Name: evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
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Questo studio è stato sostenuto finanziariamente in parte dalla Fondazione Novartis per medical - ricerca biologica (a PYM), il Gottfried e Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (a MW e PYM) e la piscina di ricerca dell'Università di Friburgo (a PYM). Ulteriori contributi comprendono le borse di eccellenza della Confederazione Svizzera per studiosi stranieri (di KAB e SM). Ringraziamo Isabelle Fellay e Solange Kharoubi Hess per supporto tecnico.

Globuli rossi umani sono stati ottenuti dal sangue di donatori sani, conformemente agli orientamenti di Swissethics (swissethics.ch).
Nota: P. falciparum parassita culture (3 7) ed EV produzione precedentemente sono stati descritti in Mbagwu, et al. 11 perché p. falciparum è un patogeno umano, consultare i regolamenti locali per la manipolazione. Le culture dovrebbero essere tenute sterile l'intero tempo.
1. fluorescenza etichettatura del SVE
Nota: La procedura seguente si avvale della tecnologia d'etichettatura per incorporare stabilmente un colorante fluorescente verde (PKH67) con grandi code alifatiche nella regione del lipido della membrana EV. La reazione è condotta in un volume contenente una concentrazione finale di 20 µM di PKH67 di colorazione finale 200 µ l. Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente (20-25 ° C)
<ol><li>Posto 100 µ g di EVs in 1 mL di PBS in una microcentrifuga.</li>
	<li>Centrifugare lo SVE in un tubo del microcentrifuge alla massima velocità (20.000 x g) per 7 min a pellet. Nota: Poiché emozoina è presente nel server virtuale di Exchange, un pellet brunastro rosso-scuro dovrebbe essere osservata. Se il supernatante è rossastro, il servizio volontario europeo è lisate.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante con attenzione, al fine di evitare la rimozione di qualsiasi server virtuale di Exchange. Nota: Ridurre al minimo la quantità di residuo buffer presenti prima risospendere EVs in diluente C al fine di aumentare l'efficienza della colorazione e riproducibilità.</li>
	<li>Risospendere il pellet di EV in 100 µ l di diluente C (2 X sospensione EV) e delicatamente pipetta per assicurare la completa dispersione.</li>
	<li>Preparare un nuovo tubo del microcentrifuge e aggiungere 4 µ l della soluzione etanolica tintura PKH67 a 100 µ l di diluente C. Vortex bene per mescolare. Preparare la soluzione di colorante 2 x (40 µM) immediatamente prima della colorazione. Nota: Per evitare macchie eterogenei, non aggiungere la soluzione di colorante etanolica PKH67 direttamente per il pellet di EV.</li>
	<li>Rapidamente, è possibile combinare i 100 µ l di sospensione di EV (passo 1.4): 2x con i 100 µ l di soluzione colorante (passo 1,5): 2x. Quindi, mescolare il campione pipettando su e giù per 10 volte.</li>
	<li>Incubare la sospensione EV/colorante dal passaggio 1.6 per 5 min, protetta da luce e mescolare nel Vortex 3 - 4 volte durante l'incubazione di 5 min. Nota: Incubando la sospensione di EV/colorante per tempi più lunghi non fornisce alcun vantaggio, perché la colorazione è così rapida.</li>
	<li>Fermare la reazione di macchiatura aggiungendo un volume uguale (200 µ l) del siero e incubare per 1 min consentire l'associazione di colorante in eccesso. Nota: Prima di arrestare la macchiatura, impoveriscono il siero da EVs mediante centrifugazione a 20.000 x g per 20 min.</li>
	<li>Lavare 3 volte con PBS e spin giù a 20.000 x g per 5 min. Risospendere lo SVE in 100 µ l di PBS per raggiungere una concentrazione finale di 1 µ g / µ l.</li>
</ol>2. visualizzare l'assorbimento dello SVE mediante microscopia confocale
Nota: Il seguente protocollo descrive il tracciamento di interiorizzazione EV dalle cellule endoteliali coltivate su vetrini coprioggetti. Le cellule endoteliali sono cellule endoteliali del midollo osseo umane semi-immortalate come descritto in12.
<ol><li>Lavorare in un ambiente sterile, cappotto coprioggetti con un eccesso di 0.01% poli-L-lisina per 10 min a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Aspirare la soluzione di poli-L-lisina e consentire i coprioggetti asciugare completamente.</li>
	<li>Eseguire un conteggio di cellule endoteliali vitali utilizzando esclusione in Trypan blue e un emocitometro.</li>
	<li>Trasferire 1 x 105 cellule endoteliali in 1 mL di completa Medium di crescita cellulare endoteliale contenente la miscela di supplemento per i coprioggetti rivestiti con poli-L-lisina e lasciare che le cellule crescono di un monostrato. Nota: Il supporto contiene fattori di crescita che permettono alle cellule di formare un monostrato e a formare giunzioni strette.</li>
	<li>Una volta che le cellule formano un monostrato, attentamente aspirare il mezzo e aggiungere 1 mL di terreno nuovo per lavare le cellule. Ripetere il lavaggio una volta di più. Aggiungere 50 µ g di PKH67-labeled EVs e incubare per 4 h. Nota: Per trovare il punto di tempo ottimo per l'assorbimento, un corso a tempo può essere eseguito.</li>
	<li>Dopo 4 h, aspirare il mezzo e lavare le cellule 3 volte con PBS per rimuovere EVs in eccesso e non associato. Fissare le cellule con soluzione di paraformaldeide 3% in PBS per 15 min. Nota: Metanolo possa interferire con l'actina durante il processo di fissazione; Pertanto, è meglio evitare qualsiasi metanolo contenente fissativi o altri fissativi a base di solvente. Si consiglia di utilizzare metanolo senza formaldeide come fissativo.</li>
	<li>Lavare le cellule 3 volte con PBS. Aggiungere con cautela 250 µ l di 0.1% Triton X-100 in PBS per permeabilize le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
	<li>Lavare 3 volte con PBS. Aggiungere 400 µ l di tampone bloccante (5% BSA in PBS) per 30 min a RT per bloccare il legame non specifico.</li>
	<li>Lavare le cellule una volta con PBS. Preparare la soluzione di colorazione diluendo 5 µ l della soluzione madre falloidina in 200 µ l PBS/1% BSA per ogni vetrino coprioggetto. Dispensare 200 µ l di soluzione colorante il coprivetrino e incubare per 20 minuti a TA.</li>
	<li>Lavare 3 volte con PBS. Colorante di contrasto il DNA per 30 s con Hoechst 33342 ad una concentrazione finale di 2 µ g/mL a 200 µ l di PBS.</li>
	<li>Lavare il vetrino coprioggetto: 2x aggiungendo 400 µ l di PBS. Attentamente afferrare il coprioggetto con il forcipe e negarlo sulla cima di una goccia di antifade supporti di montaggio su un vetrino. Rimuovere delicatamente il terreno in eccesso con un fazzoletto e sigillare ogni lato con smalto.</li>
	<li>Archiviare le diapositive proteggere dalla luce a 4 ° C.</li>
	<li>Visualizzare le celle utilizzando un microscopio confocale laser eccitazioni 405, 488 e 543 nm e un 63 X, obiettivo di olio 1,3 NA con emissioni fluorescenti a 450-470 nm (blu), 505-530 nm (verde) e 620 nm. Nota: F-actina tipica colorazione risultati sono mostrati nella Figura 1.</li>
</ol>3. endothelial delle cellule permeabilità
Nota: Permeabilità delle cellule endoteliali è valutata misurando il trasferimento di Rodamina B isotiocianato-destrano (medio MW 70.000) lungo il monostrato di cellule endoteliali. Destrano fornisce un ottimo strumento per studiare la permeabilità vascolare.
<ol><li>Conta cellule endoteliali vitali utilizzando esclusione in Trypan blue 0,4% e un emocitometro.</li>
	<li>Le cellule endoteliali ad una densità di 0,6 x 105 celle alla confluenza in coltura di tessuti 24 pozzetti inserti (dimensione dei pori di 0,4 µm) e lasciare indisturbato per almeno 5 giorni formare strati monomolecolari differenziati della piastra. Aggiornare il mezzo ogni secondo giorno.</li>
	<li>Una volta che le cellule raggiungono un monostrato, caricare il servizio volontario europeo (50 µ g in 1 mL) sulla camera superiore. Aggiungere il rodamina-destrano al pozzo superiore ad una concentrazione finale di 20 mg/mL. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Monitorare il trasferimento del destrano fluorescente a fondo anche misurando l'emissione di fluorescenza da aliquote medie di 40 µ l. Impostare il lettore di micropiastre multi-etichetta a 544 nm eccitazione e di 590 nm emissione per misurazioni. Nota: La quantità di destrano diffusa può essere quantificata utilizzando le curve di calibrazione stabilite con la soluzione di riserva. Inoltre, esperimenti cinetici possono essere eseguiti rimuovendo piccoli campioni del mezzo alloggiamento esterno durante un corso a tempo (Figura 2). Anche senza alcun trattamento, il destrano diffonderà attraverso il monostrato cellulare.</li>
</ol>4. determinare la sensibilità con puromicina.
Nota: Prima di trasdurre le linee cellulari con lentivirus, è importante determinare la curva di uccisione di un farmaco selezionato per quella linea particolare cellula. Per determinare l'importo minimo della concentrazione di farmaco necessario uccidere tutte le cellule, è necessario effettuare un esperimento di risposta dose utilizzando dosi incrementali del farmaco selezionato. Poiché ogni linea di cellule di mammifero ha una diversa sensibilità, prima sperimentazione, la concentrazione ottimale dell'antibiotico dovrebbe essere determinata sviluppando la titolazione di curva di uccidere come dettagliato di seguito.
<ol><li>Contare le celle utilizzando l'emocitometro. Risospendere le cellule endoteliali ad una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL in completa Medium di crescita cellulare endoteliale contenente la miscela di supplemento.</li>
	<li>Piastra di 1 x 104 celle in una piastra a 96 pozzetti in un volume finale di 100 µ l di Medium di crescita delle cellule endoteliali.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di terreno contenente gli antibiotici per ottenere una concentrazione di 0,1-10 µ g/mL (vedere la Figura 3).</li>
	<li>Esaminare l'attuabilità delle cellule ogni 2 giorni sotto un microscopio chiaro utilizzando un obiettivo X 20. Le cellule della coltura per 10-14 giorni e sostituire i supporti contenenti con puromicina ogni 2-3 giorni a seconda della crescita delle cellule.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l/pozzetto MTS reagente in ciascun pozzetto, mix e incubare per 4 h a 37 ° C in condizioni di coltura standard.</li>
	<li>Agitare brevemente la piastra su un agitatore e misurare l'assorbanza delle cellule trattate e non trattate utilizzando un lettore di piastra a 490 nm (Figura 3).</li>
</ol>5. trasduzione delle cellule endoteliali con vettore lentivirale
<ol><li>Piastra di 1 x 105 cellule endoteliali in 1 mL di terreno completo il giorno prima di trasduzione. Eseguire la trasduzione quando le cellule hanno raggiunto confluency di 50-80%.</li>
	<li>Scongelare il lentivirus su ghiaccio e rendere le aliquote degli stock virali per evitare cicli di gelo-disgelo. Rotazione verso il basso il materiale a 200 x g per 30 s, nei tubi prima di aprire per evitare fuoriuscita di sopra.</li>
	<li>Aggiungere bromuro di hexadimethrine le cellule ad una concentrazione finale di 8 µ g/mL. Nota: Il bromuro di Hexadimethrine aiuta l'efficienza di trasduzione, tuttavia in alcuni casi potrebbe essere tossico per le cellule. Pertanto, la concentrazione ottima deve essere determinata eseguendo una curva di uccisione prima la trasduzione.</li>
	<li>Agitare la piastra delicatamente per mescolare. Aggiungere la quantità appropriata di particelle virali (tra 0,5-2 x 106 particelle) ad una molteplicità di adatta di infezione (MOI) e agitare la piastra delicatamente per 30 s a mescolare.</li>
	<li>Centrifugare il mix di particella virale delle cellule nella centrifuga a RT per 45 min a 300 x g per aumentare l'efficienza di trasduzione. Incubare la miscela di particella virale delle cellule a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il mezzo che contengono particelle virale e scartare in modo appropriato. Sostituirlo con terreno di coltura completo fresco, pre-riscaldato.</li>
	<li>Avviare la selezione con con puromicina il secondo giorno: rimuovere il mezzo e sostituirlo con medium fresco contenente la concentrazione corretta di con puromicina come determinato in precedenza nella sezione 4 (Figura 3).</li>
	<li>Raccogliere le cellule dopo selezione con puromicina e isolare RNA usando un RNA isolando kit seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Eseguire la sintesi del cDNA con il selezionato Mirna utilizzando una trascrizione inversa kit (vedere la Tabella materiali).</li>
	<li>Impostare la reazione di qPCR secondo il citato protocollo13.</li>
</ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Malaria Report 2015. , (2015).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites.">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li><li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation.">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system.">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li><li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles.">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li><li>Szempruch, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+from+Trypanosoma+brucei+Mediate+Virulence+Factor+Transfer+and+Cause+Host+Anemia.">Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia.</a> Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria.">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727 (2016).</li><li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria.">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li><li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line:+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li><li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs.">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Mulcahy, L. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Diversi parassiti, tra cui il Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania e Trichomonas innescano il rilascio di EVs dalla cellula ospite infetto. A seconda dei patogeni, lo SVE rilasciato possono modulare la risposta immunitaria o mediare la comunicazione cellulare tra i parassiti6. Ancora, ci è poca prova che suggerisce come queste piccole vescicole contribuiscono alla malattia di malaria. Qui, abbiamo descritto diversi modi per studiare la funzione del server virtuale di Exchange durante l'infezione d...

Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, c'erano 212 milioni di nuovi casi di malaria nel mondo nel 2015 e morirono circa 429.000 persone, principalmente bambini sotto i cinque anni di età1. I meccanismi che conducono alla malattia severa, che spesso è associata con disfunzione vascolare, rimangono mal definiti2. Plasmodium- iRBCs secernono sfere piccole bi-lipido membrana conosciute come vescicole extracellulari (EVs). È noto che queste SVE sono potenzialmente rilevanti per il processo di infezione e la risposta immunitaria all'infezione; Tuttavia, piccolo è conosciuto circa la funzione esatta di queste piccole vescicole durante la malaria infezione3. È possibile che essi svolgono due ruoli importanti: da un lato, essi potrebbero contribuire alla patogenesi attivando i macrofagi4,5; e d'altra parte, essi potrebbero mediare la comunicazione cellulare tra parassiti e tra parassiti e host6,7. Infatti, i parassiti possono trasferire proteine o acidi nucleici tra loro tramite EVs. Ad esempio, Trypanosoma brucei rhodesiense SVE può trasferire fattore di virulenza Serum Resistance-Associated (SRA) e puoi indirizzare altri T. brucei e l'host eritrociti8. Inoltre, p. falciparum- iRBCs comunicano tra loro mediante il trasferimento di acidi nucleici all'interno di server virtuale di Exchange. In questo modo i parassiti ottimizzare e sincronizzare la sua crescita. Infatti, EVs potrebbe essere il principale regolatore di conversione gametocyte e quindi contribuire alla regolazione della trasmissione fase7.
Non solo SVE regolano i parassiti, anche mediano interazioni parassita-ospite. Abbiamo recentemente scoperto che SVE da iRBCs contengono derivati host microRNAs (miRNAs; piccole specie di RNA nella gamma di 21-25 nucleotidi9) che sono presi dalle cellule endoteliali umane. I miRNA nel server EVs formano un complesso con Ago2 stabile (un membro del RNA-induced silencing complex), che una volta consegnato il destinatario delle cellule, è in grado di specificamente silenziare l'espressione genica e che influenzano le proprietà barriera delle cellule10. Protocolli standard sono stati sviluppati per studiare la funzione del SVE. Qui, descriviamo in primo luogo un protocollo che consente l'etichettatura fluorescente di EVs per indagare il loro assorbimento dalle cellule recettive. Inoltre, utilizzando un microscopio confocale, è possibile tenere traccia di destino di EV all'interno della cellula. Diversi coloranti fluorescenti utilizzabile per tenere traccia di EVs. L'ammina-reattivo colorante, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) e fluorescenti di calceina-AM diventa una volta all'interno delle vescicole. Preferiamo utilizzare l'etichetta anfifiliche, PKH, perché dà un segnale più luminoso e uniforme. Questo approccio fornisce informazioni importanti per comprendere le interazioni tra EVs e cellule recettive. Mentre in alcuni casi EVs legarsi alla superficie delle cellule, alcune vescicole sono prese velocemente. Dopo l'assorbimento, EVs consegnare loro carichi per le cellule, in cui esercitano le loro funzioni di regolamentazione.
Qui, descriviamo un protocollo per misurare la funzione della barriera di cellule endoteliali in vitro quantificando il trasferimento di un destrano fluorescente attraverso un monostrato cellulare. Più sensibili traccianti possono essere utilizzati come marcatori radioattivi. Tuttavia, richiedono speciali precauzioni per l'uso. Altri saggi esistono per misurare la funzione di barriera in vitro come resistenza elettrica transendoteliale (TEER), che misura l'integrità stretta della giunzione. Infine visualizzare ZO-1, una proteina di giunzione stretta, dall'immunofluorescenza consente la valutazione dell'integrità di giunzione stretta come ben10. Poiché SVE sono entità complesse ed eterogenee, contenente diversi carichi con potenziale normativo caratteristica, è utile iperesprimono un RNA specifico per studiare il suo effetto sulla cellula ricevente. Di conseguenza, si definisce anche un protocollo che mira a generare linee cellulari stabili che esprimono il miRNA di interesse10.

<table><tbody><tr><td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Diluent C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin CF594</td><td>Biotium</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&amp;ndash;Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Insert with PET membrane transparent Falcon&amp;nbsp;for plate 24 wells</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth&amp;nbsp;Medium MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&amp;nbsp;Lenti microRNA, Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>hsa-mir-451a&amp;nbsp;RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

La malaria è una malattia pericolosa causata da parassiti del plasmodio , con p. falciparum è la più diffusa nel continente africano e responsabile della maggior parte dei decessi per malaria a livello globale. Diversi fattori tra cui il sequestro del parassita nei tessuti, disfunzione vascolare e le risposte infiammatorie influenzano l'evoluzione della malattia nelle persone con infezione da malaria. P. falciparum-globuli rossi infetti (iRBCs) rilasciare piccole vescicole extracellulari (SVE) contenente diversi tipi di molecole di carico che mediano la comunicazione cellulare e patogenesi tra parassiti e host. SVE in modo efficiente sono presi dalle cellule in cui si modula la loro funzione. Qui si discute di strategie per affrontare il ruolo del server virtuale di Exchange nelle interazioni parassita-ospite. In primo luogo, descriviamo un metodo semplice per l'etichettatura ed EV interiorizzazione di rilevamento dalle cellule endoteliali, utilizzando un colorante del linker cella verde. In secondo luogo, segnaliamo un modo semplice per misurare la permeabilità attraverso un monostrato di cellule endoteliali utilizzando un destrano fluorescente contrassegnato. Infine, vi mostriamo come studiare il ruolo di piccole molecole di RNA non codificanti nella funzione delle cellule endoteliali.

Qui, descriviamo protocolli per studiare le interazioni del SVE con cellule dell'ospite. L'assorbimento di fluorescente contrassegnati EVs è monitorata mediante microscopia confocale (Figura 1). Cellule endoteliali prendono efficientemente EVs, comunque il tempo di incubazione con SVE può essere ottimizzato per monitorare l'assorbimento. Per una migliore localizzazione del SVE all'interno delle cellule, macchia di actina con falloidina. Quindi, utilizziamo ...

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Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

In questo lavoro descriviamo protocolli per studiare il ruolo delle vescicole extracellulari (SVE) rilasciato dagli eritrociti Plasmodium falciparum infettati. In particolare, ci concentriamo sulle interazioni con le cellule endoteliali del SVE.

Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

evaluation-of-extracellular-vesicle-function-during-malaria-infection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Views.  University of Fribourg. In questo lavoro descriviamo protocolli per studiare il ruolo delle vescicole extracellulari (SVE) rilasciato dagli eritrociti Plasmodium falciparum infettati. In particolare, ci concentriamo sulle interazioni con le cellule endoteliali del SVE.

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infezione da modello per lo studio<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield Purificazione di<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiti Per l&#39;uso in opsonizzante anticorpo saggi

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

In Vivo Valutazione del roditore Plasmodium parassitemia e merozoite Invasion di Citometria a flusso

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per la misurazione Risposte immunitarie Malaria nel contesto della coinfezione da HIV

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Metodi per studiare il ruolo di regolamentazione dei piccoli RNA ribosomiale e di occupazione<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoiti

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of cerebral malaria can be difficult. We present an experimental mouse model of cerebral malaria that shares multiple features of the human disease, including edema and microvascular pathology. Using magnetic resonance imaging (MRI), we can detect and track the blood-brain barrier disruption, edema development, and subsequent brain swelling. We describe multiple MRI techniques that can visualize these pertinent pathological changes. Thus, we show that MRI represents a valuable tool to visualize and track pathological changes, such as edema, brain swelling, and microvascular pathology, in vivo.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

We describe a mouse model of experimental cerebral malaria and show how inflammatory and microvascular pathology can be tracked in vivo using magnetic resonance imaging.

Tracciamento in vivo di sviluppo dell&#39;edema e patologia microvascolare in un modello di malaria cerebrale sperimentale mediante l&#39;utilizzo di immagini a risonanza magnetica

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

Medicina

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

Misurazione di anticorpi che inducono la fagonenza acquisita naturalmente ai parassiti Plasmodium falciparum mediante un'analisi basata sulla citometria del flusso

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

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Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

Un

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti

High Yield Purificazione di

In Vivo Valutazione del roditore Plasmodium parassitemia e merozoite Invasion di Citometria a flusso

Un

Metodi per studiare il ruolo di regolamentazione dei piccoli RNA ribosomiale e di occupazione

Mieloide isolamento delle cellule da topo pelle e drenante linfonodi seguito intradermica immunizzazione con vivo attenuato

Tracciamento in vivo di sviluppo dell'edema e patologia microvascolare in un modello di malaria cerebrale sperimentale mediante l'utilizzo di immagini a risonanza magnetica

Misurazione di anticorpi che inducono la fagonenza acquisita naturalmente ai parassiti Plasmodium falciparum mediante un'analisi basata sulla citometria del flusso