저자는 협력과 다음의 연구 자금 지원 기관의 재정 지원을 인정하고 싶습니다 : 앨버타 가축 및 육류 기관 (주), 돼지 고기 CRC, 앨버타 돼지 고기, Hypor 헨드릭스 유전학 회사와 NSERC CRSNG합니다.

동물 관리 지침에 캐나다 협의회와 학부 동물 정책 복지위원회의 승인에 따라 - 알버타 대학의 가축, 임신 모돈은 임신과 태아의 (30)는 수집 된 약의 날 훈련 된 직원에 의해 안락사시켰다. 과정에서 항상 시험 장갑을 사용합니다. 1. 샘플 수집 및 샘플 보관 <ol><li> 방혈 다음 고정 볼트를 사용하여 모돈을 안락사. 각 안락사 모돈에서 생식 책자와 배아를 수집하기 위해 시험 장갑을 착용 할 것. 참고 : 샘플 및 이식란의 신속한 수집을 얼음 또는 액체 질소는 마이크로 어레이 및 qPCR에 다른 분자 작품에 대한 높은 품질의 조직에서 발생합니다 건조. </li><li> 자궁을 해부 부드럽게 기본 자궁 벽 (21)로부터 자신의 배외 (extraembryonic) 태반 막 내의 모든 배아를 분리합니다. 모성 조직 오염이없는 것을 확인합니다. </li><li> 레냉동하기 전에 모든 가능한 배아의 코드 길이와 무게. </li><li> 각각의 배아를 수집하고 즉시 스냅 액체 질소로 냉동 전에 알루미늄 호일을 마무리. </li><li> 직접 -80 ° C 냉장고에 액체 질소에서 냉동 배아를 전송합니다. </li></ol> 2. 연삭 배아 <ol><li> 샘플 수에 필요한 샘플 ID 모든 샘플 튜브 (15 ml)에 라벨하는 분석한다. </li><li> 반 전체에 드라이 아이스와 열 컨테이너를 입력하고 드라이 아이스에 미리 라벨링 샘플 튜브를 삽입합니다. </li><li> 얼음 컨테이너를 건조 C의 냉동고 -80 °에서 미리 냉장 박격포와 방앗 공이를 전송하기 위해 상단에 시험 장갑 또 한 쌍의 겨울 장갑을 착용 할 것. </li><li> 드라이 아이스에 박격포 내부의 냉동 배아를 놓습니다. </li><li> 배아를 커버하고 미세 분말로 유봉으로 갈아 충분한 액체 질소를 따르십시오. </li><li> MICR으로 미리 라벨링 샘플 튜브 배아 분말 전송ospatula (그림 1) 및 -80 ° C의 냉동고에 튜브를 배치합니다. </li><li> 각각의 배아에 대한 깨끗한 사전 냉장 박격포와 유 봉을 사용하여 샘​​플 간의 교차 오염을 방지하기 위해 각 배아를 분쇄 한 후 시험 장갑을 변경합니다. </li></ol> 3. 게놈 DNA 준비 수산화 나트륨 방법 수정 사용 <ol><li> 샘플 수에 필요한 모든 라벨 마이크로 원심 튜브 (1.5 ml)을 분석한다. </li><li> 배아로부터 분말을 함유하는 샘플 튜브를 전송 -80 ° C에 냉동 컨테이너에 드라이 아이스로 앞서 개시한다. </li><li> 각각의 미리 라벨링 된 마이크로 원심 튜브에 50 밀리미터의 NaOH (수산화 나트륨)을 180 μL 피펫. </li><li> 95 ° C에 인큐베이터 및 예열을 켭니다. </li><li> 50 mM의 수산화 나트륨 용액을 함유하는 미리 라벨링 microcentrifuge 관으로 샘플 관으로부터 배아 분말의 정확한 양 (약 5 ~ 10 mg)를 (도 2) 전송 이쑤시개를 사용한다. </li><li> 유 당겨페이지 같은 이쑤시개 천천히 끈적 끈적 끈적한 흰색 투명 같은 물질 (그림 3)과 같이 DNA 용 해물을 시각화합니다. </li><li> 5 분 동안 95 ℃에서 예열 된 인큐베이터 DNA 해물과 마이크로 원심 튜브에 옮긴다. 즉시 얼음으로 가득 스티로폼 상자에 튜브를 전송합니다. </li><li> 직접 microcentrifuge 관에 1 M 트리스 - 염산 20 μl를 추가하고 부드럽게 튜브를 도청하여 섞는다. pH가 원심 분리에 앞서 약 8.0 (그림 4) 보장하기 위해 산도 용지를 사용하십시오. 주의 : 샘플 제제의 다수를 처리 할 때, 랜덤 pH를 확인하는 몇몇 시료를 선택하는 것도 수용 가능하다. </li><li> 불용 조직 파편을 제거하기 위해 실온에서 2 분 동안 미세 원심 2,000 XG에서 DNA 해물과 튜브를 원심 분리기. </li><li> 전송 새로운 튜브로 가기 맑은 상층 액 150 ㎕를 96 웰 플레이트. 참고 : 명확한 DNA 용 해물이 PC에서 템플릿으로 사용할 준비가R 반응하고 2 주 동안 39 ° C에서 안정하다거나 해 -20 ° C에 보관 될 수있다. </li></ol> 4. 디자인 성 특정 PCR 프라이머 <ol><li> NCBI 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에서 돼지 섹스 결정 지역 Y (SRY)에 대한 가입 번호 (NM_214452.3) 및 아연 손가락 단백질 X-링크 (ZFX) 유전자 (XM_005673501.1)을 구합니다 /. </li><li> 복사 및 온라인 프라이머 디자인 도구 이러한 NCBI의 가입 번호를 붙여 넣습니다. 주 : 길이로 Tm GC %의뿐만 아니라 PCR 생성물 크기 (BP) 컴퓨터 스크린 상에 생성된다 (도 5)을 포함하여 가장 프라이머 정보. </li><li> 이 시퀀스 만 각각 SRY 및 ZFX (그림 6)에 대한 X와 Y 염색체에있는 보장하기 위해 현재 돼지 게놈 데이터베이스 (104)에 대해 염기 폭발 프로그램 (BLASTN)를 사용하여 이러한 프라이머의 특이성을 확인합니다. </li></ol> 직접 DNA 해물 5. 게놈 DNA PCR <ol><li> 용도15 ㎕의 PCR 반응을위한 주형으로서 DNA 파쇄물의 1 μL. 참고 : 96 웰 PCR 플레이트에 대한 고 처리량 스크리닝 방법은 멀티 채널 피펫을 사용하여 유사한 방식으로 수행 될 수있다. </li><li> 단지 첫 번째 PCR을 위해 다음을 수행하십시오 시판 알려진 섹스 돼지 게놈 DNA 1 μL (0.5 NG)를 추가하여 더 템플릿 음성 대조군과 양성 대조군을위한 두 개의 추가 튜브에 대해 하나의 PCR 튜브를 준비합니다. 그 후, 양성 대조군으로 성공적인 마지막 sexing 분석에서 샘플을 포함 성 결정을위한 새로운 PCR 반응과 함께 실행. </li><li> 모든 핫 스타트 준비 믹스 PCR 효소를 사용하여 프라이머를 첨가하여 마스터 믹스를 제조 및 PCR 반응의 총 수에 따라 자유로운 물 클레아. PCR 마스터 믹스를 14 μL로 기존의 PCR 튜브에 DNA 용해 액 1 μl를 추가한다. 프라이머를 추가하여 두 성별 특정 유전자의 프라이머를 최종 농도 15 μL의 PCR (R)의 합계는 0.3 μM임을eaction. </li><li> 열 순환기 다음 PCR 프로그램을 설정 : 3 분, 95 ° C 35 사이클 15 초 신장 단계 다음 65 ℃에서 15 초간 어닐링 단계 다음 20 초 용융 단계 98 ° C, 각각의 72 ° C에서. 최종 단계에서, 72 ℃에서 1 분 동안 반응을 부화 성을 결정하는 전기 영동 검증 PCR 튜브를 제거 할 때까지 4 ℃에서 배양을 계속. 참고 : PCR 조건과 최적화 재료 표에 언급 된 PCR 키트의 설명서에 따라 있습니다. </li><li> 2 % TBE 아가 로스 젤을 준비 할 때 비 독성 녹색 형광 SYBR DNA 젤 얼룩의 적절한 금액을 추가합니다. 참고 : 사용할 수없는 경우 에티 디움 브로마이드가 녹색 형광 얼룩 대체 할 수 있습니다. </li><li> PCR 튜브에 로딩 염료 (10 배)의 1.5 μl를 추가하고, PCR 반응 버퍼 상하 피펫 팅하여 잘 섞는다. </li><li> 잘 연구에 시료의 부하 10 μL유엔 적절한 전압 설정을 사용하여 아가 로스 젤 (염료 밴드까지 100 V에서 작은 젤 장치, 150 V에서 96 웰 젤 장치는 젤을 통해 절반 방법을 실행). </li><li> 관찰 및 레이저 스캐너를 사용하여 형광 설정하에 밴드 강도를 조정하고, 겔의 이미지를 캡처. 주 : 일반 겔 메이져는 에티 디움 브로마이드 젤 치환 될 수있다. </li><li> 여성으로 하나의 밴드와 남성과 같은 두 개의 밴드 (그림 7)와 배아를 식별하여 돼지 태아의 성별을 결정합니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

돼지 배아의 DNA 섹스 입력과 관련된 기존 프로토콜의 대부분은 초기 착상 전 단계 (15, 16)에만 적합하다. 우리는 성공적으로 임신 후기 돼지 배아 선별에 적합한 프로토콜을 개발했습니다. 이전 연구 6,18 배아의 발달 단계와 유사한 연구에 근거하여, 본 프로토콜은 안전하고 저비용으로되는 것으로 간주된다. 이 프로토콜은 또한 96- 웰 플레이트에 DNA 해물로 ?...

돼지는 인간과 가축 부문 모두에서 개발, 유전학과 영양의 기초 연구 대상이되고있다. 인간에 ​​대한 생물 의학 연구 모델로 돼지의 전위 생리적 유사성에 기인 할 수있다. 가축, 성비의 조작 선택 유전자 개선 프로그램 (1)의 효과를 향상시킬 수있다. 개별 배아를 Sexing하는 것은 포함하지만 초기 배아 개발 2시 유전자형, 후성 유전학 성적 이형 태성의 X 불 활성화에 국한되지 많은 실험 연구에 사용되는 기본 도구입니다. 생쥐의 연구는 산모의식이 요법과 다른 요인은 성별 불균형 3 발생할 수 있습니다 것이 좋습니다. 돼지에서 성비 불균형의 원인은 아버지의 품종 4, 자궁 용량 5, 모돈의 대사 상태 (6)을 포함한다. 배아 및 새끼 관찰 차이 자체에 의해 영향을받을 수 있기 때문에xual의 이형 태성은, 연구자들은 자신의 연구에 대한 결론을 도출하기 전에 배아 섹스와 섹스 비율을 알고 있어야합니다. 개발의 날 (30)에 돼지 배아를 sexing을위한 효율적인 툴과 프로토콜의 개발은 여기에서 논의 될 것이다. 섹스 입력의 다양한 방법 모델 생물과 가축의 유전 연구를 위해 개발되었습니다. 특히 가축에, 남성과 여성의 초기 배아를 식별하는 육종 프로그램에 대한 유전 적 선택을 향상시키기 위해 매우 일반적이다. 김사 7 강렬한 형광 8,9 기술을 사용하여 돼지의 핵형 초기 배아는 성 입력을 위해 사용되어왔다. 그러나, 이들 방법은 시간 소모적이고 신속하고 정확하게 다수의 배아 스크리닝에 적합하지 않다. 가장 효과적인 성 입력 방법은 열 안정성 DNA 폴리머 라제 및 프라이머 쌍을 사용하여 DNA의 증폭이다. PCR 법에 의한 DNA의 sexing는 오보다, 특정 신속하고 민감할수 있답니다 다공질 재료의 미세한 양을 요구. 첫 번째 PCR 기반의 배아 sexing 인간 (10)에서 수행하고, 나중에 마우스 (11), 소 (12), 버팔로 (13)와 양 (14) 착상 전 배아에서했다. 돼지에서 초기 DNA 섹스 입력 방법은 Y 염색체 특이 DNA 프라이머 (15)의 한 쌍을 통해 착상 전 배아를 위해 설립되었다. 그러나 성 결정을위한 가장 일반적인 PCR 프라이머 말레 특정 SRY 유전자 (16) 및 X 및 Y 염색체 17 모두에 위치 징크 핑거 유전자의 비 성 차별적 영역의 Y 염색체로부터 선택 하였다. 이어서,이 프라이머는 아연 핑거 유전자의 X- 염색체를 검출하는 프라이머의 향상된 특이성이 연구에서 30 일 된 배아의 성을 확인하기 위해 적용되어왔다. 돼지의 착상 전 배아에서 게놈 DNA를 proteinas와 버퍼링 그대로 배반포를 노출하여 추출 할 수있다전자 K (16) 또는 개별 초기 분열에서 몇 세포의 생검을 고려하여 15 배아 직접 PCR을 위해 그들을 사용. 그러나 돼지의 혈액, 머리카락, 조직 또는 크기가 몇 센티미터 이상의 큰 수태에서 DNA의 방출을 효과적으로 테 K 방법을 사용하여 수행되지 않습니다. 이들 물질에 대한 DNA 추출 방법은 시간이 많이 걸리고, 페놀 / 클로로포름 프로토콜 6 비싼 열 기반 키트 (18)를 사용하여 설정 하였다. 잠재적 독성 화학 물질의 사용을 피하기 위해, 저렴하고 쉬운 페놀없는 DNA 추출 방법을 개발하는 경향이있다. 마우스 (19) 및 (20) 지브라 피쉬 조직으로부터 PCR 품질 게놈 DNA의 분리를위한 프로토콜이 이러한 유형의 핫 수산화 나트륨 및 트리스 (유능한)를 사용하여 구축되었다. 이 연구는 PCR 섹스인가요 수정 및 재 설계 이중 프라이머 쌍은 일의 세포 용 해물 (30) 돼지 배아에 직접 입력하여 DNA를 얻을 수있는 프로토콜을 제공높은 정확도.

<table><tbody><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit&amp;nbsp;</td><td>KAPABiosystems</td><td>KR0370</td><td>other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe</td></tr><tr><td>Pig female and male genomic DNA</td><td>Zyagen</td><td>GP-160-F1 &amp;amp; GP-160-M5</td><td>Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9500 laser scanner</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9969-43</td><td>other imaging system can be used</td></tr><tr><td>Free Soft Nitrile Examination Gloves</td><td>WWR</td><td>89038-270</td><td>any other examination glove can be used</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide, solid&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 359 -212</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean</td><td>Eppendorff</td><td>0030 108.051</td><td>heat resistant</td></tr><tr><td>ThermoStat plus</td><td>Eppendorff</td><td>22670204</td><td>Use as a incubator for 95 &amp;#176;C , don&#039;t need to use the heater</td></tr><tr><td>Toothpick</td><td>Bunzl Plc</td><td>75200815</td><td>Any round wooden toothpicks can be used - quality wood</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R/5417C</td><td>Eppendorff</td><td>22621807</td><td>This model was discontinued. But another newer model can be used</td></tr><tr><td>Microspatula</td><td>Fisher</td><td>SDI28540115</td><td>Autoclaved before use each time.</td></tr></tbody></table>

accurate and phenol free dna sexing of day 30 porcine embryos by pcr

돼지의 태아 프로그래밍에 대한 연구는 배아 또는 태아의 성별이 발달 결과에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 배아의 성을 확인하는 능력은 특히 초기 개발에 대한 많은 실험이 필요하다. 본 프로토콜은 PCR에 사용할 돼지 게놈 DNA의 저렴하고 신속하고 비 독성 제제를 보여준다. 하루 30 배아는 인도적 본 프로토콜에 대한 기관 동물 정책 및 복지위원회가 설정 한 가이드 라인에 따라 수집해야합니다. 이 PCR 기반 sexing 기술에 대한 전체 배아의 제조는 단순히 미리 냉각 막자 사발을 사용하여 미세한 분말로 분쇄 냉동 배아를 포함한다. PCR 품질 DNA는 알칼리 용해 시약 뜨거운 인큐베이션함으로써 배아 분말 소량 방출된다. 그 다음, DNA 용액을 중화 완충액과 혼합하고 PCR에 직접 사용했다. 두 프라이머 쌍은 detec하기 위해 생성된다높은 정밀도와 특이 X- 염색체의 Y- 염색체 (SRY)와 ZFX 영역의 영역을 결정 t 특정 성. 동일한 프로토콜 일 이전 다른 신장 배아 (주 14 주 10)에 적용 할 수있다 (30)의 자동화 및 높은 것이 가능하게 배아 다수 선별 경우 이러한 프로토콜은 96 솟아 플레이트로 수행 될 수있다 처리량 섹스 입력합니다.

PCR에 의한 DNA 345 스크리닝 용 해물로부터 성 결정의 대표적인 결과가도 7에 도시되고 표 1에 요약 하였다. 도 7에서 알 수있는 바와 같이, 65 ℃에서 프라이머의 어닐링 온도가 다른 시료 중이 PCR 프로토콜에 유사한 강도와 프리디 케이드 앰플 리콘 크기를 생성 (도 5)의 최적의...

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Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

PCR에 의한 날 (30) 돼지 배아의 정확하고 페놀 무료 DNA Sexing

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K 조회수.  University of Alberta. This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

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Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

연구

발생학

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

의 사체 프로파일 링<em&gt; 생체</em2 색의 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여&gt; 제작 소 착상 전 배아

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

유전학

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented in human embryos. Preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) is a genetic test that significantly improves reproductive outcomes by detecting chromosomal abnormalities of embryos. Next-generation sequencing (NGS) provides a high-throughput and cost-effective approach for genetic analysis and has shown clinical applicability in PGT-A. Here, we present a rapid and low-cost semiconductor sequencing-based NGS method for screening of aneuploidy in embryos. The first step of the workflow is whole genome amplification (WGA) of the biopsied embryo specimen, followed by construction of sequencing library, and subsequent sequencing on the semiconductor sequencing system. Generally, for a PGT-A application, 24 samples can be loaded and sequenced on each chip generating 60&#8722;80 million reads at an average read length of 150 base pairs. The method provides a refined protocol for performing template amplification and enrichment of sequencing library, making the PGT-A detection reproducible, high-throughput, cost-efficient, and timesaving. The running time of this semiconductor sequencer is only 2&#8722;4 hours, shortening the turnaround time from receiving samples to issuing reports into 5 days. All these advantages make this assay an ideal method to detect chromosomal aneuploidies from embryos and thus, facilitate its wide application in PGT-A.

Here, we introduce a semiconductor sequencing method for preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) with the advantages of short turnaround time, low cost, and high throughput.

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to laboratories for studies to further our understanding of marine mammal reproduction. Heterologous IVF, a replacement for homologous IVF, could provide a means to test the sperm fertility potential; to study gamete physiology and early embryo development; and to avoid the use of valuable dolphin oocytes, which are difficult to obtain. Here, we present protocols that have been successfully used to collect and cryopreserve dolphin spermatozoa. The collection of semen is performed by manual stimulation on trained dolphins. Cryopreservation is accomplished using a TRIS egg-yolk based extender with glycerol. In addition, we present a protocol that describes heterologous IVF using dolphin spermatozoa and bovine oocytes and that verifies the hybrid nature of the resulting embryo using PCR. Heterologous fertilization raises questions on fertilization and can be used as a tool to study gamete physiology and early embryo development. In addition, the success of heterologous IVF demonstrates the potential of this technique to test dolphin sperm fertilizing capacity, which is worth further examination.

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Here, we present protocols that have been successfully used for dolphin spermatozoa collection, cryopreservation, and heterologous IVF performance using bovine oocytes.

병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage that forms the placenta. This method, however, requires specialized skills, is invasive, and suffers from false positives and negatives because the chromosome numbers in the TE and the inner cell mass (ICM), which develops into the fetus, are not always the same. NICS, a technology requiring sequencing of DNA that released into the culture medium from both TE and ICM, may offer a way out to these problems but has previously been shown to have limited efficacy. The present study reports the full protocol of NICS, which includes culture medium sampling methods, whole genome amplification (WGA) and library preparation, and NGS data analysis by analysis software. Considering the different cryopreservation times in different embryo laboratories, embryologists have two methods for collecting embryo culture medium that can be selected according to the actual conditions of the IVF laboratory.

The present study reports a protocol for chromosome screening of human embryos that uses spent culture medium, which avoids embryo biopsy and enables chromosome ploidy identification using NGS. The present article presents the detailed procedure, including the preparation of culture medium, whole genome amplification (WGA), next-generation sequencing (NGS) library preparation, and data analysis.

사용된 배양 배지를 사용한 인간 착상 전 배아의 염색체 스크리닝: 샘플 수집 및 염색체 배합 분석

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Single-Cell Sequencing을 위한 Gastrulating Mouse embryo의 분리 및 유전형 분석

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

저자 스포트라이트: 단일 세포 분해능에서 계통 특이적 돌연변이 배아를 분석하기 위한 파이프라인

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

PCR에 의한 날 (30) 돼지 배아의 정확하고 페놀 무료 DNA Sexing

요약

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단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

의 사체 프로파일 링

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정

사용된 배양 배지를 사용한 인간 착상 전 배아의 염색체 스크리닝: 샘플 수집 및 염색체 배합 분석

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

PCR에 의한 날 (30) 돼지 배아의 정확하고 페놀 무료 DNA Sexing

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단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

의 사체 프로파일 링

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정

사용된 배양 배지를 사용한 인간 착상 전 배아의 염색체 스크리닝: 샘플 수집 및 염색체 배합 분석

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기