Gli autori vorrebbero riconoscere la cooperazione e contributi finanziari della seguente agenzia di finanziamento della ricerca: Alberta bestiame e della carne Agenzia Ltd, CRC carne di maiale, carne di maiale Alberta, Hypor A Hendrix Genetics Società e NSERC CRSNG.

In accordo con il Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali e con l&#39;approvazione della Politica degli animali Facoltà e del Comitato Welfare - Bestiame della University of Alberta, scrofe gravide sono stati sacrificati da personale addestrato a circa Giorno 30 di gravidanza e gli embrioni sono stati raccolti. Utilizzare guanti da esplorazione in qualsiasi momento durante le procedure. 1. Raccolta e conservazione del campione del campione <ol><li> Euthanize scrofa con proiettile captivo seguito da dissanguamento. Indossare guanti da esplorazione per raccogliere i tratti riproduttivi e embrioni da ogni scrofa eutanasia. Nota: raccolta rapida dei campioni e degli embrioni di trasferimento di ghiaccio secco o azoto liquido si tradurrà in tessuti di qualità più elevati per altre opere molecolari come microarray e qPCR. </li><li> Sezionare l&#39;utero e separare delicatamente tutti gli embrioni all&#39;interno delle loro membrane placentari extraembrionali dalla sottostante parete uterina 21. Assicurarsi che non vi è alcuna contaminazione dei tessuti materni. </li><li> Rilunghezza del cavo e peso di tutti gli embrioni vitali prima del congelamento. </li><li> Raccogliere ogni singolo embrione e immediatamente avvolgerlo in un foglio di alluminio prima di scatto congelamento con azoto liquido. </li><li> Trasferire gli embrioni congelati da azoto liquido direttamente a un -80 ° C freezer. </li></ol> 2. Gli embrioni Grinding <ol><li> Etichettare tutte le provette dei campioni (15 ml) con l&#39;ID campione necessaria per il numero di campioni da analizzare. </li><li> Riempire contenitore termico con ghiaccio secco per mezzo pieno e inserire il tubo pre-etichettato campione nel ghiaccio secco. </li><li> Indossare guanti invernali con un altro paio di guanti da esplorazione sulla parte superiore per il trasferimento dei mortai e pestelli pre-refrigerati da -80 ° C freezer per asciugare contenitore del ghiaccio. </li><li> Posizionare l&#39;embrione congelato all&#39;interno del mortaio sul ghiaccio secco. </li><li> Versare azoto liquido sufficiente a coprire l&#39;embrione e macinare con il pestello in una polvere finissima. </li><li> Trasferire la polvere embrione di una provetta di pre-marcato con un MICRospatula (Figura 1) e posizionare il tubo in un congelatore C -80 °. </li><li> Utilizzare un mortaio e pestello pulito pre-raffreddata per ogni embrione e cambiare i guanti da esplorazione dopo la rettifica ogni embrione per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni. </li></ol> 3. Il DNA genomico Preparazione Utilizzo Modificato idrossido di sodio Metodo <ol><li> Label tutte le provette da microcentrifuga (1,5 ml) necessari per il numero di campioni da analizzare. </li><li> Trasferire le provette per campioni contenenti polvere embrione dal -80 ° C freezer a un contenitore con ghiaccio secco prima di iniziare. </li><li> Pipetta 180 ml di 50 mM NaOH (idrossido di sodio) in ogni provetta pre-etichettati microcentrifuga. </li><li> Attivazione di un incubatore e pre-riscaldamento a 95 ° C. </li><li> Usare uno stuzzicadenti per trasferire la giusta quantità di polvere dell&#39;embrione (5-10 mg) (Figura 2) dal tubo campione in una provetta pre-etichettato contenente la soluzione 50 mM NaOH. </li><li> Pull up stesso stecchino lentamente per visualizzare il lisato DNA come un appiccicoso, appiccicoso, sostanza bianca trasparente simile (figura 3). </li><li> Trasferire le provette da microcentrifuga con lisato DNA per l&#39;incubatore pre-riscaldato a 95 ° C per cinque minuti. Trasferire immediatamente il tubo di una scatola di polistirolo pieno di ghiaccio. </li><li> Aggiungere 20 ml di 1 M Tris-HCl direttamente nella provetta e mescolare picchiettando delicatamente il tubo. Utilizzare carta pH per assicurare il pH è di circa 8,0 (Figura 4) prima della centrifugazione. Nota: Quando si tratta di un gran numero di preparazioni del campione, è accettabile per raccogliere in modo casuale alcuni campioni per verificare il pH. </li><li> Centrifugare la provetta con il lisato DNA a 2.000 xg in una microcentrifuga per due minuti a temperatura ambiente per rimuovere i residui di tessuto non disciolto. </li><li> Trasferimento 150 ml di surnatante superiore chiaro in un nuovo tubo o 96 pozzetti. Nota: Il lisato DNA chiaro è pronto per l&#39;uso come un modello in PCreazione R ed è stabile a 4 ° C per due settimane, oppure può essere conservato a -20 ° C per un anno. </li></ol> 4. Progettare sesso-specifici primer PCR <ol><li> Ottenere i numeri di adesione per regione determinare il sesso dei suini Y (SRY) (NM_214452.3) e e geni delle proteine ​​zinc finger X-linked (ZFX) (XM_005673501.1) dal sito NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /. </li><li> Copia e incolla questi numeri di adesione NCBI ad uno strumento di progettazione Primer on-line. Nota: Le migliori informazioni primer tra cui lunghezza, Tm e GC% e dimensioni del prodotto di PCR (bp) verrà generato sullo schermo del computer (Figura 5). </li><li> Convalida la specificità di questi primer utilizzando il programma nucleotide Blast (Blastn) contro la corrente suina banca dati genomica 104 per garantire queste sequenze si trovano solo su X e cromosoma Y rispettivamente SRY e ZFX (Figura 6). </li></ol> 5. Il DNA genomico PCR Direttamente dal DNA lisati <ol><li> Usosolo 1 ml di lisato DNA come modello per un 15 microlitri reazione PCR. Nota: Un metodo di screening ad alto rendimento per piastre a 96 pozzetti PCR può essere eseguita in modo simile usando una pipetta multicanale. </li><li> Effettuare le seguenti operazioni solo per la prima PCR: preparare un tubo di PCR per il modello senza controllo negativo e due tubi aggiuntivi per controlli positivi con l&#39;aggiunta di 1 ml (0,5 ng) di commercialmente ottenuto sesso noto DNA genomico suina. In seguito, su un campione dalla ultima analisi sessaggio successo come controllo positivo e girare con la nuova reazione PCR per la determinazione del sesso. </li><li> Utilizzare qualsiasi HotStart Ready Mix PCR enzima e preparare una master mix con primer aggiungendo e nucleasi acqua libera a seconda del numero totale di reazioni PCR. Aggiungere 1 ml di lisato DNA in un tubo di PCR preesistente con 14 microlitri della master mix PCR. Aggiungere primer tale che la concentrazione finale dei primer da due geni specifici per il sesso è di 0,3 micron di totale di 15 microlitri PCR reaction. </li><li> Impostare il seguente programma PCR in un termociclatore: 95 ° C per 3 min, 35 cicli ciascuno con una fusione passo 20 sec a 98 ° C, seguita da una fase di ricottura 15 sec a 65 ° C, seguita da una fase di allungamento 15 sec a 72 ° C. Nella fase finale, incubare le reazioni per 1 min a 72 ° C e continuare ad incubare a 4 ° C fino alla rimozione del tubo PCR per la verifica elettroforesi su gel per determinare il sesso. Nota: condizioni di PCR e l&#39;ottimizzazione sono secondo il manuale del kit PCR indicato nella tabella materiali. </li><li> Aggiungere la quantità appropriata di serra SYBR fluorescente gel DNA macchia non tossici durante la preparazione di un gel di agarosio al 2% TBE. Nota: il bromuro di etidio può essere sostituito per macchia fluorescente serra se non è disponibile. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di tintura di carico (10x) nel tubo PCR e mescolare bene pipettando il tampone di reazione PCR su e giù. </li><li> Caricare 10 ml di campione nel pozzetto e run gel di agarosio con impostazioni di tensione appropriate (apparato gel piccola a 100 V, apparecchi gel 96 pozzetti a 150 V fino banda colorante corre metà del gel). </li><li> Osservare e regolare le bande intensità sotto la luce fluorescente impostazione utilizzando uno scanner laser e catturare un&#39;immagine del gel. Nota: imager gel comune può essere sostituito per il gel di bromuro di etidio. </li><li> Determinare il sesso degli embrioni di suini, identificando gli embrioni con una banda come una femmina e due bande come un maschio (Figura 7). </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La maggior parte dei protocolli esistenti relativi alla suina embrioni DNA tipizzazione sesso sono adatti solo per la fase precoce fase di pre-impianto 15,16. Abbiamo sviluppato con successo un protocollo adatto per lo screening degli embrioni suini durante la tarda gestazione. Sulla base di studi con simili fasi di sviluppo di embrioni da studi precedenti 6,18, il presente protocollo è considerato più sicuro ea basso costo. Questo protocollo è adatto anche per un gr...

Il maiale domestico è diventato un soggetto di ricerca fondamentale nello sviluppo, la genetica e l&#39;alimentazione in entrambi i settori umani e del bestiame. Il potenziale dei suini come modelli biomedici per la ricerca umana può essere attribuito alla loro somiglianze fisiologiche. Nel bestiame, la manipolazione del rapporto tra i sessi può migliorare l&#39;efficacia di selezione e miglioramento genetico programmi 1. Sexing singoli embrioni è uno strumento fondamentale utilizzato in molte indagini sperimentali inclusi ma non limitati al genotipo, epigenetica e X inattivazione di dimorfismo sessuale durante lo sviluppo embrionale precoce 2. Studi nei topi suggeriscono che la dieta materna e altri fattori possono causare squilibrio di genere 3. Nei suini, cause di rapporto tra i sessi squilibrio includono razza paterna 4, la capacità uterina 5, e la condizione metabolica della scrofa 6. Dal momento che le differenze osservate negli embrioni e cucciolate possono essere influenzati da séxual dimorfismo, i ricercatori devono essere consapevoli del sesso dell&#39;embrione e rapporti sessuali prima di trarre conclusioni per quanto riguarda la loro ricerca. Lo sviluppo di strumenti e protocolli efficienti per sessaggio degli embrioni di maiale al giorno 30 di sviluppo sarà discusso qui. Vari metodi di tipizzazione del sesso sono stati sviluppati per studi di genetica in organismi modello e bestiame. In particolare nel bestiame, individuando maschili e femminili embrioni precoci è una pratica molto comune per migliorare la selezione genetica per programmi di allevamento. I primi embrioni cariotipo nel maiale con Giemsa 7 o l&#39;intensa fluorescenza 8,9 tecniche sono state utilizzate per la tipizzazione del sesso. Tuttavia, questi metodi sono molto tempo e non è adatto per lo screening gran numero di embrioni modo rapido e preciso. Il metodo di tipizzazione sesso più efficace è l&#39;amplificazione del DNA mediante una stabile al calore DNA polimerasi e una coppia di primers. sessaggio DNA mediante PCR è più specifico, rapido e sensibile, oolo che richiede una quantità minima di materiali cellulari. Il primo embrione sessaggio PCR-based è stata eseguita su esseri umani 10, e poi in topi 11, bovini, bufali 12 13 e pecore 14 embrioni pre-impianto. Nel maiale, il più antico metodo di tipizzazione del DNA sesso è stato stabilito per gli embrioni pre-impianto attraverso una singola coppia di cromosoma Y primer DNA specifico 15. Tuttavia, i primer PCR più comuni per la determinazione del sesso sono stati selezionati dal cromosoma Y del maschio specifico gene SRY 16 e la regione discriminativa non sesso di un gene zinc-finger posti sui lati X e Y cromosoma 17. Successivamente, questi primer sono stati applicati per determinare il sesso del giorno 30 embrioni in questo studio con una migliore specificità dei primers per rilevare solo il cromosoma X di un gene zinc-finger. DNA genomico da suini embrioni pre-impianto può essere estratto esponendo una blastocisti intatto di tamponare con proteinase K 16 o prendendo una biopsia di alcune cellule dal singolo scissione precoce embrioni 15 e li utilizzano per la PCR diretta. Tuttavia, rilascio di DNA da sangue suino, capelli, tessuti o un grande conceptus sopra alcuni centimetri di dimensione non è effettivamente fatto usando il metodo di proteinasi K. Metodi di estrazione del DNA per questi materiali sono stati stabiliti utilizzando sia in termini di tempo protocolli di fenolo / cloroformio 6 o kit basati costoso colonna 18. Per evitare l&#39;uso di sostanze chimiche potenzialmente tossiche, vi è una tendenza a sviluppare economici, metodi di estrazione del DNA facile e senza fenolo. Questo tipo di protocollo per l&#39;isolamento di DNA genomico PCR qualità di topo 19 e 20 zebrafish tessuti è stata stabilita utilizzando idrossido di sodio calda e Tris (Hotshot). Questo studio fornisce un protocollo per ottenere DNA con modificati Hotshot e ridisegnato coppie di primer per PCR duplex sesso digitando direttamente dai lisati cellulari di Giorno 30 embrioni di suini conalta precisione.

<table><tbody><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit&amp;nbsp;</td><td>KAPABiosystems</td><td>KR0370</td><td>other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe</td></tr><tr><td>Pig female and male genomic DNA</td><td>Zyagen</td><td>GP-160-F1 &amp;amp; GP-160-M5</td><td>Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9500 laser scanner</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9969-43</td><td>other imaging system can be used</td></tr><tr><td>Free Soft Nitrile Examination Gloves</td><td>WWR</td><td>89038-270</td><td>any other examination glove can be used</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide, solid&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 359 -212</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean</td><td>Eppendorff</td><td>0030 108.051</td><td>heat resistant</td></tr><tr><td>ThermoStat plus</td><td>Eppendorff</td><td>22670204</td><td>Use as a incubator for 95 &amp;#176;C , don&#039;t need to use the heater</td></tr><tr><td>Toothpick</td><td>Bunzl Plc</td><td>75200815</td><td>Any round wooden toothpicks can be used - quality wood</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R/5417C</td><td>Eppendorff</td><td>22621807</td><td>This model was discontinued. But another newer model can be used</td></tr><tr><td>Microspatula</td><td>Fisher</td><td>SDI28540115</td><td>Autoclaved before use each time.</td></tr></tbody></table>

accurate and phenol free dna sexing of day 30 porcine embryos by pcr

La ricerca sulla programmazione prenatale nel maiale ha dimostrato che il sesso dell&#39;embrione in via di sviluppo o il feto può influenzare il risultato dello sviluppo. Pertanto, la capacità di determinare il sesso di un embrione è necessario in molti esperimenti particolarmente per quanto riguarda lo sviluppo iniziale. La presente protocollo dimostra una preparazione poco costoso, rapido e non tossica di maiale DNA genomico per l&#39;uso con PCR. Giorno 30 embrioni devono essere umanamente raccolti secondo le linee guida stabilite dal Istituzionale politica degli animali e dei Comitati Welfare per il presente protocollo. La preparazione di tutta embrione di questa tecnica sessaggio PCR comporta semplicemente macinazione l&#39;embrione congelato per una polvere fine con una malta pre-raffreddata e pestello. DNA PCR-qualità è rilasciato da una piccola quantità di polvere embrione applicando una incubazione caldo in un reagente di lisi alcalina. Successivamente, la soluzione di DNA viene miscelata con il tampone di neutralizzazione e utilizzato direttamente per PCR. Due coppie di primer sono generati al DATECdeterminato sesso t determinazione regione del cromosoma Y (SRY) e regione ZFX del cromosoma X con elevata precisione e specificità. Lo stesso protocollo può essere applicato ad altri embrioni di forma allungata (10 ° giorno al 14 ° giorno) più di giorno 30. Inoltre, questo protocollo può essere effettuato con piastre a 96 sgorgava quando lo screening di un gran numero di embrioni, rendendo così possibile per l&#39;automazione e di alta tipizzazione del sesso il throughput.

Un risultato rappresentativo della determinazione sesso da 345 DNA lisati di screening mediante PCR è mostrata in Figura 7 e riassunti nella Tabella 1. Come si vede in figura 7, la temperatura primer ricottura a 65 ° C è la condizione ottimale in questo protocollo PCR generare intensità simile e dimensioni ampliconi basa <...

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Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Preciso e fenolo DNA Sexing libera del Giorno 30 suina embrioni mediante PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

accurate-and-phenol-free-dna-sexing-of-day-30-porcine-embryos-by-pcr

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Views.  University of Alberta. This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Video: Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Trascrittoma Profiling di<em&gt; In-Vivo</em&gt; Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Genetica

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented in human embryos. Preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) is a genetic test that significantly improves reproductive outcomes by detecting chromosomal abnormalities of embryos. Next-generation sequencing (NGS) provides a high-throughput and cost-effective approach for genetic analysis and has shown clinical applicability in PGT-A. Here, we present a rapid and low-cost semiconductor sequencing-based NGS method for screening of aneuploidy in embryos. The first step of the workflow is whole genome amplification (WGA) of the biopsied embryo specimen, followed by construction of sequencing library, and subsequent sequencing on the semiconductor sequencing system. Generally, for a PGT-A application, 24 samples can be loaded and sequenced on each chip generating 60&#8722;80 million reads at an average read length of 150 base pairs. The method provides a refined protocol for performing template amplification and enrichment of sequencing library, making the PGT-A detection reproducible, high-throughput, cost-efficient, and timesaving. The running time of this semiconductor sequencer is only 2&#8722;4 hours, shortening the turnaround time from receiving samples to issuing reports into 5 days. All these advantages make this assay an ideal method to detect chromosomal aneuploidies from embryos and thus, facilitate its wide application in PGT-A.

Here, we introduce a semiconductor sequencing method for preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) with the advantages of short turnaround time, low cost, and high throughput.

Sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneuplodia

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to laboratories for studies to further our understanding of marine mammal reproduction. Heterologous IVF, a replacement for homologous IVF, could provide a means to test the sperm fertility potential; to study gamete physiology and early embryo development; and to avoid the use of valuable dolphin oocytes, which are difficult to obtain. Here, we present protocols that have been successfully used to collect and cryopreserve dolphin spermatozoa. The collection of semen is performed by manual stimulation on trained dolphins. Cryopreservation is accomplished using a TRIS egg-yolk based extender with glycerol. In addition, we present a protocol that describes heterologous IVF using dolphin spermatozoa and bovine oocytes and that verifies the hybrid nature of the resulting embryo using PCR. Heterologous fertilization raises questions on fertilization and can be used as a tool to study gamete physiology and early embryo development. In addition, the success of heterologous IVF demonstrates the potential of this technique to test dolphin sperm fertilizing capacity, which is worth further examination.

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Here, we present protocols that have been successfully used for dolphin spermatozoa collection, cryopreservation, and heterologous IVF performance using bovine oocytes.

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoi: raccolta, crioconservazione e fecondazione In Vitro eterologa

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage that forms the placenta. This method, however, requires specialized skills, is invasive, and suffers from false positives and negatives because the chromosome numbers in the TE and the inner cell mass (ICM), which develops into the fetus, are not always the same. NICS, a technology requiring sequencing of DNA that released into the culture medium from both TE and ICM, may offer a way out to these problems but has previously been shown to have limited efficacy. The present study reports the full protocol of NICS, which includes culture medium sampling methods, whole genome amplification (WGA) and library preparation, and NGS data analysis by analysis software. Considering the different cryopreservation times in different embryo laboratories, embryologists have two methods for collecting embryo culture medium that can be selected according to the actual conditions of the IVF laboratory.

The present study reports a protocol for chromosome screening of human embryos that uses spent culture medium, which avoids embryo biopsy and enables chromosome ploidy identification using NGS. The present article presents the detailed procedure, including the preparation of culture medium, whole genome amplification (WGA), next-generation sequencing (NGS) library preparation, and data analysis.

Screening cromosomico di embrioni umani preimpianto mediante l'utilizzo di terreno di coltura esausto: raccolta del campione e analisi della ploidia cromosomica

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Isolamento e genotipizzazione di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Autore in primo piano: una pipeline per analizzare embrioni mutanti specifici per il lignaggio con risoluzione di una singola cellula

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Preciso e fenolo DNA Sexing libera del Giorno 30 suina embrioni mediante PCR

Riepilogo

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Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione