 - 마우스 CCR5, 클론 C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin - PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 및 재료 </td></tr><tr><td> SuperFrost 현미경 슬라이드 </td><td> Lomb Menzel - Gläser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 분해 집게, 가위 </td><td> 레다 Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ML PBS 저수지 </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 고무 튜빙 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G 바늘 </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 분리 키트는 금속 체를 포함하는 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 μm 나일론 셀 스트레이너 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> GmbH의 Neubauer </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> 유동 세포 계측법 관 </td><td> BD 매 </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

우리는 P.의 뇌 혈관의 점착성의 염증 세포의 분리 및 특성에 대한 방법을 설명 berghei ANKA에 감염된 쥐. 실험 뇌성 말라리아의 유도, neurologic 증후군이 기생충 변형 결과를 따르게 마우스 변종의 감염 인간 1,2에서 Plasmodium falciparum로 인한 심각한 말라리아 recapitulates 특정 중요한 측면이. 혈액 단계 말라리아의 중년 여인 형태들이 혈관 내피 세포에 바인딩 할 수 있습니다 감염된 적혈구의 표면에 기생 단백질을 표현한다. 이 과정은 hypoxia와 haemorrhages 3 결과, 혈액의 흐름에 장애물을 유도하며 기생충 격리의 사이트에 염증 백혈구의 모집을 자극. 다른 감염, 즉 neutrotopic 바이러스 4-6 말라리아-parasitized 적혈구 (pRBC)뿐만 아니라 관련 inflamm 모두는 달리atory 백혈구는 혈관 내에서 오히려 뇌 실질에 침투보다 분리 된 상태로 유지됩니다. 따라서 비 염증 순환 세포, 장기의 추출 및 조직 처리하기 전에 감염된 - 쥐의 광범위한 intracardial 재관류로 분리 된 백혈구의 오염을 방지하는 것은 혈액 구획을 제거하는이 절차가 필요합니다. 재관류 후, 머리가 수확되고 작은 조각으로 해부 했어요. 조직 구조는 더욱 그 결과 뇌 homogenate 그때 myelin 및 기타 조직 쓰레기들로부터 뇌를 분리 백혈구의 분리 (BSL)을 할 수있는 Percoll 기울기에 centrifuged되어 Collagenase D 및 DNAse I.있는 효소 처리에 의해 방해된다. 절연 셀이 후 씻어 있으며, 유동 세포 계측법에 의한 후속 분석을 위해 형광 항체와 hemocytometer과 스테인드을 사용하여 계산. 이 절차는 염증성 백혈구의 종합적인 phenotypic 특성을 다시에있는 뇌로 마이그레이션 할 수 있습니다뇌졸중뿐만 아니라 바이러스 또는 기생충 감염 등 다양한 자극에 sponse. 방법은 또한 사전 임상 동물 모델에서 소설 항 염증성 치료의 평가에 유용한 도구를 제공합니다.

그림의 결과입니다. 이 쇼 비율과 perfused 또는 unperfused 말라리아에 감염된 그리고 나이브 제어 마우스의 뇌에서 발견 한 다른 BSL 인구의 절대 숫자. 프로토콜 텍스트에 표시된대로 절연 BSL는 PE - 반 NK1.1과 APC-반 TCR-β 항체 물들했다. 이전 결과 7-9에 의거하여 αβTCR + T 세포는 perfused 말라리아에 감염된 쥐 (6 일 PI)의 뇌에있는 BSL 수영장의 높은 비율을 구성. 이 인구는 크게 (그림 2A-B)...

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Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

의 뇌 혈관의 점착성의 염증성 백혈구 분리하기위한 방법<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA에 감염된 쥐들이 설명되어 있습니다. 방법은 유동 세포 계측법에 의해 형광 항체와 후속 분석과 얼룩 후 정량화뿐만 아니라 절연 백혈구의 phenotypic 특성 수 있습니다.

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA에 감염된 마우스

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

12.7K 조회수.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. 의 뇌 혈관의 점착성의 염증성 백혈구 분리하기위한 방법 Plasmodium berghei ANKA에 감염된 쥐들이 설명되어 있습니다. 방법은 유동 세포 계측법에 의해 형광 항체와 후속 분석과 얼룩 후 정량화뿐만 아니라 절연 백혈구의 phenotypic 특성 수 있습니다.

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Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

연구

신경과학

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

면역학 및 감염병학

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

자연의 전송에 결핵 말라리아 동시 감염을 연구하는 실험 모델 결핵균와 변형체 berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

유동 세포 계측법에 의해 쥐 말라리아 기생충의 생체 내 평가와 Merozoite 침공

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

자기 공명 영상을 이용한 실험용 뇌 말라리아 모델에서의 부종 발달 및 미세 혈관 병리학 적 추적

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

의학

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

원생 동물 기생충 감염에 대 한 기본 성상 세포와 Microglia의 수반되는 격리

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective immunity to malaria is still poorly understood, mainly due to methodological limitations of long-term Plasmodium culture, especially for Plasmodium vivax. Most studies have focused on adaptive immunity protection against malaria by antibodies, which play a key role in controlling malaria. However, the sterile protection induced by attenuated Plasmodium sporozoites vaccines is related to cellular response, mainly to cytotoxic T lymphocytes, such as CD8+ and gamma delta T cells (&#947;&#948; T). Hence, new methodologies must be developed to better comprehend the functions of the cellular immune response and thus support future therapy and vaccine development. To find a new strategy to analyze this cell-mediated immunity to Plasmodium blood-stage infection, our group established an in vitro assay that measures infected red blood cell (iRBC) killing by cytotoxic lymphocytes. This assay can be used to study cellular immune response mechanisms against different Plasmodium spp. in the blood stage. Innate and adaptative cytotoxic immune cells can directly eliminate iRBCs and the intracellular parasite in an effector:target mechanism. Target iRBCs are labeled to evaluate cell viability, and cocultured with effector cells (CD8+ T, &#947;&#948; T, NK cells, etc.). The lysis percentage is calculated based on tested conditions, compared to a spontaneous lysis control in a flow cytometry-based assay. Ultimately, this killing assay methodology is a major advance in understanding cell-mediated immunity to blood-stage malaria, helping uncover new potential therapeutic targets and accelerate the development of malaria vaccines.

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

Here we describe a new method to help elucidate the mechanisms of cellular immunity to Plasmodium during the blood stage of infection. This is an in vitro assay that measures infected red blood cell killing by cytotoxic lymphocytes.&#160;

체외 세포독성 림프구에 의한 변형체 감염 적혈구 사멸 분석

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of Plasmodium deposited by mosquitoes in the skin of vertebrate hosts undergoes a phase of mandatory development in the liver before initiating clinical malaria. We know little about the biology of Plasmodium development in the liver; access to the sporozoite stage and the ability to genetically modify such sporozoites are critical tools for studying the nature of Plasmodium infection and the resulting immune response in the liver. Here, we present a comprehensive protocol for the generation of transgenic Plasmodium berghei sporozoites. We genetically modify blood-stage P. berghei and use this form to infect Anopheles mosquitoes when they take a blood meal. After the transgenic parasites undergo development in the mosquitoes, we isolate the sporozoite stage of the parasite from the mosquito salivary glands for in vivo and in vitro experimentation. We demonstrate the validity of the protocol by generating sporozoites of a novel strain of P. berghei expressing the green fluorescent protein (GFP) subunit 11 (GFP11), and show how it could be used to investigate the biology of liver-stage malaria.

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is transmitted through inoculation of the sporozoite stage of Plasmodium by infected mosquitoes. Transgenic Plasmodium has allowed us to understand the biology of malaria better and has contributed directly to malaria vaccine development efforts. Here, we describe a streamlined methodology to generate transgenic Plasmodium berghei sporozoites.

유전자 변형 Plasmodium berghei Sporozoites 생성

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석

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