Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse DA15169 und DA035224 zu HEM finanziert

Alle Tierbehandlung und Gewebe Ernte wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care Use Committee (IACUC) durchgeführt, nach dem genehmigten Protokoll # A1506 (Melikian, PI). Benötigte Lösungen Künstliche Liquor (ACSF) - Machen Sie täglich frisch 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO 3 und 11 mM Glucose Hinweis: Bereiten ACSF als 10x Stammlösung, ohne NaHCO 3 und Glucose. Machen 1x Arbeitslösungen täglich aus dem 10fach, in Ergänzung mit frischen NaHCO 3 und Glucose. Saccharose-ergänzt ACSF (SACSF) - Stellen täglich frisch 250 mM ErfolgRose, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO 3 und 11 mM Glucose Hinweis: Bereiten SACSF als 10x Stammlösung, ohne NaHCO 3 und Glucose. Machen 1x Arbeitslösungen täglich aus dem 10fach, in Ergänzung mit frischen NaHCO 3 und Glucose. Sulfo-N-Hydroxysuccinyl-SS-Biotin (Sulfo-NHS-SS-Biotin, Pierce Chemical Company) Auf Lösungen sollten 200 mg / ml in DMSO und sind resistent gegen mehrere Einfrieren / Auftauen. Aliquots werden bei -20 ° C gelagert Die Succinylester schnell in wässriger Lösung hydrolysiert, so Arbeits Lösungen sollten unmittelbar vor dem Aufbringen auf Scheiben hergestellt werden. Scheibe Quench-Lösung ACSF mit 100 mM Glycin supplementiert RIPA Lyse Buffer 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Na-Desoxycholat RIPA mit Protease-Inhibitoren (RIPA / PI) - Machen Sie täglich frisch RIPA ergänzt mit 1 &amp;mgr; M Leupeptin, 1 &amp;mgr; M Pepstatin, 1 &amp;mgr; M Aprotinin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid. 1. Bereiten Hirnschnitten <ol><li> Stellen Sie frische 1x SACSF und 1x ACSF </li><li> Chill-SACSF auf Eis in einem kleinen Becherglas. Dies wird verwendet, um die frisch geernteten Gehirn der Maus zu halten. </li><li> Tränken Sie das ACSF und SACSF mit Sauerstoff durch Blasenbildung mit 95% / 5% O 2 / CO 2, 20 min auf Eis. </li><li> P30-38-Mäuse sollten für eine optimale Gewebelebensfähigkeit verwendet werden. Sacrifice Tiere durch Genickbruch und Enthauptung, und das Gehirn wird rasch zu entfernen, in vorgekühlte, sauerstoff SACSF. </li><li> Mit Hilfe eines vibrierenden Mikrotom, stellen 300 um Gehirnschnitte in der Region von Interesse. </li><li> Falls gewünscht, können weitere Scheiben vor der Verwertung zerlegt werden, um für bestimmte Hirnregionen oder separaten rechten und linken Hemisphäre als Kontroll-und Versuchsscheiben zu verwenden, bzw. zu bereichern. </li><li> Mit einem feuerpolierten Pasteur Pipette Scheiben Kammern in 24-Well-Platten gesetzt Boden eingreifen. </li><li> Lassen Scheiben für 40 min in Sauerstoff angereichert ACSF erholen, 31 ° C, mit ständigen, sanfte Blubbern. </li></ol> 2. Drug Treatment (falls zutreffend) und Scheibe Biotinylierung <ol><li> Nach der Erholung, waschen Scheiben 3x in vorgewärmten (37 ° C), sauerstoff ACSF sprudelnden ständig mit 95% / 5% O 2 / CO 2. </li><li> In Testverbindungen und Inkubation mit kontinuierlicher Sauerstoffversorgung. <ol><li> Für die Bequemlichkeit, einen 1/10 Volumen 10x konzentrierter Droge, und mischen durch vorsichtiges Umdrehen. </li><li> Schütteln Platten vorsichtig in einem Wasserbad bei der gewünschten Temperatur. </li></ol></li><li> Nach der medikamentösen Behandlung, schnellChill-Scheiben durch Waschen 3x in eiskalter ACSF. </li></ol> 3. Biotinylieren Oberflächenproteine <ol><li> Planen 1,0 mg / ml Sulfo-NHS-SS-Biotin in eiskaltem ACSF unmittelbar vor der Etikettierung. </li><li> In 0,75 ml Sulfo-NHS-SS-Biotin an Scheiben Scheiben und Inkubation auf Eis, 45 min. </li><li> Dreimal waschen Scheiben schnell mit eiskaltem ACSF, dann Inkubation für 10 min in eiskaltem ACSF auf Eis. </li><li> Scheiben waschen dreimal mit eiskaltem Scheibe Quenchpuffer und Inkubation mit 0,75 ml Scheibe Quenchpuffer zwei Mal, 25 min, auf Eis, freie Sulfo-NHS-SS-Biotin zu stillen. </li></ol> 4. Bereiten Gewebelysaten <ol><li> Dreimal waschen Scheiben in eiskalter ACSF und übertragen jede Scheibe zu einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer feuerpolierten Pasteurpipette. </li><li> Pellet vorsichtig Scheibe durch Zentrifugation 200 g, 1 min und sorgfältig absaugen restlichen ACSF. </li><li> In 400 ul eiskaltem RIPA / PI und brechen Gewebe durch Auf-und Abpipettieren einmal durch eine P200 pipette. </li><li> Über dissoziiert Slice / RIPA in ein frisches Röhrchen und Inkubation 30 min, 4 ° C, Drehen, um die Lyse zu vervollständigen. </li><li> Pelletierung von Zelltrümmern durch Zentrifugation, 18.000 x g, 15 min, 4 ° C </li><li> Proteinkonzentrationen bestimmen Lysat unter Verwendung des BCA-Proteinassay mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard. </li></ol> 5. Isolieren biotinylierter Proteine <ol><li> Optimieren Bead / Gesamtprotein-Verhältnis. Hinweis: Einzelne Proteinexpressionsniveaus kann weit in den verschiedenen Hirnregionen unterschiedlich. Wenn nicht alle der biotinylierten Proteinen in einer gegebenen Menge von Gewebelysat erfasst, ist es nicht möglich, alle möglichen Veränderungen in der Oberflächenexpression genau zu erfassen. Daher ist es zwingend notwendig, um empirisch bestimmen die optimale Perlen / Gesamtproteinverhältnis für ein bestimmtes Protein / Hirnregion vor der Einschiffung auf eine neue Scheibe Biotinylierung Studie. <ol><li> Inkubation 25 ul Streptavidin-Agarose-Beads mit zunehmender Menges Gewebelysat (ungefähren Bereich von 25 bis 200 ug) und dann gehen Sie wie folgt für die Bindung, Waschen und Elution Schritten beschrieben. </li><li> Quantifizierung der resultierenden immunreaktiven Banden und wählen Sie eine Perle / Lysat-Verhältnis im linearen Bereich der Bindung, die genaue Quantifizierung von entweder erhöht oder verringert Protein-Oberflächenexpression ermöglichen. </li></ol></li><li> Bereiten Streptavidin-Agarose Beads <ol><li> Bestimmen Sie die Gesamt Wulst Volumen für alle Proben notwendig. Eine ausreichende Schweißnahtvolumen für diesen Betrag plus ein zusätzliches (dh 4 Proben bei 25 ul / Probe = 100 ul Perlen + ein extra = 125 ul Perlen. </li><li> Vortex Streptavidin Wulst Lager und Pipette heraus gewünschte Lautstärke. Bei Verwendung eines P200 Pipette, schneiden Sie das Ende der Spitze zu einer Verstopfung oder Wulst Schäden zu verhindern. </li><li> Waschen Sie Perlen 3-mal in 0,5 bis 1,0 ml RIPA / PI Konservierungsmittel, Verwirbelung nach jedem RIPA hinaus und sammeln Perlen zwischen den Waschgängen durch Zentrifugation 18.000 xg, 1 min zu entfernen, bei Raumtemperaturratur. </li><li> Absaugen Puffer zwischen den Waschgängen mit einem Glas-Pasteur-Pipette auf eine Vakuumflasche angebracht. Ein Kunststoff-P200 Spitze bis zum Ende der Glaspasteurpipette befestigt bietet feinere Kontrolle beim Ansaugen. Es ist nicht unbedingt notwendig, alle Puffer für die ersten zwei Waschungen entfernen, da es Risiken Ansaugen Kügelchen in die Pipette. Nach dem letzten Waschen, zu entfernen, so viel überschüssigen Puffer wie möglich ohne Absaugen der Perlen. </li><li> In RIPA / PI, um Perlen wieder in ihre ursprüngliche Volumen zu bringen, und Abpipettieren zu resuspendieren. Vermeiden Verwirbelung an dieser Stelle, als Perlen werden an der Rohrwand haften. </li><li> Aliquot Perlen in Mikrozentrifugenröhrchen mit einem P200 mit der Spitze abgeschnitten. Pipette nach oben und unten mehrmals zwischen der Probenahme zu gewährleisten, Perlen bleiben gleichmäßig suspendiert und unter den Röhrchen verteilt. </li></ol></li><li> Bind biotinylierten Proteine ​​Streptavidin-Perlen <ol><li> Verteilen Zelllysate auf die Rohre, die die Agarose-Perlen. Für Experimente whe<html> re mehrere Proben verglichen werden, stellen Sie sicher, um die gleiche Menge an Protein für jede Probe für genaue Vergleiche zu verwenden. </li><li> Fügen Sie zusätzliche RIPA / PI, um Proben zu einem minimalen Volumen 200 ul zu bringen. Dies gewährleistet, dass die Proben während der Inkubation ausreichend zu mischen und auch vereinheitlicht die Proteinkonzentrationen in Proben. </li><li> Die Röhrchen in ein Rohr Rotator und über Nacht mischen bei 4 ° C </li><li> In getrennten Röhrchen, verzichtet werden ein Äquivalent des gesamten Lysats Volumen für jede Probe verwendet. Alternativ, wenn die Probenmengen hoch sind, ein Bruchteil des gesamten Lysats Volumen anstelle reserviert werden, um die maximale Ladevolumen auf SDS-PAGE-Gelen unterzubringen. Diese werden verwendet, um die Oberflächenexpression auf die Gesamtproteinmenge zu normalisieren. </li><li> Fügen Sie entweder das gleiche Volumen 2x oder 1/5 Vol. 6x SDS-PAGE-Probenpuffer und Inkubation entweder bei 4 ° C, parallel zu Wulst Proben oder bei -20 ° C bis Proben analysiert. </li></ol></li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Elute und Analysieren von Proben <ol><li> Beads durch Zentrifugation pelle 18.000 × g, 2 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand wird abgesaugt und Waschperlen dreimal mit 0,75 ml RIPA. Um Wulst Verlust zu minimieren, lassen einen kleinen Kopf Volumen Puffer oben Perlen zwischen Wäschen. Nach dem letzten Waschen, zu entfernen, so viel wie möglich RIPA, ohne dass der Wulst Pellets. </li><li> Eluiere biotinylierten Proteine ​​aus Streptavidin-Kügelchen durch die Reduzierung der Disulfidbrücke. In 25 ul 2x SDS-PAGE-Probenpuffer reduziert, Vortex gut und drehen Proben 30 min, Raumtemperatur. Anmerkung: Viele Membranproteine ​​haben eine hohe Tendenz zu aggregieren, wenn sie in SDS-PAGE-Probenpuffer gekocht, deren elektrophoretische Mobilität stark beeinträchtigen. Wenn dies der Fall für das Protein untersucht wird, zu vermeiden Erhitzen von Proben und stattdessen eluieren bei Raumtemperatur langsam. Wenn kochendem absolut notwendig ist (zB wenn ein anderes Protein parallel beurteilt erfordert Sieden), samplE-Puffer mit 2 M Harnstoff (Endkonzentration) ergänzt werden, um die Aggregation zu minimieren. Während bei der Verringerung Aggregation in einigen Fällen Harnstoff oft Kompromisse Band Auftritte. </li><li> Analysieren Sie die Proben durch Immunoblot. </li><li> Auftauen Gesamt Lysatproben und drehen parallel Wulst Proben, 30 min, Raumtemperatur. </li><li> Getrennte Proteine ​​auf SDS-PAGE-Gelen. </li><li> Identifizieren Protein (e) von Interesse durch Immunoblotting. <ol><li> Seien Sie sicher, dass die Bänder im linearen Bereich der Detektion für die richtige Quantifizierung detektiert. </li><li> Um sicherzustellen, daß das Biotinylierungsreagenz hat keinen Zugang zu intrazellulären Proteinen durch beschädigte / gefährdeten Zellen gewonnen. Dies wird am besten durch Immunoblotting parallel zu einem intrazellulären Protein spezifisch für den Zelltyp untersucht erreicht. </li><li> Quantifizieren Band Dichten und berechnen relative Proteinoberflächendichte in Prozent des Gesamtproteinexpressionsniveau. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keine finanziellen Interessen, dass Konflikte mit dieser Arbeit.

Trotz langjährige Wissen, dass endozytischen Handel kritisch Auswirkungen synaptischen Signal im Gehirn, hat es schwierig, quantitativ Veränderungen in der Proteinoberflächen-Expression in adulten Neuronen messen bewährt. In dieser Arbeit, einen zuverlässigen Ansatz zur Oberflächenprotein ex vivo in akuten Hirnschnitten beschriften berichten wir. Hirnschnittpräparate haben eine langjährige Geschichte der Nutzen für elektrophysiologischen Ableitungen, wie sie synaptischen Verbindungen und die Lebensfäh...

Endozytischen Handel ist ein allgegenwärtiges zellulären Mechanismus, der die Feinabstimmung des Plasmamembran Präsentation einer Vielzahl von integralen Membranproteinen. Endozytose liefert lebenswichtige Nährstoffe, um die intrazelluläre Milieu 1 und desensibilisiert-Rezeptor-Signal als Reaktion auf 2-Rezeptor-Aktivierung. Endocytotischen Recycling zurück in die Plasmamembran erhöhen zusätzlich zelluläre Signalgebung durch Erhöhung der Proteinexpressionsniveaus an der Zelloberfläche 3. Darüber hinaus sind Membrantransport Störungen in zahlreichen Krankheiten und pathologischen Bedingungen 4,5 verwickelt, und betonte die Notwendigkeit, die molekularen Mechanismen, die Protein endozytischen Handel regieren zu untersuchen. Während viele Proteine ​​nutzen klassische Clathrin-abhängigen Internalisierung Mechanismen, Anzeichen dafür in den vergangenen Jahren zeigt, dass mehrere Clathrin-unabhängige Mechanismen endozytischen regeln die endozytischen Potential einer wachsenden Palette vonProteine ​​6,7. So hat die Notwendigkeit, endozytischen Mechanismen für Menschenhandel in physiologisch relevanten Systemen zu untersuchen stark gewachsen. Im Gehirn hat endozytischen Handel von Rezeptoren, Ionenkanäle und Neurotransmitter-Transporter eine primäre Rolle bei der Gründung der synaptischen Plastizität 8-11 und der Reaktion auf Drogen 12-15, letztlich Auswirkungen auf die neuronale Erregbarkeit und synaptischen Antworten. Bis heute hat die Mehrheit der neuronalen Handel Studien entweder heterologen Expressionssystemen oder kultivierten primären Nervenzellen verlassen können, von denen weder zuverlässig reflektieren Mechanismen eine Rolle spielen bei erwachsenen Neuronen. Hier ein Ansatz, der Biotinylierung Oberfläche verwendet, um quantitativ Oberflächenproteinspiegel in akuten Hirnschnitten von erwachsenen Nagern abgeleitet messen berichten wir. Mit diesem Ansatz können Daten, die zeigen, dass die Maus striatale Dopamin-Transporter schnell verinnerlicht in re präsentieren wirReaktion auf Phorbolester-vermittelte Protein-Kinase C (PKC).

<table><tbody><tr><td>sulfo NHS-SS-biotin</td><td>Pierce</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Pierce</td><td>20347</td><td></td></tr><tr><td>IgG-free, Protease-free bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating microtome sectioner</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell mesh-bottomed inserts (8 &amp;micro;m pore size)</td><td>Millipore</td><td>PI8P 012 50</td><td>These can be washed by hand and reused</td></tr></tbody></table>

brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons

Geregelte endozytischen Handel ist der zentrale Mechanismus erleichtert eine Vielzahl von neuromodulatorischen Veranstaltungen, die von dynamischen Steuerung Rezeptor-Ionenkanal und Transporter Zelloberfläche Präsentation auf einem Minuten-Zeitskala. Es gibt eine breite Vielfalt von Mechanismen, die endozytischen Handel einzelner Proteine ​​steuern. Studien zur Untersuchung der molekularen Grundlagen von Menschenhandel wurden in erster Linie auf die Oberfläche Biotinylierung verlassen, um quantitativ Veränderungen in der Membranproteinoberfläche messen Ausdruck als Reaktion auf exogene Reize und Gen-Manipulation. Allerdings wurde dieser Ansatz vor allem auf kultivierten Zellen, die nicht treu die physiologisch relevanten Mechanismen im Spiel bei erwachsenen Neuronen spiegeln kann begrenzt. Darüber hinaus kann kultivierten Zell Ansätze regionsspezifische Unterschiede in Handel Mechanismen unterschätzen. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der Zelloberfläche Biotinylierung der akuten Hirnschnittpräparat erstreckt. Wirzeigen, dass diese Methode bietet eine High-Fidelity-Ansatz zur schnellen Veränderungen in der Membranproteinoberfläche Ebenen bei erwachsenen Nervenzellen messen. Dieser Ansatz dürfte eine breite Dienstprogramm auf dem Gebiet der neuronalen endozytischen Handel zu haben.

Die neuronale Dopamintransporter wird in Reaktion auf PKC-Aktivierung in Zelllinien 16-20 internalisiert. Obwohl viele Berichte zeigen PKC-induzierte DAT Oberflächenverluste in einer Vielzahl von Zelllinien und Expressionssystemen ist es schwierig gewesen, diese Feststellung in kultivierten dopaminergen Neuronen 21-23 bestätigen. Wir verwendeten Maus Striatum Scheiben direkt zu testen, ob DAT verinnerlicht als Reaktion auf PKC-Aktivierung in der Erwachsenen dopaminergen Neuronen. Folgende Schnitt...

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Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Neuroscience

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

12.9K Aufrufe.  University of Massachusetts Medical School.  Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen. 

Serie: Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Forschung

Biochemie

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Neurowissenschaften

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Biologie

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular mechanisms of synaptic plasticity. Long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) induced in acute hippocampal slices are widely accepted as cellular models of learning and memory. There are numerous studies that use live cell imaging or immunohistochemistry approaches to visualize activity dependent protein dynamics. However these methods rely on the suitability of antibodies for immunocytochemistry or overexpression of fluorescence-tagged proteins in single neurons. Immunoblotting of proteins is an alternative method providing independent confirmation of the findings.&#160;The first limiting factor in preparation of subcellular fractions from individual tetanized hippocampal slices is the low amount of material. Second, the handling procedure is crucial because even very short and minor manipulations of living slices might induce activation of certain signaling cascades. Here we describe an optimized workflow in order to obtain sufficient quantity of nuclear enriched fraction of sufficient purity from the CA1 region of acute hippocampal slices from rat brain. As a representative example we show that the ERK1/2 phosphorylated form of the synapto-nuclear protein messenger Jacob actively translocates to the nucleus upon induction of LTP and can be detected in a nuclear enriched fraction from CA1 neurons.

We provide a detailed protocol for induction of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampus and the subsequent isolation of nuclear enriched fractions from the tetanized area of the slice. This approach can be used to determine activity dependent nuclear protein import in cellular models of learning and memory.

Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine ​​Studieren

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing patterns. The inclusion of biocytin/neurobiotin in the recording electrode permits post-hoc recovery of morphological details, which are necessary to determine the dendritic arborization and the regions targeted by the axons of the recorded neurons. However, given the presence of morphologically similar neurons with distinct neurochemical identities and functions, immunohistochemical staining for cell-type-specific proteins is essential to definitively identify neurons. To maintain network connectivity, brain sections for physiological recordings are prepared at a thickness of 300 &#181;m or greater. However, this thickness often hinders immunohistological postprocessing due to issues with antibody penetration, necessitating the resectioning of the tissue. Resectioning of slices is a challenging art, often resulting in the loss of tissue and morphology of the cells from which electrophysiological data was obtained, rendering the data unusable. Since recovery of morphology would limit data loss and guide in the selection of neuronal markers, we have adopted a strategy of recovering cell morphology first, followed by secondary immunostaining. We introduce a practical approach to biocytin filling during physiological recordings and subsequent serial immunostaining for the recovery of morphology, followed by the restaining of sections to determine the neurochemical identity. We report that sections that were filled with biocytin, fixed with paraformaldehyde (PFA), stained, and coverslipped can be removed and restained with a second primary antibody days later. This restaining involves the removal of the coverslip, the washing of sections in a buffer solution, and the incubation of primary and secondary antibodies to reveal the neurochemical identity. The method is advantageous for eliminating data loss due to an inability to recover morphology and for narrowing down the neurochemical markers to be tested based on morphology.

This protocol presents a method for the morphological recovery of neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin filling and subsequent immunohistochemical postprocessing. We show that thick biocytin-filled sections that were stained and coverslipped can be restained with a second primary antibody days&#160;or months later.

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A reproducible protocol was developed to directly&#160;mono-biotinylate BDNFAvi with the enzyme BirA in a tube. In this reaction, mono-biotinylated BDNFAvi retains its biological activity.
Neurotrophins are target-derived growth factors playing a role in neuronal development and maintenance. They require rapid transport mechanisms along the endocytic pathway to allow long-distance signaling between different neuronal compartments. The development of molecular tools to study the trafficking of neurotrophins has enabled the precise tracking of these proteins in the cell using in vivo recording. In this protocol, we developed an optimized and cost-effective procedure for the production of mono-biotinylated BDNF. A recombinant BDNF variant containing a biotinylable avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in the microgram range and then purified in an easily scalable procedure using affinity chromatography. The purified BDNF can then be homogeneously mono-biotinylated by a direct in vitro reaction with the enzyme BirA in a tube. The biological activity of the mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) can be conjugated to streptavidin-conjugated to different fluorophores. BDNFAvi and mbtBDNF retain their biological activity demonstrated through the detection of downstream phosphorylated targets using western blot and activation of the transcription factor CREB, respectively. Using streptavidin-quantum dots, we were able to visualize mbtBDNF internalization concomitant with activation of CREB, which was detected with a phospho-CREB specific antibody. In addition, mbtBDNF conjugated to streptavidin-quantum dots was suitable for retrograde transport analysis in cortical neurons grown in microfluidic chambers. Thus, in tube produced mbtBDNF is a reliable tool to study physiological signaling endosome dynamics and trafficking in neurons.

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in a cost-effective manner and is purified by affinity chromatography. BDNFavi is then directly mono-biotinylated with the enzyme BirA in a tube. BDNFavi and mono-biotinylated BDNFavi retain their biological activity when compared to commercially available BDNF.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine

Zusammenfassung

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Gehirn Membran Fraktionierung: An

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine Studieren

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Ein verbessertes Protokoll zur Reinigung und direkt Mono-Biotinylat Rekombinanten BDNF in einer Tube für Zelllandhandel Studien in Neuronen

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine

Zusammenfassung

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Gehirn Membran Fraktionierung: An

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine ​​Studieren

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Ein verbessertes Protokoll zur Reinigung und direkt Mono-Biotinylat Rekombinanten BDNF in einer Tube für Zelllandhandel Studien in Neuronen

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine Studieren