이 작품은 HEM에 NIH 교부금 DA15169 및 DA035224에 의해 투자되었다

모든 동물 취급 및 조직 수확은 승인 된 프로토콜 번호를 A1506 (멜리 키앙, PI) 다음, 매사 추세 츠 의과 대학 기관 동물 관리 사용위원회의 대학 (IACUC)의 지침에 따라 수행 하였다. 필수 솔루션 인공 뇌척수 (ACSF) - 신선한 매일 확인 125 밀리미터의 NaCl, 2.5 밀리미터의 KCl, 1.2 ㎜의 NaH 2 PO 4, 1.2 mM의 MgCl2를 2.4 mM의 염화칼슘, 26 mM의 탄산 수소 나트륨, 11 mM의 포도당 참고 : 배 원액으로 ACSF을 준비, 탄산 수소 나트륨과 포도당을 제외하고. 신선한 탄산 수소 나트륨과 포도당으로 보충, 배 주식에서 매일 1X 작업 솔루션을합니다. 자당이 첨가 ACSF (SACSF) - 신선한 매일 확인 250 ㎜의 SUC2.5 밀리미터의 KCl, 1.2 ㎜의 NaH 2 PO 4, 1.2 mM의 MgCl2를 2.4 mM의 염화칼슘, 26 mM의 탄산 수소 나트륨, 11 mM의 포도당을 증가 참고 : 배 원액으로 SACSF을 준비, 탄산 수소 나트륨과 포도당을 제외하고. 신선한 탄산 수소 나트륨과 포도당으로 보충, 배 주식에서 매일 1X 작업 솔루션을합니다. 설포-N-hydroxysuccinyl-SS - 비오틴 (설포-NHS-SS-비오틴, 피어스 케미칼) 주식 솔루션은 DMSO 200 ㎎ / ㎖하고 여러 동결 / 해동 사이클에 저항해야한다. 분액 -20 ° C.에 저장됩니다 숙시 닐 에스터 급속 수용액에서 가수 분해되므로, 작업 해법 전에 슬라이스에 적용 즉시 준비되어야한다. 슬라이스 담금질 솔루션 ACSF 100 mM의 글리신과 보충 RIPA 용해 BuffeR 10 mM 트리스, pH 7.4의 150 mM의 염화나트륨, 1.0 mM의 EDTA, 1 % 트리톤-X-100, 0.1 % SDS, 1 % 나 콜산 프로테아제 억제제와 RIPA (RIPA / PI) - 신선한 매일 확인 RIPA는 1 μM의 류 펩틴, 1 μm의 펩 스타틴, 1 μM의 아프로 티닌, 1 밀리미터 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드로 보충. 1. 뇌 조각을 준비한다 <ol><li> 신선한 1X의 SACSF 및 1X ACSF을 </li><li> 작은 비커에 얼음에 SACSF을 풀어. 이 갓 수확 된 마우스의 두뇌를 유지하는 데 사용됩니다. </li><li> 95 % / 5 % O 2 / CO 2, 얼음에 20 분 버블 링에 의해 산소와 ACSF 및 SACSF 포화. </li><li> P30-38 마우스는 최적의 조직의 생존을 위해 사용되어야한다. 자궁 경부 전위와 잘린 동물을 희생하고 빠르게 prechilled, 산소 SACSF에 머리를 제거합니다. </li><li> 진동 마이크로톰을 사용하여, 그 지역에서 300 μm의 뇌 부분을. </li><li> 원하는 경우, 조각은 더 특정 뇌 영역 또는 별도 오른쪽으로 각각 제어 및 실험 슬라이스로 사용할 왼쪽 반구에 풍부하게 복구 이전 해부 할 수 있습니다. </li><li> 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 24 - 웰 플레이트에 설정 챔버 바닥 메쉬에 조각을 전송합니다. </li><li> 슬라이스가 계속, 부드러운 버블 링, 산소 ACSF에서, 40 분 동안 31 ° C를 복구 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 약물 치료 (해당되는 경우) 및 슬라이스 바이오 티 닐화 <ol><li> 복구 후, 예비 가온 (37 ° C), 산소 ACSF의 버블 링에서 지속적으로 95 % / 5 % O 2 / CO 2 조각을 씻어 배. </li><li> 시험 물질을 추가하고 지속적으로 산소와 부화. <ol><li> 편의를 위해, 10 배 농축 된 약물의 1 / 10 번째 볼륨을 추가하고 부드럽게 반전 섞는다. </li><li> 온화하게 원하는 온도에서 수욕 플레이트를 흔들어. </li></ol></li><li> 다음 약물 치료, 급속차가운 얼음 ACSF에 배를 세척하여 냉기의 조각. </li></ol> 3. Biotinylate 표면 단백질 <ol><li> 바로 전에 라벨에 차가운 얼음 ACSF의 준비 1.0 ㎎ / ㎖ 설포-NHS-SS - 비오틴. </li><li> 슬라이스 설포-NHS-SS - 비오틴 825 mL를 넣고 얼음, 45 분에 슬라이스를 품어. </li><li> 얼음에 차가운 얼음 ACSF에서 10 분 동안 배양 한 다음, 얼음 차가운 ACSF 빠르게 조각을 세 번 씻으십시오. </li><li> 차가운 얼음 조각 끄다 버퍼 조각을 세 번 세척하고 무료 설포-NHS-SS - 비오틴을 종결 825 ㎖의 슬라이스 급냉 버퍼와 얼음에 두 번, 25 분을 품어. </li></ol> 4. 조직 해물을 준비 <ol><li> 차가운 얼음 ACSF의 조각을 세 번 세척하고 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 microcentrifuge 관에 각 조각을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 200 XG, 1 분 조심스럽게 대기음 나머지 ACSF을 원심 분리하여 슬라이스를 펠렛. </li><li> 400 μL 차가운 얼음 RIPA / PI를 추가로 pipetting하여 조직을 파괴하고 아래로 한 번 P200 핍을 통해ETTE. </li><li> 전송 신선한 튜브 조각 / RIPA를 분해 및 용해를 완료하기 위해, 회전, 30 분, 4 ° C를 품어. </li><li> 원심 분리하여 세포 파편 펠렛, 18,000 XG, 15 분, 4 ° C. </li><li> 표준으로 소 혈청 알부민 (BSA)와 BCA 단백질 분석법을 사용하여 용 해물의 단백질 농도를 결정한다. </li></ol> 5. 바이오틴 단백질을 분리 <ol><li> 비드 / 총 단백질 비율을 최적화합니다. 주 : 개별 단백질 발현 수준은 다른 뇌 영역에 걸쳐 광범위하게 변할 수있다. 조직 파쇄물의 주어진 양에서 바이오틴 단백질 모두가 캡처하지 않는 한, 정확하게 표면 발현의 잠재적 인 변화를 감지 할 수 없다. 따라서, 경험적 전에 새로운 슬라이스 바이오 티 닐화 연구 착수시에 특정 단백질 / 뇌 영역에 대한 최적의 비드 / 전체 단백질의 비율을 결정하기 위해 필수적이다. <ol><li> 증가 금액으로 25 ㎕의 스트렙 타비 딘 아가로 오스의 구슬을 품어, 세척 및 용출 단계를 바인딩 그런 다음 아래의 설명에 따라 조직 용 해물 (대략적인 범위 25 ~ 200 μg), 그리고의 진행. </li><li> 그 결과 면역 반응 대역을 정량화하고 그 증가 또는 단백질의 표면 발현을 감소 하나의 정확한 정량화를 허용합니다 바인딩의 선형 범위의 비드 / 해물 비율을 선택합니다. </li></ol></li><li> 스트렙 타비 딘 - 아가로 오스의 구슬을 준비 <ol><li> 모든 샘플에 필요한 총 비드 볼륨을 결정합니다. 25 μL / 샘플 = 100 μl의 구슬 + 하나 추가 = 125 μl의 구슬에 그 금액에 대한 충분한 비드 볼륨을 더한 추가 (즉, 4 샘플을 준비합니다. </li><li> 소용돌이 스​​트렙 타비 딘 구슬 주식 및 피펫 밖으로 볼륨을 원하는. P200 피펫을 사용하면, 방해 또는 구슬의 손상을 방지하기 위해 팁 단부를 잘라. </li><li> 객실 성질에서 18,000 XG, 1 분을 원심 분리하여 방부제, 각 RIPA 추가 후 소용돌이로 교반 및 세척 사이에 수집 구슬을 제거하기 위해 0.5 ~ 1.0 ㎖의 RIPA / PI에 구슬을 3 회 세척ature. </li><li> 진공 플라스크에 부착 된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 세척 사이의 버퍼를 대기음. 흡입시 유리 파스퇴르 피펫의 단부에 부착 플라스틱 P200 팁은 미세한 제어를 제공한다. 이 피펫으로 흡입 비즈 위험으로는, 우선이 세척 절대적 모든 버퍼를 제거 할 필요가 없다. 최종 세척 후 구슬을 흡입하지 않고 가능한 한 많은 여분의 버퍼를 제거합니다. </li><li> 과에 resuspend 아래로 피펫 팅, 다시 원래 볼륨으로 구슬을 가지고 RIPA / PI를 추가합니다. 비즈 튜브 벽에 붙어있는 바와 같이,이 시점에서 소용돌이로 교반을 피하십시오. </li><li> 끝으로 P200을 사용하여 마이크로 원심 튜브로 나누어지는 비즈 차단. 구슬이 균등하게 중단과 튜브 사이에 분산 남아 보장하기 위해 다운 샘플링 사이에 몇 번을 피펫. </li></ol></li><li> 구슬을 스트렙 타비 딘에 바인딩 바이오틴 단백질 <ol><li> 아가로 오스 비즈가 들어있는 튜브에 세포 용 해물을 배포합니다. 실험에 갔지<html> 여러 샘플을 비교되고 다시 정확한 비교를 위해 각 샘플에 대해 동일한 양의 단백질을 사용해야합니다. </li><li> 200 ㎕의 최소한의 볼륨에 샘플을 가지고 추가 RIPA / PI를 추가합니다. 이 샘플을 배양하는 동안 적절하게 혼합하고 또한 샘플에 걸쳐 단백질 농도를 통합 할 확신합니다. </li><li> 관 회전 장치에 튜브를 넣고 4 ℃에서 하룻밤 혼합 </li><li> 별도의 튜브에 각각의 샘플에 사용되는 다운로드 용 해물 부피의 등가 분배. 샘플 볼륨이 높은 경우에 대안 적으로, 전체 용해질 부피의 분획을 SDS-PAGE 겔에 최대 부하 볼륨을 수용하기 위해, 대신에 할당 될 수있다. 이들은 총 단백질의 양을 표면 발현을 정상화하는 데 사용됩니다. </li><li> 같은 배의 볼륨이나 배의 SDS-PAGE 샘플 버퍼 1 / 5 볼륨과 하나의 샘플을 분석 할 때까지 -20 ° C에서 비드 샘플, 또는 매장과 동시에 4 ° C, 부화 하나를 추가합니다. </li></ol></li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. 용출 및 샘플 분석 <ol><li> 실온에서 18,000 XG, 2 분 원심 분리하여 구슬 펠렛. </li><li> 기음 뜨는 세척 구슬 825 ㎖의 RIPA 3 회. 비드 손실을 최소화하기 위해, 세척 간 비즈 상기 버퍼의 작은 머리 부피를 남긴다. 최종 세척 후, 비드 펠렛을 방해하지 않고, 가능한 한 많은 RIPA를 제거합니다. </li><li> 이황화 결합을 감소시켜 스트렙 타비 딘 비즈에서 바이오틴 단백질을 용출. 샘플 버퍼, 소용돌이도를 감소 25 μL 2X SDS-PAGE를 추가하고 샘플 30 분, 실내 온도를 돌립니다. 참고 : 대부분의 막 단백질이 심각 그들의 전기 영동 이동성을 손상, SDS-PAGE 샘플 버퍼에 삶은 때 집계 높은 경향이있다. 이 조사되고 단백질 경우라면, 가열 샘플을 피하고, 대신에, 실온에서 서서히 용출. 비등 (병렬로 평가 다른 단백질이 비등을 필요로하는 경우 예) 절대적으로 필요한 경우, SAMPLE 버퍼는 응집을 최소화하기 위해 2 M 우레아 (최종 농도)로 보충 될 수있다. 어떤 경우에는 응집을 감소시키는 효과가 있지만, 요소는 종종 밴드의 모습을 타협. </li><li> 면역 블롯에 의해 샘플을 분석합니다. </li><li> 다운로드 용 해물 샘플을 해동하고 비드 샘플, 30 분간 실온에 평행하게 회전한다. </li><li> SDS-PAGE 젤에 별도의 단백질. </li><li> 면역 블로 그 단백질 (들)을 확인합니다. <ol><li> 밴드가 적절한 정량 검출의 선형 범위에서 검출되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 바이오 티 닐화 시약이 손상 / 손상 세포를 통해 세포 내 단백질에 대한 액세스 권한을 얻게되지 않았 음을 보장하기 위해. 이것은 가장 조사되는 세포 유형에 특정한 세포 내 단백질을 위해 평행으로 면역 블에 의해 수행된다. </li><li> 밴드 밀도를 정량화 총 단백질 발현 수준의 비율로 상대 단백질 표면 밀도를 산출한다. </li></ol></li></ol>

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저자는 재정적 이익에게이 작품과 충돌이 없습니다.

두뇌에 매우 영향 시냅스 신호 이입 매매, 그것은 양적으로 성인 신경 세포의 표면 단백질 발현의 변화를 측정하기 어려운 입증했다고 오랜 지식에도 불구하고. 이 작품에서 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 생체 레이블을 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을보고합니다. 그들은 시냅스 연결과 자신의 준비 시간 이후에 세포 생존을 위로 유지로 뇌 조각의 준비는, 전기 생리학 레코딩을위한...

세포 내 이입 매매는 필수적인 막 단백질의 다양한 세포막의 프레 젠 테이션을 미세 조정 유비쿼터스 세포 메커니즘입니다. 엔도 시토 시스는 세포 내 환경 1에 필수 영양소를 제공하며, 수용체 활성화 2에 대한 응답으로 수용체 신호 둔감해진다. 확대 원형질막에 리사이클 이입은 별도로 세포 표면 (3)에 단백질 발현 수준을 증가시킴으로써 세포 신호 전달을 향상시킬 수있다. 또한, 멤브레인 인신 매매의 교란은 단백질의 세포 내 이입 매매를 제어하는 분자 메커니즘을 조사 할 필요성을 강조, 수많은 질병과 병적 인 조건 4,5에 연루되어있다. 많은 단백질이 지난 몇 년 동안 증거를 장착 고전 방 clathrin 의존 국제화 메커니즘을 사용하는 동안 여러 방 clathrin 독립적 인 세포 내 이입 메커니즘의 증가 배열의 세포 내 이입 가능성을 제어 것을 보여줍니다단백질 6,7. 따라서, 생리 관련 시스템에서 인신 매매를 촉진하는 세포 내 이입 메커니즘을 조사 할 필요가 상당히 성장했습니다. 뇌의 수용체, 이온 채널과 신경 전달 물질 수송의 세포 내 이입 매매는 시냅스 가소성 8-11 궁극적으로 신경 세포의 흥분성 시냅스 반응에 영향을 남용 12-15의 약물에 반응을 수립 기본 역할을하고 있습니다. 신경 세포의 인신 매매의 대부분의 연구는 이종 발현 시스템 또는 양식 기본 뉴런 하나에 의존하는 현재까지, 어느 것도 확실하게 성인 신경 세포 재생의 메커니즘을 반영 할 수있다. 여기, 우리는 양적으로 성인 설치류에서 파생 된 급성 뇌 조각의 표면 단백질의 수준을 측정하는 표면의 바이오 티 닐화를 사용하는 방법을보고합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 마우스 선조체 도파민 수송 체에 재 빠르게 내부화 입증 자료를 제시포르 볼 에스테르 - 매개 단백질 키나제 C (PKC)의 활성화에 sponse.

<table><tbody><tr><td>sulfo NHS-SS-biotin</td><td>Pierce</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Pierce</td><td>20347</td><td></td></tr><tr><td>IgG-free, Protease-free bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating microtome sectioner</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell mesh-bottomed inserts (8 &amp;micro;m pore size)</td><td>Millipore</td><td>PI8P 012 50</td><td>These can be washed by hand and reused</td></tr></tbody></table>

brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons

레귤 이입 매매 동적 분의 시간 스케일에서 수용체, 이온 채널 및 전달체 세포 표면 프레젠테이션을 제어함으로써, neuromodulatory 다양한 이벤트를 용이 중앙 메커니즘이다. 개별 단백질의 세포 내 이입 매매를 제어 메커니즘의 폭 넓은 다양성이있다. 인신 분자 토대를 조사 연구는 주로 정량적 외인성 자극 및 유전자 조작에 응답하여 세포막 단백질의 표면 발현의 변화를 측정하는 표면 바이오 티 닐화에 의존했다. 그러나,이 방법은 주로 충실히 성숙한 신경 세포 재생에 중요한 생리 학적 기전을 반영하지 않을 수도 배양 된 세포로 국한되었다. 또한, 배양 세포의 접근은 인신 매매 메커니즘의 지역별 차이를 과소 평가 할 수 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각 준비에 세포 표면의 바이오 티 닐화를 확장하는 방법을 설명합니다. 우리이 방법은 성숙한 신경 세포에서 세포막 단백질 표면 수준의 급격한 변화를 측정하는 고 충실도 접근법을 제공한다는 것을 보여준다. 이 방법은 신경 세포 내 이입 매매의 분야에서 광범위한 유틸리티를 가질 가능성이있다.

신경원 도파민 수송 체는 세포 라인 16-20에서 PKC의 활성화에 응답 내재화된다. 세포주 및 발현 시스템의 다양한 PKC 유도 DAT 표면 손실을 보여주는 많은보고에도 불구하고, 배양 도파민 뉴런 21-23에서 이러한 발견을 확인하기 위하여 도전되었다. 우리는 직접 D​​AT 성인 도파민 신경 세포에서 PKC의 활성화에 대한 응답으로 내면화 여부를 테스트하기 위해 마우스 선조체 조각을 사?...

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Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

신경 세포막 매매 동적 세포막 단백질 가능 크게 영향 신경 전달을 제어한다. 지금까지, 그것은 성인의 신경 세포에서 신경 세포 내 이입 매매를 측정하기 위해 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 발현 생체의 급격한 변화를 측정 할 수있는 매우 효과적인, 양적 방법을 설명합니다.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

brain-slice-biotinylation-an-ex-vivo-approach-to-measure-region

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

12.9K 조회수.  University of Massachusetts Medical School.  신경 세포막 매매 동적 세포막 단백질 가능 크게 영향 신경 전달을 제어한다. 지금까지, 그것은 성인의 신경 세포에서 신경 세포 내 이입 매매를 측정하기 위해 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 발현 생체의 급격한 변화를 측정 할 수있는 매우 효과적인, 양적 방법을 설명합니다. 

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Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

연구

생화학

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

신경과학

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

생물학

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular mechanisms of synaptic plasticity. Long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) induced in acute hippocampal slices are widely accepted as cellular models of learning and memory. There are numerous studies that use live cell imaging or immunohistochemistry approaches to visualize activity dependent protein dynamics. However these methods rely on the suitability of antibodies for immunocytochemistry or overexpression of fluorescence-tagged proteins in single neurons. Immunoblotting of proteins is an alternative method providing independent confirmation of the findings.&#160;The first limiting factor in preparation of subcellular fractions from individual tetanized hippocampal slices is the low amount of material. Second, the handling procedure is crucial because even very short and minor manipulations of living slices might induce activation of certain signaling cascades. Here we describe an optimized workflow in order to obtain sufficient quantity of nuclear enriched fraction of sufficient purity from the CA1 region of acute hippocampal slices from rat brain. As a representative example we show that the ERK1/2 phosphorylated form of the synapto-nuclear protein messenger Jacob actively translocates to the nucleus upon induction of LTP and can be detected in a nuclear enriched fraction from CA1 neurons.

We provide a detailed protocol for induction of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampus and the subsequent isolation of nuclear enriched fractions from the tetanized area of the slice. This approach can be used to determine activity dependent nuclear protein import in cellular models of learning and memory.

해마 조각에서 CA1 핵 농축 분획의 분리는 Synapto 핵 메신저 단백질의 활동에 의존하는 핵 가져 오기를 공부합니다

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

양자의 축삭 교통 수단의 실시간 이미징 차 뉴런에서 BDNF를 도트 표지

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing patterns. The inclusion of biocytin/neurobiotin in the recording electrode permits post-hoc recovery of morphological details, which are necessary to determine the dendritic arborization and the regions targeted by the axons of the recorded neurons. However, given the presence of morphologically similar neurons with distinct neurochemical identities and functions, immunohistochemical staining for cell-type-specific proteins is essential to definitively identify neurons. To maintain network connectivity, brain sections for physiological recordings are prepared at a thickness of 300 &#181;m or greater. However, this thickness often hinders immunohistological postprocessing due to issues with antibody penetration, necessitating the resectioning of the tissue. Resectioning of slices is a challenging art, often resulting in the loss of tissue and morphology of the cells from which electrophysiological data was obtained, rendering the data unusable. Since recovery of morphology would limit data loss and guide in the selection of neuronal markers, we have adopted a strategy of recovering cell morphology first, followed by secondary immunostaining. We introduce a practical approach to biocytin filling during physiological recordings and subsequent serial immunostaining for the recovery of morphology, followed by the restaining of sections to determine the neurochemical identity. We report that sections that were filled with biocytin, fixed with paraformaldehyde (PFA), stained, and coverslipped can be removed and restained with a second primary antibody days later. This restaining involves the removal of the coverslip, the washing of sections in a buffer solution, and the incubation of primary and secondary antibodies to reveal the neurochemical identity. The method is advantageous for eliminating data loss due to an inability to recover morphology and for narrowing down the neurochemical markers to be tested based on morphology.

This protocol presents a method for the morphological recovery of neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin filling and subsequent immunohistochemical postprocessing. We show that thick biocytin-filled sections that were stained and coverslipped can be restained with a second primary antibody days&#160;or months later.

신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

Biotinylation을 사용하여 기본 Astrocyte 문화에서 단백질의 세포 표면 표현 및 Endocytic 속도를 결정

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A reproducible protocol was developed to directly&#160;mono-biotinylate BDNFAvi with the enzyme BirA in a tube. In this reaction, mono-biotinylated BDNFAvi retains its biological activity.
Neurotrophins are target-derived growth factors playing a role in neuronal development and maintenance. They require rapid transport mechanisms along the endocytic pathway to allow long-distance signaling between different neuronal compartments. The development of molecular tools to study the trafficking of neurotrophins has enabled the precise tracking of these proteins in the cell using in vivo recording. In this protocol, we developed an optimized and cost-effective procedure for the production of mono-biotinylated BDNF. A recombinant BDNF variant containing a biotinylable avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in the microgram range and then purified in an easily scalable procedure using affinity chromatography. The purified BDNF can then be homogeneously mono-biotinylated by a direct in vitro reaction with the enzyme BirA in a tube. The biological activity of the mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) can be conjugated to streptavidin-conjugated to different fluorophores. BDNFAvi and mbtBDNF retain their biological activity demonstrated through the detection of downstream phosphorylated targets using western blot and activation of the transcription factor CREB, respectively. Using streptavidin-quantum dots, we were able to visualize mbtBDNF internalization concomitant with activation of CREB, which was detected with a phospho-CREB specific antibody. In addition, mbtBDNF conjugated to streptavidin-quantum dots was suitable for retrograde transport analysis in cortical neurons grown in microfluidic chambers. Thus, in tube produced mbtBDNF is a reliable tool to study physiological signaling endosome dynamics and trafficking in neurons.

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in a cost-effective manner and is purified by affinity chromatography. BDNFavi is then directly mono-biotinylated with the enzyme BirA in a tube. BDNFavi and mono-biotinylated BDNFavi retain their biological activity when compared to commercially available BDNF.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :

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