Name: subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

나는 공 초점 현미경, 두 번째 Axopatch 200B 앰프의 선물 박사 자크 정해지다은 GIGA-영상과 조언에 대한 그의 지속적인 지원을위한 박사 빈센트 Seutin, 크리스 Gillissen과 우수한 기술 지원 로랑 Massotte, 박사 진 Defourny와 산드라 Ormenese 감사합니다 비판적 원고를 읽기 위해 공 초점 현미경 및 Imaris 소프트웨어 및 박사 스티븐 프리먼 공유를위한 플랫폼입니다. 이 작품은 벨기에 FRS에서 보조금에 의해 지원되었다 - FNRS (U.N002.13 및 T.N0015.13)와 벨기에 대학 재단의 지원 (Publié AVEC 르 콩쿠르 드 라 파운데이션 부문 Universitaire 드 벨기에 (프랑스어))를 발표했다.

저자는 그가 더 경쟁 재정적 이익을 가지고 있지 함을 선언합니다.

이 보고서는 듀얼 somatodendritic 전체 셀 녹음 및 지방 수상 기록을 구현하기위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 그것은 각각 시냅스 후 전위의 시간 경과에 이온 채널 (즉, I 높이)의 영향을 결정하고 흑색질 DA 뉴런의 somatodendritic 도메인 따라 이온 채널 (I 높이)의 분포를 매핑하는데 유용하다. 그 결과 전기 생리 측정은 세포 형태를 복구하기 위해 특별 조직 화학을 게시 결합된다. 절차는 흑색질에있는 DA 신경을 조사하기 위해 사용되었지만, 인접 흑색질 GABA 뉴런, 복측 피개 영역 DA 신경이나 중뇌 신경 대해 일반화 될 수있다. 모든 단계가 중요 수정없이 흑색질 신경 세포의 수상 돌기에 표현 된 다른 이온 채널을 검사 따라 할 수있다. 사후 시각화 축삭 베어링과 신경 세포에 특히 관련입니다이러한 흑색질 신경 세포 25, 26, 해마 oriens-alveus의의 interneurons 21 일부 CA1 피라미드 뉴런 (67) 등의 수상 돌기. 흥미롭게도,이 기능을 공유하는 신경 세포는 일반적으로 67 생각했던 것보다 더 일반적인 것 같다. 형태 학적 분석은 또한 전극과 축삭의 정확한 위치를 알 수있다. 후자의 면역 검출 68,69을 이용 축삭 초기 세그먼트 (전압 - 게이트 나 + 채널 또는 Ankyrin G)에서 발현 된 단백질의 라벨에 의해 최적화 될 수있다. 수지상 녹음 이후의 연결 라벨과 수집 된 데이터의 신뢰성은 변함없이 조각의 품질에 따라 달라집니다. 최대 노력이 필요하므로 조직 내 세포의 생존을 유지하기 위해 적용된다. 이는 슬라이스의 제조 건강한 동물 걸쳐 고품질 도구 및 시약 조직 빙냉 온도 충분한 산소 부드러운 핸들링 달성. 안정된 기록 조건 건강한 신경 세포의 선택에 의존한다. 전체 세포 모드에서, 직렬 저항은 처음에는 가능한 한 낮게하고, 실험 전반에 걸쳐 일정하게 유지한다. 녹음의 안정성은 드리프트과 진동없는 높은 품질의 조종에 더 의존한다. 피펫 홀더와의 연결을 확인하고 headstage하는 미세 조작기 케이블 슬랙 것을 제어하는 ​​온도 스테이지 이동의 급격한 변화를 방지하여 머니퓰레이터의기구에 의하면 이러한 교란은 피펫 안정성을 최적화함으로써 감소 될 수있다. 이중 기록 들어 메틸 설페이트 13,15,21는 세포 내 용액에 포함되었지만, 글루코 9,14,25 대안으로 사용될 수있다. 그러나, 주요 음이온 (70, 71) 전위 막의 일부 전압 의존 전류 (72)를 변경할 수있다. 세포 내 용액은 ATP, GTP와 physiolo을 유지하기 크레아틴 인산 보충 할 수있다신경 학적 기능을합니다. 인스턴스가 압력 응용 프로그램을 배치 할뿐만 아니라, 피펫 용액에 형광 염료를 추가 (예를 들어, 알렉사 594 또는 Sulforhodamine 101 41)가 도움이 될 수있는 체세포 기록하는 동안 수상 돌기를 시각화 (참조 그림 7. 41) 또는 전기 자극을 피펫. 세포 부착 녹음 용 피펫 솔루션은 대형 I의 시간을 기록하는 높은 K + 농도와 더 나 +가 포함되어 있습니다. 주목할 나 + / K + 농도 비는 전류 진폭 (10), 전류 (11)의 반전 전위 I의 H (73)의 게이트에 영향을 미친다. 또한, 나는 시간은 외부 아웃 (10)를 사용하여 기록 할 수 있습니다. 그러나이 기록 구성에서, 채널에 근접하여 세포 내 환경을 교란 할 수있다. 따라서, I의 전압 - 의존적 활성화의 차이 &lt;비교 전류가 세포 부착 된 패치 및 외부 아웃 (10)를 사용하여 얻은 경우 서브&gt; 시간이 관찰된다. 뉴런의 붓기는 때때로 패치 클램프 녹음 중에 발생하고, 종종 솔루션의 구성에 솔루션을 39 또는 오류 인트라와 세포 사이의 물 품질이 낮은 강한 불균형 삼투압이나 pH를 같이 별개의 원인으로 발생한다. 전기 생리 레코딩의 품질 회수 뉴런의 형태의 품질에 대한 직접 입사있다. 세포 내 환경 (14)의 희석을 최소화하기 위해 세포 부착 녹음 후 - (참고 문헌에서 6,11로, 10 MΩ. 6) 및 하나의 체세포 녹음에 대한 높은 저항 체세포 피펫 듀얼 레코딩에 사용됩니다. 셀에 연결된 기록 다음 전체 세포 체세포 기록 따라서 짧은 (&lt;10 분)로 유지된다. 체세포와 수지상 모두 피펫에서 외부 아웃 패치는 C의 적절한 폐쇄에 필수적이다엘 멤브레인 및 세포 형태의 이후의 복구. 세포의 구조뿐만 아니라, 신경 화학적 콘텐츠 기록 뉴런 59,74 대해 결정될 수있다. 예를 들어, 세포 내 단백질 티로신 수산화 효소는 DA 신경 (13)의 명확한 식별 immunolabeled 수있다. DA 신경 주로 SN에 집중되어 것은 SN 존재 훨씬 낮은 밀도, compacta을 갈 거예요 그들이 GABA 뉴런 (75)의 높은 수와 혼합되어 reticulata을 갈 거예요. DA 신경 세포의 세포체는 GABA 뉴런보다 종종 더 큰 반면, IR-videomicroscopy 이러한 세포의 시각적 식별 불확실 부분적 유리체의 compacta의 불투명도에 의해 방해된다. 이러한 제한을 피하기 위해, DA 신경의 예비 선택은 뉴런 (DA 신경 대한 TH 65 DAT, GAD 특정 인구 형광 마커를 발현하는 형질 전환 마우스를 이용하여 용이하게 할 수있다GABA 신경 세포) 및 표면 형광 조명. 대안 적으로, 형광 염료가 덴 드라이트의 시각화를 용이하게하기 위해 체세포 전극 용액에 포함될 수있다. 형광 세포의 증가 된 해상도는 Nipkow 회전 디스크 공 촛점 14,22,30 또는 IR-DGC (6)에 결합 된 두 광자 현미경 (7)에 의해하게된다. 여러 장점 DIC 비교 DGC 관련이있다. DIC 프리즘이 필요하지 첫째, 상기 IR-DGC 화상은 형광 이미지 49,52,53,76와 중첩 될 수있다. 둘째, DGC는 photostimulation와 77 optogenetics 결합 할 수 있습니다. 슬라이스 제제의 단점은 신경 세포의 무결성을 보존한다. DA 신경 세 평면 공간 78,79 그들의 수지상 연장 따라서 수지상 실의 절단이 완전히 조각 (80)을 회피 할 수 없다. 슬라이스 방향의 선택 (관상 수평 파라) 시상 트레이드 오프입니다. 신경 분포 및 실험 설계의 기원은 슬라이스의 오른쪽 방향을 선택하기 위해 고려되어야한다. 직접 수지상 세포의 패치는 다른 구획 기능성 이온 채널의 분포를 매핑하는 데 사용되는 기술이다. 또한,이 기술은 채널 (20)의 기능성의 변화를 결정하도록 제공한다. 보완 이온 채널의 위치와 밀도는 광 및 전자 현미경 수준에서 면역 17,23을 이용하여 확인 될 수있다. 이 접근법은 또한 패치 피펫에 액세스 할 수없는 작은 구경 구조에서 채널 밀도를 결정할 수있는 가능성을 제공한다. 그러나 이들 채널은 패치 클램프 기술을 이용하여 기록 된 것과 비교하여 고유 한 기능 상태 (24) 또는 비활성화 될 수있다. 두 기술은 위치 및 속성의 전체 사진을 얻을하는 것이 필요하다특정 세포 영역 (17)의 이온 채널. 전압 감응 염료의 발전 전압 촬상 여러 위치 81에서 AP와 뉴런 EPSPS의 전파를 조사하는 데 사용되어왔다. 듀얼 패치 클램프 기록에 대한 대안으로서,이 방법은 심지어 패치 피펫에 액세스하지 않지만, 신호 평균화의 정확한 보정을 필요 얇은 돌기에 구현 될 수있다. SN 및 복부 피개 영역에서 DA 뉴런 널리 생리 및 병리 생리 학적 맥락에서 체세포 녹음을 통해 조사하는 동안, 자신의 수상 돌기의 기능적 특성은 두 조건에 크게 알려지지 않은 남아있다. 수상 돌기에서 패치 성공 13,25,26으로 여러 그룹에 의해 흑색질 도파민 신경 세포에 대한 구현이 미세 세포 내 구조 8 고르기 속성을 해부하는 선택의 방법을 유지하고있다. 수지상 기록은 더 opportu을 제공NITY는 효율성과 시냅스 전달의 소성 및 수지상 흥분 82,83의 가소성을 자세히 조사합니다.

신경 세포는 수상 돌기에 주로 시냅스 정보를받을 수 있습니다. 흥분성 및 활동 전위 (APS)를 출력 신호로 유발되는 통합 사이트로 세대의 사이트에서 확산 억제 시냅스 신호. 길에서 시냅스 전위는 수상 돌기의 구조와 수동 및 능동 막 특성 사이의 상호 작용 모두에 의해 영향을 받는다. 이러한 고도의 가변 파라미터의 조합은 1,2- 뉴런의 계산 능력을 넓힌다. 그러나, 수상 돌기의 직경이 작은 그러나 자신의 전기적 특성의 연구를 방해한다. 6, 7을 수상 돌기 - (3 μm의의 Ø 0.7) 패치 클램프 기술 (3)의 지속적인 개발은 지난 수십 년 동안 광학 4 조각 준비 5 방법의 정제는 매우 얇은에서 녹음을 사용할 수있다. 이러한 방법은 있었고, 여전히 대부분 다양한 O를 수상 돌기의 흥분을 검사하는 데 사용됩니다F 뉴런 (8). 직접 수상 기록은 기능적 특성 별개의 신경 세포 구획에서 이온 채널의 20 ~ 22의 분포 9-19과 차이점을 확인하는 것이 필수적이다. 이러한 데이터는 광학 및 전자 현미경 (23, 24)에 결합하여 면역 조직 화학 검출 이온 채널 분포의 필요한 보완. 듀얼 somatodendritic 녹음 상세한 패시브 케이블 모델, 활동 전위 9,13-15,21,22,25-27 뉴런의 somatodendritic 도메인 따라 시냅스 전위 13,16,18 확산의 전파를 탐색 수득 구현 된 28- (30)는 신경 세포 통합 (31)의 시간 분해능을 조사. 흑색질 (SN)는 이러한 이동의 제어, 보상 및 습관성 행동 부호화 여러 기능에 관여 중뇌에있는 영역이다. 특정에 의한 도파민의 감소SN에서 도파민 (DA) 신경 세포의 손실은 파킨슨 병 (32)을 앓고있는 환자에서 관찰 된 운동 장애와 관련된다. 도파민과 GABA 성 신경 세포 다음 흑색질 회로는 두 가지 종류의 세포로 구성되어있다. 흥미롭게도,이 신경 세포는 다른 신경 세포와 구별 몇 가지 특정 기능을 가지고 있습니다. DA 뉴런 및 일부 GABA 신경 세포의 큰 비율의 축삭은 돌기의 아버는 이종 (축삭 베어링 및 축삭-부족 수상 돌기) 25,26,33가 있음을 나타내는 수지상 사이트에서 유래. 소마로, 수상 돌기에서 시작하여 최종적으로 34 축삭하는 이러한 신경 세포의 형태는 정보 전달 동적 Cajal에 의해 방출 편광의 법을 따라하는 신경 세포의 전형적인 조직에 따라서 대조. DA 뉴런은 그 돌기 (35)로부터 도파민을 방출 붕괴 활성 36 NMDA 수용체 가소성 (37)를 생성하는 것으로 알려져있다. dissec이러한 현상의 기 그들이 시작하는 사이트에서 직접 녹음하지 않고 애매하다. 정확한 위치 및 이온 채널의 기능적 특성과 흑색질 신경 세포의 수지상 흥분과 정보 전달의 역할 사이의 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해, 직접 수상 기록은 선택의 방법입니다. 이 보고서는 흑색질 신경 세포의 수상 돌기 및 대응하는 사후 biocytin 레이블에서 싱글 및 듀얼 패치 클램프 녹음을 얻을 수 있습니다 상세한 절차를 설명합니다. 체세포와 수지상 막 패치에 대한 기본 원칙은 매우 유사하다. 실질적으로하지만, 수지상 사이트에서 녹음 체세포 녹음에 비해 특정 최적화가 필요합니다. 성공적인 수상 기록은 슬라이스, 광학의 최적의 조절, 녹음의 패치 피펫과 안정성의 부드러운 접근 방식의 품질에 의존한다.

<table><tbody><tr><td>Double-distillated water</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Resistivity &gt;14 M&amp;Omega; cm, ideal 18.2 M&amp;Omega; cm at 25&amp;nbsp;&amp;deg;C, filtered (0.22 &amp;micro;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Microfilter candles</td><td>Robu</td><td>Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td><td></td></tr><tr><td>Tissue slicer with vibroprobe</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td></tr><tr><td>Tissue slicer</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>cutting parameters: speed 4, frequency 7</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reserve chamber</td><td></td><td></td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>PP beckers</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue&amp;nbsp;</td><td>UHU</td><td>&quot;Sekunden Kleber&quot;</td><td>liquid glue</td></tr><tr><td>Recording chamber&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>Slice mini chamber</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td></tr><tr><td>Dental wax</td><td>Colt&amp;egrave;ne/Whaledent</td><td></td><td>orthodontic tray wax strips</td></tr><tr><td>Platinum grid</td><td></td><td></td><td>to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>to fire-polish pipette tips</td></tr><tr><td>Potassium methyl sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Molecular probes</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>GREISINGER electronic</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulators</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Frame grabber</td><td>The Imaging Source</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Condenser</td><td>Zeiss</td><td></td><td>high numerical aperture condenser working with oil</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective</td></tr><tr><td>Fourfold-changer</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td>between the camera and the microscope</td></tr><tr><td>Black &amp;amp; white video monitor</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16-inch, 850 TV lines, analog</td></tr><tr><td>Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>to transfer slices from the setup to histology room</td></tr><tr><td>The Axon Guide</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>Well cell culture plate</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>for the staining of fixed slices</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>mouse anti-TH monoclonal primary</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>working concentration: 1/1,000</td></tr><tr><td>goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>working concentration: 1/500</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Avidin DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td><td>plugin for ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr></tbody></table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

도파민 뉴런의 수상 돌기 수신 및 시냅스 입력, 지원 활동 전위 역 전파 및 신경 전달 물질 방출을 전달. 이러한 기본적인 기능을 이해하는 것은 이러한 신경 세포의 정보 전달을 밝혀됩니다. 수지상 패치 클램프 기록을 직접 돌기 및 기저 전압 관문 이온 채널의 전기적 특성을 검사 할 수있는 가능성을 제공한다. 그러나 이러한 미세 구조 때문에 작은 직경의 패치 피펫에 쉽게 액세스 할 수 없습니다. 이 보고서는 급성 조각에서 도파민 뉴런의 수상 돌기에서 안정적인 기록을 수집하는 단계별 절차를 설명합니다. 전기 생리 측정은 세포 형태의 사후 복구와 결합된다. 성공적인 실험은 조각, 솔루션과 피펫, 기록 된 구조와 접촉하는 광학 및 피펫의 안정성의 적절한 조정의 개선 준비에 의존하고 있습니다. 솜의 기본 원칙ATIC 패치 클램프 녹음 수상 돌기에 있지만 피펫의 완만 한 접근 방식으로 적용됩니다. 이러한 다양한 기술은 수상 돌기의 흥분 특성에 관한 다양한 질문을 해결하기 위해 구현 될 수있다.

상술 프로토콜 수지상 패치 클램프 기록을 이용하여 데이터의 수집을 용이하게하고자한다. 사후 조직 화학 결합이 기술은, 원산지 또는 수상 돌기로 확산 많은 전기 신호의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 패치 피펫과 수상 돌기에 직접 액세스는 어렵지만 몇 가지 방법 론적 측면에 특별한주의는 녹음의 성공률을 향상시킬 수 있습니다. 충분히 안정 체세포 기록에 경험 실험자는 시도의 대부분에 높은 저항 (GΩ) 물개와 완벽한 실험을 얻을 것으로 예상 할 수있다. 두 고품질 수상 녹화 한 해부에 따라 회수 할 수있다. 건강 인 somata과 수상 돌기를 포함하는 높은 품질의 뇌 조각의 가용성은 이러한 미세 구조 (그림 1)에 액세스하기위한 전제 조건입니다. criteri이러한 신경 세포를 선택하기위한 모든 셀 최적 조정 광학 관찰 낮은 콘트라스트 및 소마 돌기 위에 매끄럽고 균일 한 표면이다 (도 1a 및도 1b). 선택 뉴런이 너무 강하게 일반적으로 대조 불안정 기록 (그림 1C 및 1C)에 연결됩니다. 따라서 이러한 뉴런 피해야한다. 다른 신경 세포에 비해, 흑색질 DA 뉴런 특정 형태 및 전기 생리 특성을 표시합니다. 일반적으로 하나의 체세포 피펫으로 평가 이러한 기능은 듀얼 체세포 (그림 2)와 somatodendritic 녹음 (그림 3)에서 관찰 할 수있다. 긴 hyperpolarizing 현재 주사 (도 2B와 5D) &#39;처지&#39;라는 막 잠재적 인 정류를 유도한다. 식별 된 엑손은 수지상 사이트에서 대부분의 경우, 발신이러한 신경 세포의 수지상 구획 이기종 것을 나타내는, 보완 기준 13,25,26를 사용하여 (그림 3A - 3B). 13,25,26 - 그 결과, AP는 처음 관찰되는 구획 축삭은 (3D도 3c)를 나온다 된 구획에 대응한다. 축삭은 일반적으로 64 슬라이스 동안 축삭의 절단에 의한 축삭 여과포로 종료되지만,이 구조를 체계적으로 감지되지 않습니다. 연속 I (H)의 활성화에 흑색질 DA 뉴런에서 관찰되는 뚜렷한 저하는 HCN 서브 유닛의 높은 발현을 의미한다. 시냅스 신호의 적분에 I (H)의 영향을 결정하기 위해 연접 형 전류 (EPSC) 파형 생성 somatodendritic 듀얼 레코딩 55 (&lt;동안 수지상 기록 전극을 통해 주입 하였다강한&gt; 그림 4). 이러한 시뮬레이션 EPSCs의 반응 속도는 실제 자발적 EPSCs의 상승 및 감쇠 시간 상수에 근거했다. 그 결과 aEPSP는 체세포 전극으로 기록되었다. 는 I의 시간 차단제 ZD 7288의 목욕 응용 프로그램은 시냅스 신호 (그림 4B)의 시간 코스 I (H)의 기여도를 나타내는 aEPSP의 지속 시간을 증가했다. ZD 7288은 확인도 막 잠재적 인 정류를 폐지하는 I (H)의 활성화 (그림 4C)에서 처짐 결과. EPSPS 시뮬레이션으로 얻은 결과는 전기적 유발 EPSPS 65을 이용하여 실험에 상관 될 수도있다. DA 신경 세포의 somatodendritic 영역에서 채널의 정확한 분포를 매핑하려면, 세포 부착 녹음 (그림 5)를 구현 하였다. 높은 저항 씰 (&gt;&gt; 1 GΩ)는 (그림 5B 세포 부착 녹음을 위해 절대적으로 필요하다 </강한&gt;). DA 뉴런의 수상 돌기, 나는 시간이 긴 hyperpolarizing 전압 단계를 서서히 활성화되고 이전에 (66)와 같이 현재의 정상 상태는, MS (그림 5C)의 수백 후에 달성된다. 이 관찰은 DA 뉴런의 수상 돌기로 표현 HCN 채널 피라미드 뉴런 또는 다른 세포 유형 10,16,66에서와 비교하여 다른 서브 유닛을 가지고 있음을 나타냅니다. 채널의 분배가 수지상 구획 비균질하고 하듯 수지상 실 자체 이질적이기 때문에, 덴 드라이트 (엑손 베어링 또는 nonaxon 함유 수지 상정)의 신원은 공 촛점 이미지로 IR-DGC 화상을 비교함으로써 밝혀 biocytin 염색법 (도 3A와 B) 후. 세포 형태의 복구는 모두 듀얼 somatodendritic 녹음 및 이후의 체세포 전체 셀 녹음을 통해 세포 부착 된 레코딩을위한 필요가있다. 적외선 Videomicroscopy를 사용하여 흑색질 도파민 뉴런의 소마와 근위 Dendrites에서 시각화 그림 1. 소마와 인접 수상 돌기 모두 체세포와 수지상 피펫을 보여주는 흑색질 DA 신경 세포의 (A) IR-DGC 이미지입니다. 이중 somatodendritic 기록이 성공적이 건강한 신경 세포에서 수행 하였다. 모든 세포의 somatodendritic 도메인에 대한 낮은 콘트라스트와 매끄러운 표면을 관찰한다. (B) 건강한 DA 신경 세포의 또 다른 예입니다. (C) DA 신경 세포를 거친 고르지 않은 표면과 강한 대조. 이중 기록이 수득되었지만, 인해 두 피펫의 접속 저항의 점진적인 증가 (~ 15 분) 안정성이 최적이며, 기록 시간은 짧았다. (D) 도시하는 DA 신경 세포의 두 번째 예 강한 대조 소마와 인접 수상 돌기. 이 경우, 상기 접속 저항의 강한 증가는 전체 셀 모드에서 브레이크 직후 관찰되었다. 음의 압력에 의해 액세스 저항을 감소하려는 시도가 실패했습니다. 패널 C와 D의 뉴런은 슬라이스 과정에서 손상되었을 수 및 실험 피해야한다. (E) 기록의 시작 부분에 건강한 DA 신경 세포에서 동시 이중 체세포 기록. (F)와 패널 E에서와 같은 신경 세포 ~ 17 분 후 부어 세포체. 대비의 전체 부재를 참고 소마의 공 같은 모양과 건강한 신경 세포에서 명확하지 않은 큰 핵의 존재는. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> 그림 2. </strong&gt; 동시 두 번 체세포 DA 신경 세포에서 녹음. DA 신경 세포에서 두 번 체세포 녹화 중 (A) IR-DGC 이미지입니다. (B) Hyperpolarizing 1의 긴 현재 주사 탈분극 (-160 pA에 80을, 아빠 (80)를 증가) 및 해당 전압 변화는 두 패치 피펫과 동시에 기록했다. 탈분극 전류 펄스 동안의 긴 hyperpolarizing 현재 단계와 AP 후 후 과분극 대형와 전압 추적의 처짐의 존재를합니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> 그림 3. DA 신경 세포에서 이중 S omatodendritic 기록. (A)는 DA 신경 세포의 IR-DGC 이미지입니다. 수지상 및 소마 간의 거리는틱 피펫은 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC)에 결합 아비딘으로 표시 패널 (A)에서 신경 세포의 29 μm의. (B) 공 촛점 z를 프로젝션 이미지입니다. 신경 세포는 녹화 중에 biocytin으로 가득 차 있었다. 축삭은 화살표로 표시된 바와 같이 소마 가까운 기단 수지상 유래. 소마 (블랙 전압 트레이스) 및 수지상 기록 패널 A.의 AP에서 신경 세포로부터 (C)의 동시 듀얼 somatodendritic 전체 셀 전압 녹화 (적색 전압 블랙 현재 추적)과 오른쪽 선택적으로 수지상 피펫 (; 체세포 (왼쪽 통해 하나의 긴 전류 주입 단계에 응답 흔적) 빨간색 현재 추적) (D) 체세포와 수지상 AP 확장 된 시간 스케일에 표시.. 체세포 또는 수지상 전류 주입 중 하나로, 체세포 AP (블랙) 수지상 AP (적색) 앞에. 이 신경 세포에서의 AP 사이의 지연은 120 μs의 각각 체세포와 수지상 전류 주입, 210 μS했다. 지연액세스 포인트의 상승 단계에서 AP 반 최대 진폭을 측정 하였다. AP는 축삭 이전의 관찰 25, 26을 확인, 나온다되는 가까운 구획에 처음 관찰된다. 이 경우, 돌기의 기록은 엑손 - 결핍 수지상 만들어진다. 축삭 베어링 수지상 참조에에서 기록의 예. 13 (자신도. 1). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> DA 뉴런의 Somatodendritic 축을 따라 인공 EPSPS 그림 4. 전파. (A)는 DA 신경 세포의 IR-DGC 이미지입니다. 수지상 체세포 피펫 사이의 거리는 45 μm의 것이다. 두 패치 피펫 전체 셀 전류 클램프 기록 모드에있다. (B) 현전류 클램프 수지상 피펫 기록 인공 EPSP (상부). 현재는 EPSC 같은 파형의 주입에 의해 얻어진다 (; τ 붕괴 = 3 MS] τ 상승 = 0.6 밀리 진폭 = 100 씩) 수지상 기록 피펫 (55)를 통해. (적색 추적 30 μM) 하단에 제어 조건 (검은 색)의 소마 기록 aEPSPs을 전파하고 I의 시간 차단제 ZD7288의 목욕 신청 후. 각 전압 추적 40 단일 스윕의 평균입니다. 30 μM의 ZD 7288의 도포 후 (제어 상태 (흑)의 소마에서 녹화 흔적은 전압. (C)를 EPSPS 시간 경과에 I (H)의 기여를 나타내는 ZD7288의 존재 EPSP 기간에서 큰 증가를 관찰 긴 (30 pA에 대한 응답에서 빨간색) 1 초) hyperpolarizing 현재 단계. 나는 &lt;의 막힘 후 막 잠재적 인 정류 (처짐)의 부재를 참고서브&gt; 시간. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> DA 신경 세포의 Dendrites에서의 I h를 그림 5. 존재. 근위 수상 돌기에 DA 신경 세포와 피펫의 (A) IR-DGC 이미지입니다. (B) 세포 부착 구성에서 5 MV 전압 명령 중 정전 용량과 누설 전류. 밀봉 저항이 예에서는 5 GΩ이었다 (C) Hyperpolarizing 전압 단계.; MV는 천천히 활성화 I h를 유도 0의 막 전위 (90 MV 위). 현재 트레이스 반전 τ = 632 ms의 시간 상수를 제공 한 지수 함수를 장착 하였다. (D) 전압하나의 하이퍼로 전체 셀 기록 소마 (패널 A)의 반응과 탈분극 전류 펄스 (120 pA에에 -160, 40 아빠 증가). 체세포 전체 셀 기록이 세포 부착 후에 기록 하였다. 때문에 세포 부착 녹음 중에 자연 발화를 억제하는 TTX 및 카드뮴 2+의 세포 외 응용 프로그램에 액세스 포인트의 부재를합니다. 이 전압 - 게이트 나 + 및 CA 2+ 전류 차단기 동작 전류를 억제하도록 하였다. 패널 A - D는 같은 신경 세포에서있는 다른 DA 신경 세포와 수지상 피펫 (E) IR-DIC 이미지 -120 MV에서 50 밀리의 프리 펄스에서 0 MV에 테스트 펄스에 의해 활성화 (F) 전압에 의존하는 전류.. 패널 E. 지주의 신경 세포의 근위 수상 돌기 잠재적 -80 MV에서 절제 외부 아웃 패치입니다. 현재의 시간에 따른 불 활성화를합니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 버전입니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 물질 </td><td> g / 몰 </td><td> 집중 </td><td> 1 L에 대한 </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 58.443 </td><td> 125 밀리미터 </td><td> 7.305 g </td></tr><tr><td> 의 NaHCO3 </td><td> 84.007 </td><td> 25 mM의 </td><td> 2.100 g </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 74.551 </td><td> 2.5 밀리미터 </td><td> 0.186 g </td></tr><tr><td> 의 NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1.25 밀리미터 </td><td> 0.172 g </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 198.17 </td><td> 25 mM의 </td><td> 4.95 g </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 1 ㎜ </td><td> 1 mL의 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 2 밀리미터 </td><td> 2 mL의 </td></tr><tr><td colspan="4"> 삼투압 ~ 310 mOsmol / L (최적의 범위: 314-325 mOsmol / L), pH는 7.4 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 인공 뇌척수액 (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 물질 </td><td> g / 몰 </td><td> 집중 </td><td> 1 L에 대한 </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 58.443 </td><td> 87 mM의 </td><td> 5.084 g </td></tr><tr><td> 의 NaHCO3 </td><td> 84.007 </td><td> 25 mM의 </td><td> 2.1001 g </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 7.551 </td><td> 2.5 밀리미터 </td><td> 0.18637 g </td></tr><tr><td> 의 NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1.25 밀리미터 </td><td> 0.17248 g </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 7 밀리미터 </td><td> 7 mL의 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 198.17 </td><td> 10 mM의 </td><td> 1.9817 g &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> 자당 </td><td> 342.29 </td><td> 75 mM의 </td><td> 25.672 g </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 0.5 밀리미터 </td><td> 0.5 mL의 </td></tr><tr><td colspan="4"> 삼투압 ~ 326 mOsmol / L, pH는 7.4 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 자당 - ACSF는 조각을 준비한다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 물질 </td><td> g / 몰 </td><td> 집중 </td><td> 100 ㎖에 대한 </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150.2 </td><td> 120 밀리미터 </td><td> 1.8024 g </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 74.56 </td><td> 20 mM의 </td><td> 0.14912 g </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 2 밀리미터 </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> 나 2 ATP </td><td> (5)51.1 </td><td> 2 밀리미터 </td><td> 0.1102 g </td></tr><tr><td> 나 2 GTP </td><td> 523.2 </td><td> 0.5 밀리미터 </td><td> 0.02661 g </td></tr><tr><td> 나 2 -Phosphocreatine </td><td> 255.1 </td><td> 5 밀리미터 </td><td> 0.1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380.4 </td><td> 0.1 mM의 </td><td> 3.803 mg의 </td></tr><tr><td> 헤 페스 </td><td> 238.31 </td><td> 10 mM의 </td><td> 0.23831 g </td></tr><tr><td> Biocytin </td><td> 1 ㎎ / ㎖ </td><td></td><td> 0.1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> 삼투압 ~ 302 mOsmol / L, pH는 7.2로 조정 KOH </td></tr></tbody></table> 표 3 : 듀얼 레코딩을위한 세포 내 솔루션입니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 물질 </td><td> g / 몰 </td><td> 집중 </td><td> (100)mL의 </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 74.56 </td><td> 120 밀리미터 </td><td> 0.8947 g </td></tr><tr><td> 염화칼슘 (2) </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 2 밀리미터 </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 1 M (솔루션) </td><td> 1 ㎜ </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> 헤 페스 </td><td> 238.31 </td><td> 10 mM의 </td><td> 0.23831 </td></tr><tr><td> TEA-CL </td><td> 165.7 </td><td> 20 mM의 </td><td> 0.3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94.11 </td><td> 5 밀리미터 </td><td> 0.04705 g </td></tr><tr><td> BaCl 2 </td><td> 244.26 </td><td> 1 ㎜ </td><td> 0.02443 g </td></tr><tr><td> 을 CDCl3 2 </td><td> 183.32 </td><td> 0.02 밀리미터 </td><td> 0.3666 mg의 </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 ㎜ </td><td> 200 nm의 </td><td> 20 μL </td></tr><tr><td colspan="4"> 삼투압 ~ 290 mOsmol / L, D-포도당 (참고 16.)로 조정; pH가 7.4 </td></tr></tbody></table> 표 4 : 세포 부착 된 레코딩을위한 전극 솔루션입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K 조회수.  Quartier Hôpital, 














University
of Liege. Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro. 

비디오: Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

성인 쥐에서 본래 등쪽 뿌리 신경절에 패치 클램프 녹음

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

연구

생화학

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

동적 클램프 기법을 사용 랫 Midbrain Dopaminergic 뉴런에서 NMDA 수용체의 전도의 응용

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

신경과학

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

단일 셀 RT - PCR 기법을 사용 Nigral 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널 mRNA의 표현을 프로파일

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is terminated by diffusion2-3, extracellular enzymes4, and membrane transporters5. The dopamine transporter, located in the peri-synaptic cleft of dopamine neurons clears the released amines through an inward dopamine flux (uptake). The dopamine transporter can also work in reverse direction to release amines from inside to outside in a process called outward transport or efflux of dopamine5. More than 20 years ago Sulzer et al. reported the dopamine transporter can operate in two modes of activity: forward (uptake) and reverse (efflux)5. The neurotransmitter released via efflux through the transporter can move a large amount of dopamine to the extracellular space, and has been shown to play a major regulatory role in extracellular dopamine homeostasis6. Here we describe how simultaneous patch clamp and amperometry recording can be used to measure released dopamine via the efflux mechanism with millisecond time resolution when the membrane potential is controlled. For this, whole-cell current and oxidative (amperometric) signals are measured simultaneously using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, with a low-pass Bessel filter set at 1,000 Hz for whole-cell current recording). For amperometry recording a carbon fiber electrode is connected to a second amplifier (Axopatch 200B) and is placed adjacent to the plasma membrane and held at +700 mV. The whole-cell and oxidative (amperometric) currents can be recorded and the current-voltage relationship can be generated using a voltage step protocol. Unlike the usual amperometric calibration, which requires conversion to concentration, the current is reported directly without considering the effective volume7. Thus, the resulting data represent a lower limit to dopamine efflux because some transmitter is lost to the bulk solution.

The amperometric technique measures dopamine release from a single cell by detecting the oxidative current produced by spontaneous dopamine oxidization. Simultaneous voltage clamp and amperometry methodology reveal the mechanistic relationship between the overall "activity" of dopamine transporter and the regulatory role of this activity on the reverse transport of dopamine.

동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

생물학

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

Patch-Clamp 기록을 위해 신생아 설치류에서 전정 및 나선형 신경절 소마타를 분리 및 배양합니다.

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

Source: Engel, D. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54601">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Perforated Patch-Clamp Recordings of Inner Ear Sensory Neuron Cell Bodies

Source: Iyer, M. R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/64908">Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates the patch-clamp technique for measuring ionic currents in inner ear sensory neuron cell bodies. It details the preparation and use of a polished patch-clamp pipette filled with an internal solution containing amphotericin B, which perforates the membrane to allow ion movement while preserving intracellular conditions. Voltage pulses are applied to trigger and record ion channel activity, providing insights into their properties and behavior.

내이 감각 뉴런 세포체의 천공된 패치 클램프 기록

1. Recording
NOTE: In this procedure, patch-clamp recordings from the isolated ganglion are typically performed 12-24 h after the plating. Other labs have ...

Imaging and Optical Techniques

Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

Source: Zhu, M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58479">Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.