Die Autoren möchten die Zusammenarbeit und die finanziellen Beiträge der folgenden Forschungsförderorganisation zu bestätigen: Alberta Vieh und Fleisch-Agentur GmbH, Schweinefleisch CRC, Alberta Pork, Hypor A Hendrix Genetics Company und NSERC CRSNG.

In Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care-Richtlinien und mit Zustimmung der Fakultät Tierpolitik und Wohlfahrtsausschuss - Viehzucht von der University of Alberta, wurden trächtige Sauen durch geschultes Personal bei ungefähr Tag eingeschläfert 30 der Schwangerschaft und Embryonen wurden gesammelt. Verwenden Untersuchungshandschuhen jederzeit im Verlauf der Verfahren. 1. Probenentnahme und Probenlagerung <ol><li> Euthanize Sau mit durch Ausbluten gefolgt Bolzen. Tragen Untersuchungshandschuhe, die Fortpflanzungsorgane und Embryonen aus jeder eingeschläfert Sau zu sammeln. Hinweis: Schnelle Entnahme von Proben und Transfer-Embryonen Eis oder flüssiger Stickstoff zum Trocknen in höherer Qualität Gewebe für andere molekulare Arbeiten wie Microarray und qPCR führen. </li><li> Präparieren Sie die Gebärmutter und sanft trennen alle Embryonen in ihren extraPlazentaMembranen von der darunter liegenden Gebärmutterwand 21. Achten Sie darauf, keine mütterliche Gewebe Kontamination ist. </li><li> ReKabellänge und Gewicht aller lebensfähigen Embryonen vor dem Einfrieren. </li><li> Sammeln Sie jeden einzelnen Embryo und sofort einpacken in einer Aluminiumfolie vor Schnapp mit flüssigem Stickstoff einfrieren. </li><li> Übertragen Sie die eingefrorenen Embryonen aus flüssigem Stickstoff direkt zu einem -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol> 2. Schleif Embryonen <ol><li> Beschriftet alle Probenröhrchen (15 ml) mit dem ID Probe für die Anzahl der erforderlichen Proben werden analysiert. </li><li> Füllen Thermobehälter mit Trockeneis zu halb voll und legen Sie die Pre-markierten Probenröhrchen in dem Trockeneis. </li><li> Wear Winterhandschuh mit einem anderen Paar von Untersuchungshandschuhe an der Spitze für die Übertragung der vorgekühlten Mörser und Stößel von -80 ° C Gefrierschrank Eisbehälter zu trocknen. </li><li> Das tiefgefrorene Embryos innerhalb der Mörtel auf dem Trockeneis. </li><li> Gießen Sie ausreichend flüssigem Stickstoff, den Embryo zu decken und schleifen sie mit dem Stößel zu einem feinen Pulver. </li><li> Übertragen des Embryos Pulver zu einer vorher markierten Probenröhrchen mit einem MICRospatula (Abbildung 1) und legen Sie den Schlauch in einem -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> Verwenden Sie ein sauberes vorgekühlten Mörser und Stößel für jeden Embryo und ändern Sie die Untersuchungshandschuhe nach jeder Embryo Schleifkreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden. </li></ol> 3. Die genomische DNA-Präparation mit modifizierten Natriumhydroxid Methode <ol><li> Label alle Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml), die für die Anzahl von zu analysierenden Proben. </li><li> Übertragen Sie die Probenröhrchen enthält Embryo-Pulver aus dem -80 ° C Gefrierschrank in einen Behälter mit Trockeneis vor dem Start. </li><li> Pipettieren 180 ul 50 mM NaOH (Natriumhydroxid) in jedes pre-markierten Reaktionsgefäß. </li><li> Aktivieren eines Inkubators und Vorheizen auf 95 ° C. </li><li> Verwenden einen Zahnstocher die richtige Menge an Pulver Embryo zu übertragen (etwa 5-10 mg) (Abbildung 2) aus dem Probenröhrchen in eine vorge markierten Mikrozentrifugenröhrchen, die 50 mM NaOH-Lösung enthält. </li><li> ziehen up die gleiche Zahnstocher langsam die DNA Lysat als klebrig, klebrig, weiß transparent artige Substanz (Abbildung 3) zu visualisieren. </li><li> Übertragen die Mikrozentrifugenröhrchen mit DNA Lysat vorgeheizten Brutschrank bei 95 ° C für fünf Minuten. Sofortüberweisung um die Röhre zu einer Styroporbox mit Eis gefüllt. </li><li> In 20 ul 1 M Tris-HCl direkt in das Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie es, indem Sie vorsichtig den Schlauch tippen. Verwenden, um eine pH-Papier, um sicherzustellen, der pH-Wert beträgt etwa 8,0 (4) vor der Zentrifugation. Hinweis: Wenn Sie mit einer großen Anzahl von Probenvorbereitungen zu tun, es akzeptabel ist, nach dem Zufallsprinzip einige Proben nehmen Sie den pH-Wert zu überprüfen. </li><li> Zentrifugieren des Röhrchens mit der DNA Lysat bei 2000 xg in einer Mikrozentrifuge für zwei Minuten bei Raumtemperatur ungelöst Gewebetrümmer zu entfernen. </li><li> Transfer 150 ul der oben klare Überstand in ein neues Röhrchen oder Platten mit 96 Vertiefungen. Hinweis: Die klare DNA Lysat bereit ist, als Vorlage im PC nutzenR Reaktion und es ist stabil bei 4 ° C für zwei Wochen oder er kann für ein Jahr bei -20 ° C aufbewahrt werden. </li></ol> 4. Design Sex-spezifische PCR-Primer <ol><li> Erhalten Zugangsnummern für Schweine Geschlecht bestimmende Region Y (SRY) (NM_214452.3) und und Zinkfinger-Protein X-chromosomal (ZFX) Gene (XM_005673501.1) von NCBI Webseite http://www.ncbi.nlm.nih.gov /. </li><li> Kopieren Sie diese NCBI-Zugangsnummern zu einer Online-Primer-Design-Tool. Hinweis: Die beste Primer Informationen einschließlich der Länge, Tm und GC% sowie PCR-Produkt Größe (bp) wird auf dem Bildschirm erzeugt werden (Abbildung 5). </li><li> Überprüfen der Spezifität dieser Primer Nukleotid BLAST-Programm (Blastn) gegen den Strom porcine genomischen Datenbank 104 diese Sequenzen, um sicherzustellen, werden nur sich auf X und Y-Chromosom für SRY und ZFX jeweils (Abbildung 6). </li></ol> 5. genomischer DNA PCR direkt aus DNA Lysate <ol><li> Benutzennur 1 ul der DNA-Lysat als Vorlage für eine Reaktion 15 ul PCR. Hinweis: Ein Hochdurchsatz-Screeningverfahren für 96-Well-Platten PCR kann in ähnlicher Weise durchgeführt werden, um eine Mehrkanalpipette. </li><li> Sie haben folgende Möglichkeiten nur für die erste PCR: Vorbereitung einer PCR-Röhrchen für die keine Vorlage Negativkontrolle und zwei zusätzliche Rohre für positive Kontrollen durch Zugabe von 1 &amp; mgr; l (0,5 ng) im Handel erhältlich bekannt Sex Schweine genomischer DNA. Später gehören eine Probe aus dem letzten erfolgreichen Geschlechtsbestimmung Analyse als eine positive Kontrolle und gemeinsam für die Geschlechtsbestimmung mit dem neuen PCR-Reaktion führen. </li><li> Verwenden Sie eine beliebige HotStart Fertigmischung PCR Enzym und bereiten durch Zugabe von Primern einen Master-Mix und Nuclease Reaktionen freies Wasser in Abhängigkeit von der Gesamtzahl der PCR. 1 ul der DNA-Lysat in einem bereits vorhandenen PCR-Röhrchen mit 14 ul des PCR-Mastermix. Hinzufügen Primer, so dass die Endkonzentration der Primer aus zwei geschlechtsspezifische Gene 0,3 uM in insgesamt 15 ul PCR reaction. </li><li> Legen Sie die folgende PCR-Programm in einem Thermocycler up: 95 ° C für 3 min, 35 Zyklen mit jeweils 20 sec Schmelzschritt 98 ° C, gefolgt von einem 15 Sek Temperschritt bei 65 ° C, gefolgt von einem 15 Sek Elongationsschritt bei 72 ° C. In einem letzten Schritt, Inkubieren der Reaktionen für 1 min bei 72 ° C und weiter bei 4 ° C bis zur Entfernung der PCR-Röhrchen für die Gelelektrophorese Überprüfung zu inkubieren, das Geschlecht zu bestimmen. Hinweis: Die PCR-Bedingungen und Optimierung werden entsprechend der Bedienungsanleitung des PCR-Kits in der Werkstoff-Tabelle erwähnt. </li><li> In der entsprechenden Menge an nicht-toxischen grün- fluoreszierenden SYBR DNA Gel Fleck, wenn eine 2% TBE Agarose-Gel vor. Hinweis: Ethidiumbromid kann für Grün- Fluoreszenzfarbstoff ersetzt werden, wenn es nicht verfügbar ist. </li><li> In 1,5 ul der Ladepuffer (10x) in die PCR-Röhrchen und mischen Sie gut durch die Reaktion Puffer PCR Pipettieren up-and-down. </li><li> Last 10 ul der Probe in die Vertiefung und run das Agarosegel mit entsprechenden Spannungseinstellungen (small Gel-Apparatur bei 100 V, 96-Well-Gel-Apparatur bei 150 V, bis der Farbstoff Band läuft auf halbem Weg durch das Gel). </li><li> Bitte beachten und die Bänder Intensitäten unter dem Fluoreszenzlicht Einstellung anpassen, um eine Laser-Scanner und ein Bild des Gels erfassen. Hinweis: Gemeinsame Gel-Imager für den Ethidiumbromidgel ersetzt werden. </li><li> Bestimmen Sie das Geschlecht der Schweineembryonen von Embryonen mit einer Band als eine weibliche und zwei Bänder als männlich (Abbildung 7) zu identifizieren. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die meisten der bestehenden Protokolle im Zusammenhang mit Schweineembryonen DNA Sex Typisierung sind nur für den frühen Stadium vor der Implantation Stufe 15,16. Wir haben erfolgreich ein Protokoll für Schweineembryos Screening während der späten Schwangerschaft entwickelt. Basierend auf Studien mit ähnlichen Entwicklungsstadien von Embryonen aus früheren Studien 6,18 ist die vorliegende Protokoll als sicherer und kostengünstig zu sein. Dieses Protokoll ist fü...

Das Hausschwein hat sowohl eine grundlegende Forschungsgegenstand in der Entwicklung, Genetik und Ernährung in den Bereichen Mensch und Vieh werden. Das Potential von Schweinen als biomedizinische Modelle für die Forschung mit menschlichen können, um ihre physiologischen Ähnlichkeiten zurückgeführt werden. In Nutztiere, kann die Manipulation von Geschlechterverhältnis, die Wirksamkeit der Selektion und Zuchtprogramme 1 erhöhen. Sexing einzelnen Embryonen ist ein grundlegendes Werkzeug in vielen experimentellen Untersuchungen verwendet, einschließlich, jedoch nicht zu Genotyp, Epigenetik und X-Inaktivierung von Geschlechtsunterschied in der frühen Embryonalentwicklung 2 beschränkt. Studien an Mäusen legen nahe, dass mütterliche Ernährung und andere Faktoren in Geschlechterungleichgewicht 3 führen kann. Bei Schweinen Ursachen des Ungleichgewichts Geschlechterverhältnis sind väterlichen Zucht 4, Gebärmutter-Kapazität 5, und die Stoffwechsellage der Sau 6. Da die beobachteten Unterschiede in Embryonen und Würfe können durch an sich beeinflusst werdenxual Dimorphismus, sollten Forscher bewusst Embryo Sex und Geschlechterverhältnisse, bevor Rückschlüsse auf ihre Forschung zu ziehen. Die Entwicklung von leistungsfähigen Werkzeugen und Protokollen für die Geschlechtsbestimmung Schwein Embryonen an Tag 30 der Entwicklung werden hier diskutiert. Verschiedene Methoden der Geschlechtstypisierung wurden für genetische Studien in Modellorganismen und Viehzucht entwickelt. Besonders in der Tierhaltung, frühen Embryonen männliche und weibliche Identifizierung ist eine sehr gängige Praxis genetische Selektion für Zuchtprogramme zu verbessern. Am frühen Embryonen in der Schweine Karyotypisierung mit Giemsa 7 oder die intensive Fluoreszenz 8,9 Techniken wurden für Sex Typisierung verwendet. Jedoch sind diese Verfahren zeitaufwendig und eignet sich nicht für das Screening einer großen Anzahl von Embryonen schnell und genau. Die effektivste Methode ist, sex Typisierung DNA-Amplifikation eine hitzestabile DNA-Polymerase und zwei Primern. DNA-Geschlechtsbestimmung durch PCR-Methode ist präziser, schneller und empfindlicher, our erfordert eine winzige Menge von Schaumstoffen. Die erste PCR-basierte Embryo Geschlechtsbestimmung wurde am 10. Menschen durchgeführt und später in Mäusen 11, Rinder 12, Büffel, Schafe 13 14 pre-Implantation-Embryonen. Beim Schwein wurde der früheste DNA Sex Typisierungsmethode für Präimplantationsembryonen etabliert über ein einziges Paar von Y-Chromosom-spezifischen DNA-Primer 15. Jedoch waren die häufigsten PCR-Primer für die Geschlechtsbestimmung von dem Y-Chromosom der männlichen spezifischen Gens SRY 16 ausgewählt, und der nicht-geschlechtsspezifischen diskriminierende Bereich einer Zinkfinger-Gen an beiden X und Y-Chromosom 17 befindet. Anschließend wurden diese Primer wurden in dieser Studie mit verbesserter Spezifität der Primer zu erfassen nur die X- Chromosom eines Zinkfinger-Gen, das Geschlecht Tag 30-Embryonen zu bestimmen aufgetragen. Genomische DNA aus Schweine Präimplantationsembryonen kann durch Belichten eines intakten Blastozyste mit proteinas zum Puffern extrahiert werdene K 16 oder durch eine Biopsie von wenigen Zellen aus den einzelnen frühen Spaltung unter Embryonen 15 und für direkte PCR. Jedoch Freisetzung von DNA aus Schweineblut, Haare, Gewebe oder einem großen conceptus über einige Zentimeter groß ist nicht effektiv getan, um die Proteinase K-Methode. DNA-Extraktionsverfahren für diese Materialien wurden 18 entweder zeitaufwendig Phenol / Chloroform-Protokolle 6 oder teuer Spalte basiert Kits hergestellt. Um die Verwendung von potentiell toxischen Chemikalien zu vermeiden, gibt es einen Trend kostengünstig, einfach und phenolfrei DNA Extraktionsverfahren zu entwickeln. Diese Art von Protokoll für die Isolierung von PCR-Qualität genomische DNA von der Maus 19 und Zebrafisch 20 Geweben wurde unter Verwendung von heißem Natriumhydroxid und Tris (HOTSHOT) etabliert. Diese Studie liefert ein Protokoll DNA mit modifizierten Hotshot und neu gestaltet Duplex Primerpaare für die PCR-Sex Eingabe direkt aus Zelllysaten von Tag 30 Schweineembryonen zu erhalten mithohe Genauigkeit.

<table><tbody><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit&amp;nbsp;</td><td>KAPABiosystems</td><td>KR0370</td><td>other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe</td></tr><tr><td>Pig female and male genomic DNA</td><td>Zyagen</td><td>GP-160-F1 &amp;amp; GP-160-M5</td><td>Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9500 laser scanner</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9969-43</td><td>other imaging system can be used</td></tr><tr><td>Free Soft Nitrile Examination Gloves</td><td>WWR</td><td>89038-270</td><td>any other examination glove can be used</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide, solid&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 359 -212</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean</td><td>Eppendorff</td><td>0030 108.051</td><td>heat resistant</td></tr><tr><td>ThermoStat plus</td><td>Eppendorff</td><td>22670204</td><td>Use as a incubator for 95 &amp;#176;C , don&#039;t need to use the heater</td></tr><tr><td>Toothpick</td><td>Bunzl Plc</td><td>75200815</td><td>Any round wooden toothpicks can be used - quality wood</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R/5417C</td><td>Eppendorff</td><td>22621807</td><td>This model was discontinued. But another newer model can be used</td></tr><tr><td>Microspatula</td><td>Fisher</td><td>SDI28540115</td><td>Autoclaved before use each time.</td></tr></tbody></table>

accurate and phenol free dna sexing of day 30 porcine embryos by pcr

Die Erforschung pränatale Programmierung in das Schwein hat gezeigt, dass das Geschlecht des sich entwickelnden Embryo oder Fötus das Entwicklungsergebnis beeinflussen können. Daher ist die Fähigkeit, ein Embryo, das Geschlecht zu bestimmen, ist notwendig, viele Experimente besonders früh Entwicklung. Dieses Protokoll zeigt, eine kostengünstige, schnelle und nicht-toxische Herstellung von Schweine genomische DNA zur Verwendung mit PCR. Tag 30 Embryonen auf humane Weise den Richtlinien festgelegt nach durch Institutional Animal Politik und Wohlfahrtsausschüsse für das vorliegende Protokoll gesammelt werden müssen. Die Herstellung des gesamten Embryos für diese PCR basiert sexing Technik einfach beinhaltet die gefrorenen Embryos zu einem feinen Pulver Mahlen eines vorgekühlten Mörser und Pistill. PCR-Qualität-DNA wird aus einer kleinen Menge von Embryo Pulver freigesetzt durch eine heiße Inkubation in einem alkalischen Lyse-Reagenz aufgebracht wird. Als nächstes wird die DNA-Lösung mit Neutralisationspuffer gemischt und direkt für die PCR verwendet. Zwei Primerpaare erzeugt UVEKt bestimmte Geschlechtsbestimmungsbereich des Y-Chromosoms (SRY) und ZFX Bereich des X- Chromosoms mit hoher Genauigkeit und Spezifität. Das gleiche Protokoll kann auf andere längliche Embryonen (Tag 10 bis Tag 14) früher als Tag angewendet werden 30. Auch kann dieses Protokoll mit 96 quoll Platten durchgeführt werden, wenn eine große Anzahl von Embryos Screening, so dass es möglich für die Automation und Hoch Durchsatz Sex Typisierung.

Ein repräsentatives Ergebnis der Geschlechtsbestimmung von 345 DNA Lysaten Screening mittels PCR ist in Abbildung 7 und zusammengefasst in Tabelle 1 dargestellt. Wie bei 65 ° C in Figur 7 ist der Primer Glühtemperatur sehen ist, ist die optimale Bedingung in diesem PCR-Protokoll ähnliche Intensität und prädizierten Amplikongrößen erzeugen (Figur 5) zwi...

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Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Präzise und Phenol Freie DNA Geschlechtsbestimmung von Tag 30 Schweineembryonen mittels PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

accurate-and-phenol-free-dna-sexing-of-day-30-porcine-embryos-by-pcr

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Aufrufe.  University of Alberta. This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Serie: Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transkriptom Profilieren<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Genetik

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented in human embryos. Preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) is a genetic test that significantly improves reproductive outcomes by detecting chromosomal abnormalities of embryos. Next-generation sequencing (NGS) provides a high-throughput and cost-effective approach for genetic analysis and has shown clinical applicability in PGT-A. Here, we present a rapid and low-cost semiconductor sequencing-based NGS method for screening of aneuploidy in embryos. The first step of the workflow is whole genome amplification (WGA) of the biopsied embryo specimen, followed by construction of sequencing library, and subsequent sequencing on the semiconductor sequencing system. Generally, for a PGT-A application, 24 samples can be loaded and sequenced on each chip generating 60&#8722;80 million reads at an average read length of 150 base pairs. The method provides a refined protocol for performing template amplification and enrichment of sequencing library, making the PGT-A detection reproducible, high-throughput, cost-efficient, and timesaving. The running time of this semiconductor sequencer is only 2&#8722;4 hours, shortening the turnaround time from receiving samples to issuing reports into 5 days. All these advantages make this assay an ideal method to detect chromosomal aneuploidies from embryos and thus, facilitate its wide application in PGT-A.

Here, we introduce a semiconductor sequencing method for preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) with the advantages of short turnaround time, low cost, and high throughput.

Halbleitersequenzierung für Präimplantationsgenetische Tests für Aneuploidie

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to laboratories for studies to further our understanding of marine mammal reproduction. Heterologous IVF, a replacement for homologous IVF, could provide a means to test the sperm fertility potential; to study gamete physiology and early embryo development; and to avoid the use of valuable dolphin oocytes, which are difficult to obtain. Here, we present protocols that have been successfully used to collect and cryopreserve dolphin spermatozoa. The collection of semen is performed by manual stimulation on trained dolphins. Cryopreservation is accomplished using a TRIS egg-yolk based extender with glycerol. In addition, we present a protocol that describes heterologous IVF using dolphin spermatozoa and bovine oocytes and that verifies the hybrid nature of the resulting embryo using PCR. Heterologous fertilization raises questions on fertilization and can be used as a tool to study gamete physiology and early embryo development. In addition, the success of heterologous IVF demonstrates the potential of this technique to test dolphin sperm fertilizing capacity, which is worth further examination.

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Here, we present protocols that have been successfully used for dolphin spermatozoa collection, cryopreservation, and heterologous IVF performance using bovine oocytes.

Bottlenose Delphin (Tursiops Truncatus) Spermien: Sammlung, Kryokonservierung und heterologen Befruchtung In Vitro

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage that forms the placenta. This method, however, requires specialized skills, is invasive, and suffers from false positives and negatives because the chromosome numbers in the TE and the inner cell mass (ICM), which develops into the fetus, are not always the same. NICS, a technology requiring sequencing of DNA that released into the culture medium from both TE and ICM, may offer a way out to these problems but has previously been shown to have limited efficacy. The present study reports the full protocol of NICS, which includes culture medium sampling methods, whole genome amplification (WGA) and library preparation, and NGS data analysis by analysis software. Considering the different cryopreservation times in different embryo laboratories, embryologists have two methods for collecting embryo culture medium that can be selected according to the actual conditions of the IVF laboratory.

The present study reports a protocol for chromosome screening of human embryos that uses spent culture medium, which avoids embryo biopsy and enables chromosome ploidy identification using NGS. The present article presents the detailed procedure, including the preparation of culture medium, whole genome amplification (WGA), next-generation sequencing (NGS) library preparation, and data analysis.

Chromosomen-Screening von humanen Präimplantationsembryonen unter Verwendung von verbrauchtem Kulturmedium: Probenentnahme und Chromosomenploidie-Analyse

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Isolierung und Genotypisierung von gastrulierenden Mausembryonen für die Einzelzellsequenzierung

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Autor im Rampenlicht: Eine Pipeline zur Analyse linienspezifischer mutierter Embryonen mit Einzelzellauflösung

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Präzise und Phenol Freie DNA Geschlechtsbestimmung von Tag 30 Schweineembryonen mittels PCR

Zusammenfassung

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Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

Transkriptom Profilieren

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Halbleitersequenzierung für Präimplantationsgenetische Tests für Aneuploidie

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Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation