Bu çalışma HEM NIH hibe DA15169 ve DA035224 tarafından finanse edildi

Tüm hayvan taşıma ve doku hasat onaylanan protokol # A1506 (Melikian, PI) ardından, Massachusetts Medical School Kurumsal Hayvan Bakım Kullanım Komitesi Üniversitesi (IACUC) esaslarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Gerekli çözümleri Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) - günlük taze olun 125 mM NaCl, 2.5 mM KCI, 1.2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgCl2, 2.4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO 3, ve 11 mM glükoz Not: 10x stok solüsyonu olarak ACSF hazırlayın, NaHCO 3 ve glikoz hariç. Taze NaHCO 3 ve glukoz ile tamamlayan, 10x stok günlük 1x çalışan çözümler olun. Sükroz takviye ACSF (SACSF) - günlük taze olun 250 mM suc, 2.5 mM KCI, 1.2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgCl2, 2.4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO 3 ve 11, mM glukoz gül Not: 10x stok solüsyonu olarak SACSF hazırlayın, NaHCO 3 ve glikoz hariç. Taze NaHCO 3 ve glukoz ile tamamlayan, 10x stok günlük 1x çalışan çözümler olun. Sülfo-N-hidroksisukkinil-SS-Biotin (sülfo-NHS-SS-biyotin, Pierce Chemical Company) Stok çözeltileri, DMSO içinde 200 mg / ml olabilir ve birden fazla donma / erime döngüsüne karşı dayanıklı olan gerekir. Alikotlar -20 ° C&#39;de saklanır Sukkinil ester hızla sulu çözelti içinde hidrolize edilir, böylece çalışma çözeltiler önce dilimlerine uygulamadan hemen hazırlanmalıdır. Dilim Quench Çözüm ACSF 100 mM glisin ile desteklenmiş RIPA Liziz Buffer 10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA,% 1 Triton-X-100,% 0.1 SDS,% 1 Na deoksikolat Proteaz inhibitörleri ile RIPA (RIPA / PI) - günlük taze olun RIPA 1 uM löpeptin, 1 uM pepstatin, 1 uM aprotinin ve 1 mM fenilmetil sülfonil fluorür ile takviye edilmiştir. 1.. Beyin Dilimleri hazırlayın <ol><li> Taze 1x SACSF ve 1x ACSF olun </li><li> Küçük bir beher buz üzerinde SACSF Chill. Bu durum, taze hasat edilmiş fare beyin tutmak için kullanılacaktır. </li><li> % 95 /% 5 O 2 / CO 2, buz üzerinde 20 dakika ile köpüren tarafından oksijen ile ACSF ve SACSF doyurun. </li><li> P30-38 farenin en uygun doku yaşam için kullanılmalıdır. Servikal dislokasyon ve başları kesilerek hayvanların Kurban ve hızla önceden soğutulmuş, oksijenli SACSF içine beyinleri kaldırın. </li><li> Bir titreşimli mikrotom kullanılarak, ilgi bölgesinde 300 mikron beyin bölümleri yapmak. </li><li> Eğer istenirse, dilimleri başka özel beyin bölgeleri veya ayrı sağa sırasıyla, kontrol ve deney dilimleri olarak kullanmak için sol hemisfer zenginleştirmek için önce toparlanmaya disseke edilebilir. </li><li> Bir ateş cilalı Pastör pipeti kullanarak, 24-yuvalı plakalar içine yerleştirilmiş odaları tabanlı bir örgü dilimleri aktarın. </li><li> Dilimleri sürekli, yumuşak kabarcıklarla, oksijenli ACSF, 40 dakika boyunca 31 ° C geri izin verin. </li></ol> 2. İlaç Tedavisi (uygunsa) ve Dilim Biyotinilasyonu <ol><li> Düzelmesinin ardından, önceden ısıtılmış (37 ° C), oksijenli ACSF köpüren sürekli% 95 /% 5 O 2 / CO 2 dilim yıkayın 3x. </li><li> Test bileşikleri ekleyin ve sürekli oksijenasyonu ile kuluçkaya yatmaktadır. <ol><li> Kolaylık sağlamak için, 10x konsantre ilacın 1/10 th ses eklemek, ve hafifçe ters çevirerek karıştırın. </li><li> Yavaşça istenen sıcaklıkta bir su banyosu içinde plakalar çalkalayın. </li></ol></li><li> Ardından ilaç tedavisi, hızlabuz soğuk ACSF 3x yıkayarak soğuk dilimleri. </li></ol> 3. Biotinylate Yüzey Proteinleri <ol><li> Hemen önce etiketlenmesi için buz gibi soğuk ACSF hazırlanması 1.0 mg / ml sülfo-NHS-biyotin-SS. </li><li> Dilimlerine sülfo-NHS-SS-biotin 0.75 ml ekleyin ve buz, 45 dakika dilimleri kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Buz üzerinde buz soğuk ACSF 10 dakika boyunca inkübe edilir, daha sonra buz soğukluğunda ACSF ile hızlı bir şekilde dilimleri üç kez yıkayın. </li><li> Buz dilim söndürme tamponu ile dilimleri üç kez yıkayın ve ücretsiz sülfo-NHS-SS-biotin gidermek için 0.75 ml dilim söndürme tamponu ile buz üzerinde iki kez, 25 dakika, kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> 4. Doku hazırlanması lizatları <ol><li> Buz soğuk ACSF dilimleri üç kez yıkayın ve bir yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak bir mikro tüp her dilim aktarmak. </li><li> Yavaşça 200 xg, 1 dakika ve dikkatle aspire kalan ACSF santrifüj edilerek pelet dilim. </li><li> 400 ul buz gibi soğuk RIPA / PI ekleyin ve yukarı pipetleme dokusu kırmak ve aşağı bir kez P200 pip aracılığıylaette. </li><li> Aktarım, yeni bir tüpe dilim / RIPA liziz ayrılmış ve tamamlamak için, döndürme, 30 dak, 4 ° C inkübe edin. </li><li> Santrifüj ile hücre yıkıntıları pelet haline, 18,000 xg, 15 dakika, 4 ° C </li><li> , Bir standart olarak sığır serum albümini (BSA) ile BCA protein deneyi kullanılarak lisatı, protein konsantrasyonları belirler. </li></ol> 5. Biyotinilat Proteinler izole <ol><li> Boncuk / total protein oranını optimize. Not: Bireysel protein ekspresyon düzeyleri farklı beyin bölgeleri arasında yaygın olarak değişebilir. Doku lisat belirli bir miktarda biyotinile protein her yakalanır sürece, doğru bir yüzeyi ifade herhangi bir potansiyel değişiklikleri tespit etmek mümkün değildir. Bu nedenle, ampirik önce yeni bir dilim biotinilasyon çalışmaya girişmeden belirli bir protein / beyin bölge için en uygun boncuk / total protein oranını tespit etmek zorunludur. <ol><li> Artan miktar 25 ul streptavidin agaroz boncuklar inkübe, yıkama ve elüsyon adımları bağlanma için, aşağıda tarif edildiği gibi doku lisatı (yaklaşık 25-200 ug) ve bir s devam edin. </li><li> Ortaya çıkan immünoreaktif bantlar sayısal olarak ve artan ya da protein ya da azalmış yüzey ifadesi de doğru olarak izin verecek bağlayıcı doğrusal aralığı içinde bir boncuk / lizat oranını seçmek. </li></ol></li><li> Streptavidin-agaroz taneleri hazırlanması <ol><li> Bütün numuneler için gerekli toplam boncuk hacim belirler. 25 ul / numune = 100 ul boncuk + ekstra = 125 ul boncuk bir miktarı için yeterli bir boncuk hacmi artı bir ilave (yani 4 örnekleri hazırlayın. </li><li> Vortex Streptavidin boncuk stok ve pipet dışarı hacmi istenen. P200 pipet kullanarak ederse, tıkanıklık veya boncuk zarar görmesini önlemek için ucu ucuna kesti. </li><li> Oda bir öfke, 18.000 xg, 1 dakika santrifüj edilerek koruyucu, her RIPA eklenmesinden sonra vorteks ve yıkamalar arasında toplama boncuk kaldırmak için 0.5-1.0 ml RIPA / PI boncuk 3 kere yıkayınfaktöörlere. </li><li> Bir vakum şişeye bağlı bir cam Pasteur pipet kullanılarak yıkamalar arasında tampon aspire. Aspire cam Pasteur pipet ucuna takılı plastik P200 ucu ince kontrol sağlar. Bu pipet içine aspirasyon boncuk risk gibi, ilk iki yıkama için kesinlikle bütün tampon kaldırmak için gerekli değildir. Son yıkamadan sonra, boncuklar aspire olmadan mümkün olduğu kadar fazla tamponunu çıkarın. </li><li> Ve tekrar süspansiyon aşağı yukarı pipetleme, geri orijinal hacmi boncuk getirmek RIPA / PI ekleyin. Boncuklar boru duvarına sopa gibi, bu noktada vorteks kaçının. </li><li> Ucu ile bir P200 kullanarak mikrosantrifüj tüpler içine kısım boncuk kesti. Boncuk eşit askıya ve tüpler arasında dağınık kalmasını sağlamak için aşağı örnekleme arasında birkaç kez yukarı pipet ve. </li></ol></li><li> Streptavidin boncuk Bağlama biyotinile edilmiş proteinler <ol><li> Agaroz boncuklar içeren tüplere hücre lizatları dağıtın. Deneyleri için whe<html> Birden çok numune karşılaştırılan yeniden doğru karşılaştırmalar için, her numune için protein aynı miktarda kullanmak için emin olun. </li><li> 200 ul minimum hacme örnekleri getirmek ilave RIPA / PI ekleyin. Bu örnekler inkübasyon sırasında yeterince karıştırmak ve aynı zamanda örnekleri arasında, protein konsantrasyonları birleştiren garanti eder. </li><li> Bir boru rotator tüpler koyun ve 4 ° C&#39;de gece boyunca karıştırın </li><li> Ayrı tüpler içinde, her bir numune için kullanılan toplam lizat hacmi bir eşdeğerine dağıtmak. Numune hacimleri yüksek, alternatif olarak, toplam lizat hacmi bir kısmı SDS-PAGE jelleri üzerinde maksimum yük birimleri yerleştirmek için, bunun yerine ayrılmış olabilir. Bunlar toplam protein miktarı yüzey ekspresyonunu normalize etmek için kullanılacaktır. </li><li> Eşit 2X hacim veya 6x, SDS-PAGE örnek tamponu içinde 1/5 hacim ve ya örnekleri analiz edilinceye kadar -20 ° C&#39;de boncuk numuneleri ya da mağaza paralel olarak, 4 ° C de inkübe ya ekleyin. </li></ol></li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Zehir ve örnekleri analiz <ol><li> Oda sıcaklığında, 18,000 xg, 2 dakika santrifüjleme ile boncuk Pelet. </li><li> Aspire yüzenler ve yıkama boncuk 0.75 ml RIPA&#39;da ile üç kez. Boncuk kaybını en aza indirmek için, yıkamalar arasında boncuk yukarıdaki tampon küçük bir baş hacmini bırakın. Son yıkamadan sonra, boncuk pelet bozmadan, mümkün olduğunca RIPA çıkarın. </li><li> Disülfid bağı azaltarak streptavidin biyotinile edilmiş proteinler boncuklardan Zehir. Örnek tampon, vorteks de azaltarak 25 ul 2x SDS-PAGE ekleyin ve numuneleri 30 dakika, oda sıcaklığını döndürün. Not: Birçok zar proteinleri ciddi şekilde zarar elektroforetik hareketlilik, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde kaynatılmış zaman toplamak için bir yüksek eğilimi vardır. Bu araştırılmaktadır protein için durum ise, ısıtma örnekleri engellemek ve bunun yerine, oda sıcaklığında yavaşça elute. Kaynar (paralel değerlendirilen bir başka protein kaynamasını gerektiriyorsa örneğin) kesinlikle gerekli ise, SAMPLe tampon toplanmasını en aza indirmek için 2 M üre (nihai konsantrasyon) ile takviye edilebilir. Bazı durumlarda toplama azaltılmasında etkili olsa da, üre genellikle grup görünüşe uzlaşma. </li><li> Immunoblot&#39;da örnekleri analiz. </li><li> Toplam lizat örnekleri çözülme ve boncuk numuneleri, 30 dakika, oda sıcaklığı ile paralel olarak döner. </li><li> SDS-PAGE jelleri üzerinde ayrı proteinler. </li><li> Immünolojik işaretleme ile ilgilenilen protein (ler) belirlenmesi. <ol><li> Bantları uygun miktar tespiti için lineer aralığında tespit emin olun. </li><li> Biyotinilasyon reaktif hasarlı / tehlikeye hücreler yoluyla hücre içi proteinlerin erişim elde olmadığını temin etmek. Bu en iyi araştırılan hücre tipine özel bir hücre içi protein için paralel olarak immünolojik işaretleme ile gerçekleştirilir. </li><li> Bant yoğunluğu ölçmek, toplam protein ekspresyon seviyesinin bir yüzdesi olarak görece protein yüzey yoğunluğunu hesaplamak. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+portals+of+entry+into+the+cell.">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li><li>Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Leto, D., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transport+by+insulin:+traffic+control+of+GLUT4.">Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).</li><li>Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+membrane+trafficking+defects+of+disease-associated+dynamin+2+mutations.">Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations.</a> Traffic. 12, 1620-1633 (2011).</li><li>Li, X., DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recycling+endosome+and+its+role+in+neurological+disorders.">The recycling endosome and its role in neurological disorders.</a> Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).</li><li>Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-independent+endocytosis:+mechanisms+and+function.">Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).</li><li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+unplugged:+multiple+ways+to+enter+the+cell.">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Res. 20, 256-275 (2010).</li><li>Barry, M. F., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+trafficking+and+the+plasticity+of+excitatory+synapses.">Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).</li><li>Bredt, D. S., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+at+excitatory+synapses.">AMPA receptor trafficking at excitatory synapses.</a> Neuron. 40, 361-379 (2003).</li><li>Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+synapses+and+the+emergence+of+a+postsynaptic+mechanism+for+LTP.">Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).</li><li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity.">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).</li><li>Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+the+ventral+tegmental+area:+electrophysiological+and+behavioral+correlates+in+individual+rats.">Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats.</a> J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+dopamine+neurons:+Behavioral+correlates+in+GluRA(-/-)+mice.">Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice.</a> PNAS. 101, 14282-14287 (2004).</li><li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+mechanisms+of+addiction:+the+role+of+reward-related+learning+and+memory.">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).</li><li>Thomas, M. J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system.">Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).</li><li>Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+protein+kinase+C-induced+internalization+of+the+dopamine+transporter+is+mediated+by+a+clathrin-dependent+mechanism.">Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism.</a> Traffic. 6, 157-170 (2005).</li><li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical,+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li><li>Melikian, H. E., Buckley, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+regulates+the+activity+of+the+human+dopamine+transporter.">Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter.</a> J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+trafficking+of+the+human+dopamine+transporter.+Clathrin-mediated+internalization+and+lysosomal+degradation+in+response+to+phorbol+esters.">Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters.</a> J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).</li><li>Sorkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+screen+reveals+an+essential+role+of+Nedd4-2+in+dopamine+transporter+ubiquitination+and+endocytosis.">RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis.</a> J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).</li><li>Eriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+dopamine+transporter+trafficking+in+live+neurons+by+use+of+fluorescent+cocaine+analogs.">Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs.</a> J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).</li><li>Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subcellular+distribution+of+endosomal+compartments+and+the+dopamine+transporter+in+dopaminergic+neurons.">Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).</li></ol>

Yazarlar finansal ilgilendiriyor bu çalışma ile bu çatışma var.

Beyinde kritik etkileri sinaptik sinyal endositik kaçakçılığı, kantitatif yetişkin nöronlarda protein yüzey ifade değişikliklerini ölçmek için zor kanıtlamıştır uzun zamandır bilgimiz rağmen. Bu çalışmada, akut beyin dilimleri yüzey proteini ex vivo etiketlemek için güvenilir bir yaklaşım rapor. Sinaptik bağlantıları ve bunların hazırlanması saat sonra hücre canlılığı muhafaza edilmesi gibi beyin dilim hazırlıkları, elektrofizyolojik kayıtlar için yarar bir süredir d...

Endositik ticareti bütün zar proteinlerinin çeşitli plazma zarı tanıtımı ince ayar her yerde bulunan bir hücresel mekanizmadır. Endositozdan sonra hücre içi ortamı 1 için çok önemlidir besin sağlar ve reseptör aktivasyonu 2 tepki olarak reseptör sinyallemesini desensitizes. Geri plazma zarına dönüşüm endositik ek olarak hücre yüzeyinde de 3 protein ekspresyon seviyelerini arttırarak hücre sinyali artırabilir. Ayrıca, membran kaçakçılığı tedirginlikler protein endositik ticaretini yöneten moleküler mekanizmalarının araştırılması gerektiğini vurgulayarak, çok sayıda hastalık ve patolojik koşullarda 4,5 sorumlu tutulmaktadır. Çok protein, son birkaç yıl içinde kanıt montaj klasik klatrin bağımlı içselleştirme mekanizmaları kullanmak da çok klatrin bağımsız endositik mekanizmalar giderek artan bir dizi potansiyel endositik yöneten gösteriyorproteinler 6,7. Böylece, fizyolojik, ilgili sistemlerin ticareti kolaylaştırıcı endositik mekanizmaları araştırmak için ihtiyacı önemli ölçüde büyüdü. Beyinde, reseptörler, iyon kanalları ve nörotransmitter nakliyecilerin endositik kaçakçılığı sinaptik plastisite 8-11 ve sonuçta nöronal heyecanlanabilirliğini ve sinaptik yanıtları etkileyen kötüye 12-15 ilaçlara yanıt kurulmasında başlıca role sahiptir. Nöronal kaçakçılığı çalışmaların çoğunluğu heterolog ekspresyon sistemleri veya kültür birincil nöronlar ya güveniyor Bugüne kadar, ikisi de güvenilir bir yetişkin nöronların oynayan mekanizmaları yansıtıyor olabilir. Burada, sayısal olarak yetişkin kemirgenlerden türetilen akut beyin dilimleri yüzey proteini seviyelerini ölçmek için yüzey biyotinilasyonunu kullanan bir yaklaşım sunulmuştur. Bu yaklaşımı kullanarak, fare striatal dopamin taşıyıcısı hızla re içselleştirilmesini göstermek veri mevcutforbol ester-kaynaklı protein kinaz C (PKC) aktivasyonu için tepkisi uyarma.

<table><tbody><tr><td>sulfo NHS-SS-biotin</td><td>Pierce</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Pierce</td><td>20347</td><td></td></tr><tr><td>IgG-free, Protease-free bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating microtome sectioner</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell mesh-bottomed inserts (8 &amp;micro;m pore size)</td><td>Millipore</td><td>PI8P 012 50</td><td>These can be washed by hand and reused</td></tr></tbody></table>

brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons

Düzenlenmiş endositik kaçakçılığı dinamik bir dakika zaman ölçeğinde reseptör, iyon kanalı, ve taşıyıcı hücre yüzey sunum kontrol ederek, nöromodülasyonundaki etkinlikleri kolaylaştırmak merkezi mekanizmadır. Tek tek proteinlerin endositik kaçakçılığı kontrol eden mekanizmalarla geniş bir çeşitlilik bulunmaktadır. Ticareti moleküler temellerini araştıran çalışmalar öncelikle niceliksel dışsal uyaranlara ve gen manipülasyonu yanıt membran protein yüzey ifadesindeki değişiklikleri ölçmek için yüzey biyotinlasyonu dayanmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım esas olarak aynen yetişkin nöronların oynayan fizyolojik olarak ilgili mekanizmaları yansıtmayabilir kültürlenmiş hücreler, sınırlayıcı edilmiştir. Ayrıca, kültürlü hücre yaklaşımlar ticareti mekanizmaları bölgeye özgü farklılıkları hafife olabilir. Burada, biz akut beyin dilim hazırlanması için hücre yüzey biyotinilasyonunu uzanan bir yaklaşım açıklar. BizBu yöntem, yetişkin nöronların yüzey zar proteini seviyelerindeki hızlı değişiklikleri ölçmek için bir yüksek kalitede bir yaklaşım sağladığını gösterir. Bu yaklaşım nöronal endositik ticareti alanında geniş bir kullanım olması muhtemeldir.

Nöronal dopamin taşıyıcı hücre hatları 16-20 PKC aktivasyonuna karşılık olarak yerleştirilebilir. Hücre dizileri ve ifade sistemlerinin çeşitli kaynaklı PKC DAT yüzey kayıp gösteren çok sayıda raporlara rağmen, bu kültüre, dopaminerjik nöronların 21-23, bu bulguyu teyit etmek zor olmuştur. Biz doğrudan DAT yetişkin dopaminerjik nöronlarda PKC aktivasyonuna karşılık olarak içselleştiren olup olmadığını test etmek için fare striatal dilimleri kullanılır. Dilim...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons at JoVE.com

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Nöronal membran kaçakçılığı dinamik plazma membran proteini kullanılabilirliği ve önemli ölçüde etkiler sinir iletimini kontrol eder. Bugüne kadar, yetişkin nöronlar nöronal endositik ticaretini ölçmek için zor olmuştur. Burada, akut beyin dilimleri yüzey protein ifade ex vivo hızlı değişiklikleri ölçmek için son derece etkili, nicel bir yöntem açıklanmaktadır.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

brain-slice-biotinylation-an-ex-vivo-approach-to-measure-region

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

12.9K Görüntüleme.  University of Massachusetts Medical School.  Nöronal membran kaçakçılığı dinamik plazma membran proteini kullanılabilirliği ve önemli ölçüde etkiler sinir iletimini kontrol eder. Bugüne kadar, yetişkin nöronlar nöronal endositik ticaretini ölçmek için zor olmuştur. Burada, akut beyin dilimleri yüzey protein ifade ex vivo hızlı değişiklikleri ölçmek için son derece etkili, nicel bir yöntem açıklanmaktadır. 

Video: Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Biyokimya

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Nörobilim

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Biyoloji

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing patterns. The inclusion of biocytin/neurobiotin in the recording electrode permits post-hoc recovery of morphological details, which are necessary to determine the dendritic arborization and the regions targeted by the axons of the recorded neurons. However, given the presence of morphologically similar neurons with distinct neurochemical identities and functions, immunohistochemical staining for cell-type-specific proteins is essential to definitively identify neurons. To maintain network connectivity, brain sections for physiological recordings are prepared at a thickness of 300 &#181;m or greater. However, this thickness often hinders immunohistological postprocessing due to issues with antibody penetration, necessitating the resectioning of the tissue. Resectioning of slices is a challenging art, often resulting in the loss of tissue and morphology of the cells from which electrophysiological data was obtained, rendering the data unusable. Since recovery of morphology would limit data loss and guide in the selection of neuronal markers, we have adopted a strategy of recovering cell morphology first, followed by secondary immunostaining. We introduce a practical approach to biocytin filling during physiological recordings and subsequent serial immunostaining for the recovery of morphology, followed by the restaining of sections to determine the neurochemical identity. We report that sections that were filled with biocytin, fixed with paraformaldehyde (PFA), stained, and coverslipped can be removed and restained with a second primary antibody days later. This restaining involves the removal of the coverslip, the washing of sections in a buffer solution, and the incubation of primary and secondary antibodies to reveal the neurochemical identity. The method is advantageous for eliminating data loss due to an inability to recover morphology and for narrowing down the neurochemical markers to be tested based on morphology.

This protocol presents a method for the morphological recovery of neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin filling and subsequent immunohistochemical postprocessing. We show that thick biocytin-filled sections that were stained and coverslipped can be restained with a second primary antibody days&#160;or months later.

Nörokimyasal markerleri Biocytin dolu ve İşlenmiş Bölümler immün

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in monoamine neurotransmitter release and uptake dynamics. Technically complex methods such as electrophysiology, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), imaging, in vivo&#160;microdialysis, optogenetics, or use of radioactivity are required to study monoamine function. The method presented here is an optimized two-step approach for detecting monoamine release in acute brain slices using a 48-well plate containing tissue holders for examining monoamine release, and high-performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection (HPLC-ECD) for monoamine release measurement. Briefly, rat brain sections containing regions of interest, including prefrontal cortex, hippocampus, and dorsal striatum were obtained using a tissue slicer or vibratome. These regions of interest were dissected from the whole brain and incubated in an oxygenated physiological buffer. Viability was examined throughout the experimental time course, by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The acutely dissected brain regions were incubated in varying drug conditions that are known to induce monoamine release through the transporter (amphetamine) or through the activation of exocytotic vesicular release (KCl). After incubation, the released products in the supernatant were collected and analyzed through an HPLC-ECD system. Here, basal monoamine release is detected by HPLC from acute brain slices. This data supports previous in vivo and in vitro results showing that AMPH and KCl induce monoamine release. This method is particularly useful for studying mechanisms associated with monoamine transporter-dependent release and provides an opportunity to screen compounds affecting monoamine release in a rapid and low-cost manner.

This method introduces a simple technique for the detection of endogenous monoamine release using acute brain slices. The setup uses a 48-well plate containing a tissue holder for monoamine release. Released monoamine is analyzed by HPLC coupled with electrochemical detection. Additionally, this technique provides a screening method for drug discovery.

Akut Beyin Dilimlerinde Endojen Monoamin Salınımının Ölçümü için Plaka Bazlı Bir Tahlil

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Evaluating the Effect of Chronic Stress on Cell Surface GABAA Receptor Presentation in the Rodent Brain

Anxiety is a state of emotion that variably affects animal behaviors, including cognitive functions. Behavioral signs of anxiety are observed across the animal kingdom and can be recognized as either adaptive or maladaptive responses to a wide range of stress modalities. Rodents provide a proven experimental model for translational studies addressing the integrative mechanisms of anxiety at the molecular, cellular, and circuit levels. In particular, the chronic psychosocial stress paradigm elicits maladaptive responses mimicking anxiety-/depressive-like behavioral phenotypes that are analogous between humans and rodents. While previous studies show significant effects of chronic stress on neurotransmitter contents in the brain, the effect of stress on neurotransmitter receptor levels is understudied. In this article, we present an experimental method to quantitate the neuronal surface levels of neurotransmitter receptors in mice under chronic stress, especially focusing on gamma-aminobutyric acid (GABA) receptors, which are implicated in the regulation of emotion and cognition. Using the membrane-impermeable irreversible chemical crosslinker, bissulfosuccinimidyl suberate (BS3), we show that chronic stress significantly downregulates the surface availability of GABAA receptors in the prefrontal cortex. The neuronal surface levels of GABAA receptors are the rate-limiting process for GABA neurotransmission and could, therefore, be used as a molecular marker or a proxy of the degree of anxiety-/depressive-like phenotypes in experimental animal models. This crosslinking approach is applicable to a variety of receptor systems for neurotransmitters or neuromodulators expressed in any brain region and is expected to contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying emotion and cognition.

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Evaluating the Effect of Chronic Stress on Cell Surface GABAA Receptor Presentation in the Rodent Brain

The BS3 chemical crosslinking assay reveals reduced cell surface GABAA receptor expression in mouse brains under chronic psychosocial stress conditions.

BS3 Kimyasal Çapraz Bağlama Testi: Kemirgen Beyninde Kronik Stresin Hücre Yüzeyi GABAA Reseptör Sunumu Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi

Anxiety is a state of emotion that variably affects animal behaviors, including cognitive functions. Behavioral signs of anxiety are observed across the ...

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir