저자는 또한 제조 및 cDNA를과의 shRNA 벡터를 neogenin의 구조를 공유 조지아 건강 과학 대학에서 박사 시옹의 그룹을 인정하고 싶습니다. 본 연구는 한국 연구 재단의 자금을 지원 기초 과학 연구 프로그램 (2013R1A1A4A01012572)에서 보조금과 삼육 대학에서 연구비에 의해 지원되었다.

참고 : 동물 사육과 염려에 관한 모든 절차는 삼육 대학교, 서울, 대한민국의 IACUC 규정에 따라 실시 하였다. 1. 과배란, 육성 난관 격리 <ol><li> 다음과 같은 조건에서 근친 C57BL / 6 마​​우스 유지 : 22 ± 3 ° C ~ 60 % 습도, 12 시간 빛 / 어둠주기, 물과 음식 광고 무제한입니다. </li><li> 0.1 ml의에서 5 IU 임신 암말 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)의 복강 내 주사에 의해 3-5주 된 여성 생쥐의 과배란을 유도 / 머리는 0.1 ml의에서 5 IU 인간 융모 성 성선 자극 호르몬의 복강 내 주사 (hCG의)에 의해 48 시간 이상 이어 /머리. </li><li> 즉시 hCG의 주입에 따라, 하룻밤 같은 케이지에서 그들을 유지하여 동일한 균주의 성적으로 성숙한 남성으로 과배란 유도 여성을 짝. </li><li> 다음날 아침, 여성 생식기의 정합 플러그 또는 질 플러그의 존재에 의해 성공적인 짝짓기를 확인한다. </li><li> 임신 여성 쥐를 희생CO에 의해 2 중독은 hCG의 주입 후 자궁 전위 18 ~ 20 시간 뒤에. </li><li> 피부와 다음 미세 가위로 복막 층을 절단하여 복강을 엽니 다. </li><li> 미세 집게와 자궁 뿔을 들고 체강에서 조심스럽게 자궁, 난관, 난소, 지방 패드를 멀리 당기십시오. </li><li> 난관 미세 가위로 난소 사이의 영역을 잘라. 첨부 된 자궁의 상부 중 적어도 1cm를 떠나, 포셉 위치를 조정하고 난관 근처의 자궁을 잘라. </li><li> 실온에서 M16 매체를 포함하는 35mm 페트리 접시에 oviductal 팽대부 전송. 같은 접시에 여러 생쥐의 난관을 풀. </li><li> 배아의 검색을위한 실체 현미경 아래에 접시를 놓습니다. </li></ol> 2. 검색 2- 전핵의 배양 (2-PN) 배아 <ol><li> , 30 또는 32 G 피하 주사 바늘의 끝을 잘라 무딘 끝으로 갈기, 그리고 플러싱 바늘로 사용합니다. </li><li> 용도미세 집게는 플러싱 바늘에 난관의 끝을 밀어합니다. 조심스럽게 제자리에 고정 할 수있는 접시의 바닥에 대한 플러싱 바늘의 끝을 누릅니다. M16 매체의 0.1 ㎖를 페트리 접시에 2 PN 배아를 분리합니다 ~와 난관을 플래시합니다. </li><li> 멸균 유리 피펫을 사용하여 새로운 배양 접시로를 전송할 실체 현미경 아래에서 플러시 M16 매체에서 운 질량을 주변과 함께 2-PN의 배아를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 50-10 분 동안 37 ° C에서 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)에서 0.1 ~ 0.5 %의 히알루로 1.0 ㎖의 효소 적 절단에 의해 2 PN 배아에서 운 세포 해리. </li><li> 부드럽게 유리 피펫 및 난구 세포의 물리적 제거와 피펫 팅에 의해 배아를 박탈하다. </li><li> 배아 당 신선한 인산염 완충 식염수 (PBS)의 30 ~ 50 ml의 무 결함 배아 세 번 씻으십시오. </li><li> 10 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA, Fract 보충 M16 미디어에서 35mm 플라스틱 페트리 접시에 배아를 품어이하 4 시간 후에 일반적으로 마이크로 인젝션이 이루어질 때까지 가습 인큐베이터에서 5 % CO 2, 37 ℃에서 이온 V). </li></ol> 3. 배아 역전사 (RT)와 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) <ol><li> 포배기까지의 각 단계에서 적어도 10 배아 모아서 역전사 효소, RNA 분해 효소 억제제, 올리고 DT 프라이머 랜덤 6mers,의 dNTP 혼합물을 함유 효소 미리 혼합액 역방향 배 4.0 μL 그들을 수영장,에 반응 완충액 PCR 튜브. </li><li> W. 95 ° C에서 5 분 동안 배양 한 다음, 1 시간 동안 42 ° C에서 즉시 RT 반응을 개시 (200)에서 30 초 동안 풀링 된 배아를 20 ㎕의 총 부피의 RNase가없는 증류수 H 2 O를 첨가하고 초음파 처리. </li><li> 생성 된 cDNA 솔루션의 각 5.0 μl를 들어, neogenin을위한 프라이머와 일반 PCR 증폭을 실시, CDX2는, Sox2이는 Tead4는, Nanog를이 Oct3 / 4, β - 굴지 (프라이머 서열은 표에 주어진 </strong&gt; 1. PCR은 95 ℃에서 15 초 동안 배양 40 사이클 구성, (표 1) 소둔 온도에서 30 초, 72 ℃에서 30 초. </li><li> 2 % 아가 로스 겔상에서 전기 영동에 의해 분리 된 PCR 제품, 에티 디움 브로마이드로 염색 한 후, UV 광 하에서 겔을 시각화. </li><li> β - 굴지 수준에 대한 표적 유전자의 발현을 정상화. </li></ol> 태아의 면역 세포 화학 (4) <ol><li> PBS에 0.​​01 % BSA를 함유하는 짧은 세척하여 세 번을 실온에서 30 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드와 각 단계에서 배아를 수정. </li><li> 10 분 동안 실온에서 0.1 % 트윈 20, 0.1 % 트리톤-100을 함유하는 PBS 1.0 ㎖에 10 배아를 배양하여 Permeabilize 하시려면 세포막. </li><li> 1.0 ml의 PBS에 투과성이 배아 부화 비특이적 블록을 실온에서 30 분 동안 10 % 정상 염소 혈청. </li><li> 차단 된 배아의 재치를 품어1에서 시간 토끼 안티 neogenin 항체 : PBS 100 희석 밤새 4 ° C에서 0.1 % BSA를 포함. </li><li> PBS의 방울에서 30 초마다 세 세척 한 후, 1 알렉사 488 결합 염소 항 - 토끼 IgG의 또는 알렉사 568 결합 염소 항 - 토끼 IgG의 하나와 배아를 배양 : PBS / BSA 용액 500 희석 4 ° C에서 하룻밤 . </li><li> 액틴 필라멘트를 시각화하고 실온에서 1 시간 동안 PBS에 1 μg의 / ㎖의 팔로이 딘에 배아를 배양한다. </li><li> PBS는 실온에서 5 분간 1 μg의 / ㎖의 DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌, 다이 하이드로 클로라이드)를 함유하는 5 mL를 첨가하여 핵을 염색. </li><li> 워시는 PBS로 세 번 짧게 배아. </li><li> 유리 슬라이드에 배아를 전송 및 미네랄 오일 방울을 커버. </li><li> 적절한 파장의 여기와 공 초점 현미경으로 1000 배 배율에서 이미지를 가져 가라. </li></ol> Neogenin-RFP 및 Neogenin-siRNA를 GFP 플라스미드 5. 준비 <ol><li> 보결cDNA를 빨간색 형광 단백질 (RFP), 벡터를 함유 neogenin 플래그 - RFP의 결과로 마우스 neogenin을 인코딩 복제. </li><li> 에메랄드 녹색 형광 단백질 (EmGFP), 벡터를 함유 pcDNA 벡터 - EmGFP-은 miR-neogenin의 결과로 neogenin 대상으로 작은 헤어핀 RNA를 서브 클로닝 (그림 1). </li><li> neogenin 플래그 - RFP 및 pcDNA 벡터 - EmGFP-은 miR-neogenin 플라스미드를 모두 증폭하고 기존의 방법으로 그들을 정화. </li><li> 플라스미드의 최종 농도를 조정에 ~ 멸균 트리스 - EDTA (TE) 버퍼 / ㎖ 1.0 μg의. </li></ol> 2-PN 배아에 플라스미드 6. 미세 주입 <ol><li> 신선한 M16 매체와 짧게 한 번 무 결함이-PN의 배아를 씻으십시오. </li><li> 전핵의 관찰이 가능하도록 테이블 탑 원심 분리기에서 1,000 × g으로 10 분간 2 PN 배아를 원심 분리기. </li><li> additi 5 % CO 2에서 37 ° C에서 미네랄 오일 아래 M16 배아 당 매체의 20 내지 30 μL의 미세 드롭 배아 부화도 그러 1-2 시간. </li><li> 붕규산 유리 모세관 튜브를 당겨 주입 피펫을 들고 피펫 제조 (OD = 1.2 mm를, ID = 0.94 mm) 기계 풀러와 함께. </li><li> microgrinder 및 microforger를 사용 무딘 팁과 &lt;500 μm의 팁 길이와 1 ~ 2 μm의 팁 내경 연마 구멍을 가지고 주입 피펫을 제조. </li><li> 그들은 20 ㎛, 내경 100 ㎛, 외경 무딘 팁 연마 개구를 갖도록 피펫 들고 제조. </li><li> 1.0 μg의 / μL에서 플라스미드 솔루션의 충분한 양의로드 주입 피펫 (&gt; 200 NL). </li><li> Microinject ~ 전동 micromanipulator에 부착 된 마이크로 인젝터를 사용 전핵 중 하나에 각각 2 PN 배아 용 플라스미드 용액 10 PL; 이 과정에서 보유 피펫 부압을 적용하여 위치 배아를 유지한다. </li><li> 미세 주입 한 후, 난 신선한 M16 매체와 2 PN 배아 3 회 세척1 분마다 시간보다 ESS. </li><li> 배양기 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일 방울에 의해 덮여 플라스틱 배양 접시에 신선한 M16 매체의 드롭 2 PN 배아. </li><li> 미분 간섭 대비에서 24 시간 간격 (DIC) 200X 배율에서 거꾸로 현미경에서 배아를 관찰한다. </li></ol>

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저자는 공개 경쟁 금융 이익을 더이 없습니다.

본 프로토콜에서, 우리는 마우스 배아 초기의 세포 분화에 neogenin의 역할을 탐구하는 2-PN 마우스 배아에 유전 물질의 미세 주사의 새로운 방법, cDNA를 또는 shRNA를 하나를 보여줍니다. 착상 전 배아의 유전자 변형은 예를 들어 대한 기본 분자 메커니즘, 첫 번째 셀의 혈통 결정에 대한 주요 정보를 폭로에서 강력한 기술이다. 유전 적 변형은 유전자의 기능을 확인하는 가장 일반적으로 사용되는 방?...

착상 전 배아 발달이 상실 배와 배반포로 한 세포 단계에서, 여러 가지 구별되는 단계로 나눌 수있다. 많은 증거가 극성 위치 단서가 trophectoderm (TE) 및 내부 세포괴 (ICM)에 이른 세포 운명 결정에 중요한 역할을 제안합니다. 그러나, 셀룰러 신호로 형질 도입 방법을 단서의 특성 및 생리적 컨텍스트는 이러한 신호들은 알려지지 않은 세포 계통의 분화를 개시 할 수있다. 이 분화 된 세포는 태반 1-3의 배아 적절한 형성과 성장에 필요한 특성 구조와 기능에 걸릴 시작, 전문화를 받다. 착상 전 배아의 siRNA 또는 표적 cDNA의 변성 등의 유전 재료의 직접적인 주사에 의한 조작에 특히 순종하며, 따라서 특정 표적 분자를 연구하는데 이용 될 수있다. 유전이 성장 이해가척추 동물 배아의 분석은 배아 발달 4에 대한 우리의 이해를 발전에 매우 중요합니다. 적시 문맥 배아 내로 야생형 유전자 또는 돌연변이 형태의 정밀한 도입 이득 - 또는 기능 상실 유전자 크게 발달 조절 유전자에 대한 연구를 촉진했다 수행한다. Loss- 및 이득의 기능 개별 이른 비 포유 동물과 포유 동물의 배아에 유전 물질의 미세 주입을 통해 이유로 인해 그들의 큰 크기와 큰 감수성 (5)의 상대적으로 간단하다. 마이크로 인젝션은 전형적으로 비 - 바이러스 성 벡터를 사용하여 수행된다. 특별한 장점은 바이러스 벡터 및 유전자 위에 비 바이러스 성 벡터를 사용의 용이성이 고려되어왔다. 마우스 배아 급격한 loss- 또는 기능 획득 발현 시스템은 우리 해부 척추 동물 배아 -6,7- 유전자 기능을 이해할 수 있도록 개발되어왔다. 배아의 형광 라벨이 크게 MICR의 선택을 용이하게 할oinjected 또는 유 전적으로 조작 된 배아를 동시에 간접 형광 강도 (8)에 기초하여 마이크로 인젝션의 siRNA 또는 cDNA의 발현 수준을 정량 할 수있는 수단을 부여. 이 라벨 형광 단백질 cDNA를, GFP 또는 RFP를 달성하기 위해 공동 주입 융합 구조물 또는 별도로 하나 같다. GFP 또는 RFP의 형광 강도는 loss- 보장 또는 기능 획득 이루어진 것으로하기의 siRNA 또는 외부 DNA의 발현의 정도를 보여준다. 여기, 우리는 우리가 착상 마우스 배아의 초기 세포 분화에 중요한 세포 외 신호를 중계하는 수용체로 neogenin 식별 할 수 loss- 이득 외 기능 기술에 대한 미세 조작 프로토콜을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>M16 medium,</td><td>Gibco BRL (Grand Island, NY)</td><td>M7292 LOT# 11A832</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum,&amp;nbsp;</td><td>Dako (Glostrup, Denmark)</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Folligon, Intervet, Holland</td><td>G4877-1000IU LOT#SLBD0719V</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CG5-1VL LOT# SLBC6783V</td><td></td></tr><tr><td>human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>(Intervet, Holland)</td><td>(invitrogen , 15596-026)</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;reg; III Reverse Transcriptase</td><td>lifetechnologies</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>PCR pre mixture</td><td>&amp;nbsp;(Bioneer, Daejon, S. Korea)</td><td>GenDEPOT , A0224-050</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (molecular grade)</td><td>BioRad</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td><td>Affymetrix USA</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>polyclonal rabbit anti-neogenin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology, US</td><td>SC-15337</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A-11094</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 555 Phalloidin</td><td>Molecular Probes (Invitrogen, USA)</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>3720-RG</td><td></td></tr><tr><td>all plasmid constructs&amp;nbsp;</td><td>Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA).</td><td></td><td>for the present studies were kindly provided by&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Neon&amp;reg;&amp;nbsp; Transfection System</td><td>lifetech</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscrope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Micromainpulation system with Nikon</td><td>Nikon</td><td>Narishige ONM-1</td><td></td></tr><tr><td>Micro Injector</td><td>Nikon Narishige</td><td>GASTIGHT #1750</td><td></td></tr><tr><td>Holder</td><td>Nikon Narishige</td><td>Narishige IM 16</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Nikon Narishige</td><td>Narishige MF-900</td><td></td></tr><tr><td>grinder</td><td>Narishige</td><td>EG400</td><td></td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter Instrumnet company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Scientific Forma</td><td>EW-39320-16</td><td></td></tr><tr><td>Veriti&amp;reg; 384-Well Thermal Cycler&amp;nbsp;</td><td>lifetechnologies</td><td>4388444</td><td></td></tr></tbody></table>

loss- and gain-of-function approach to investigate early cell fate determinants in preimplantation mouse embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

우리는 neogenin이 일시적으로 초기 2 셀 단계에서와 같은 지속적인 초기 상실 배까지 등장하지만 후반 상실 배와 배반포 단계 (그림 2A)에서 결핍되고, 착상 마우스 배아의 초기 발달 단계에서 표현된다 발견했다. 또한 neogenin의 공간 분포는 주로 외부 세포로 제한 하였다. RT-PCR 분석의 결과는 4- 세포 단계 고점하지만 완전히 이상 (도 2b)를 16 세포 단...

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Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

loss-gain-function-approach-to-investigate-early-cell-fate

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

연구

발생학

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

유전학

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients and waste between the mother and fetus and the production and delivery of growth factors and hormones. Placental genetic manipulations in mice are critical for understanding the placenta's specific role in prenatal development. Placental-specific Cre-expressing transgenic mice have varying effectiveness, and other methods for placental gene manipulation can be useful alternatives. This paper describes a technique to directly alter placental gene expression using CRISPR gene manipulation, which can be used to modify the expression of targeted genes. Using a relatively advanced surgical approach, pregnant dams undergo a laparotomy on embryonic day 12.5 (E12.5), and a CRISPR plasmid is delivered by a glass micropipette into the individual placentas. The plasmid is immediately electroporated after each injection. After dam recovery, the placentas and embryos can continue development until assessment at a later time point. The evaluation of the placenta and offspring after the use of this technique can determine the role of time-specific placental function in development. This type of manipulation will allow for a better understanding of how placental genetics and function impact fetal growth and development in multiple disease contexts.

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Here we describe a time-specific method to effectively manipulate critical developmental pathways in the mouse placenta in vivo. This is performed through the injection and electroporation of CRISPR plasmids into the placentas of pregnant dams on embryonic day 12.5.

Mouse In Vivo Placental 표적 CRISPR 조작

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Single-Cell Sequencing을 위한 Gastrulating Mouse embryo의 분리 및 유전형 분석

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

저자 스포트라이트: 단일 세포 분해능에서 계통 특이적 돌연변이 배아를 분석하기 위한 파이프라인

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

요약

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이 비디오의 챕터

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

Mouse In Vivo Placental 표적 CRISPR 조작

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

요약

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초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

Mouse In Vivo Placental 표적 CRISPR 조작

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기