Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

이 프로토콜은 지질 마이크로버블의 제조와 마이크로버블 물리화학적 특성을 보존하는 정제가 없는 >95% 라벨링 효율을 가진 호환 가능한 원팟 마이크로버블 방사성 라벨링 방법을 설명합니다. 이 방법은 다양한 지질 마이크로버블 제형에 효과적이며 방사성 및/또는 형광 마이크로버블을 생성하도록 맞춤화할 수 있습니다.

마이크로버블은 지질 껍질의 가스로 채워진 입자로, 혈관 초음파 조영제에서 혁신적인 암 치료 플랫폼으로 진화했습니다. 치료용 집속 초음파(FUS)와 결합하면 생리학적 장벽(예: 혈뇌장벽)을 안전하고 국소적으로 극복하고, 다른 방법으로는 접근할 수 없는 암(예: 교모세포종 및 췌장암)에 약물을 전달하고, 신경퇴행성 질환을 치료할 수 있습니다. 마이크로버블-FUS의 치료제는 시너지 조합 방사선 요법, 멀티모달 이미징, 일체형 약물 로딩 및 마이크로버블 쉘 전달 등 새로운 방향으로 발전하고 있습니다.

방사성 추적자로 마이크로버블을 라벨링하는 것은 이러한 확장된 테라노스틱 기능을 확립하는 데 중요합니다. 그러나 기존 마이크로버블 방사성 표지 전략은 마이크로버블의 물리화학적 특성을 교란하고, 수명이 짧은 방사성 동위원소를 사용하며, 항상 안정적인 킬레이트화를 생성하지는 않는 것으로 알려진 정제 방법론에 의존합니다. 총체적으로, 이는 마이크로버블 방사성 방사선 영상의 정확성과 종양 방사성 동위원소 전달의 효율성을 둘러싼 모호성을 야기합니다.

이 프로토콜은 >95%의 방사성 동위원소 킬레이트화 효율을 달성하면서 미세버블 물리화학적 특성을 보존하는 새로운 원팟, 정제가 필요 없는 마이크로버블 라벨링 방법론을 설명합니다. 이 제품은 다재다능하며 아실 지질 사슬 길이, 전하 및 킬레이터/프로브(포르피린, DTPA, DiI) 조성이 다른 맞춤형 및 상업용 마이크로버블 제형에 성공적으로 적용할 수 있습니다. 그것은 ground-up microbubble 제작 도중 그리고 형광 및 multimodal 형광/방사성 재산의 모듈 커스터마이징 가능성으로 pre-made microbubble 정립에 적응하게 적용될 수 있습니다. 그러므로, 이 가동 가능한 방법은 기계론, 화상 진찰 및 치료 microbubble-FUS 응용을 전진해서 유용한 맞춤형, 추적 가능한 (라디오, 형광성, 또는 방사선/형광 활동적) multimodal microbubbles의 생산을 가능하게 합니다.

마이크로버블은 단백질, 폴리머 또는 대부분의 경우 지질 껍질에 의해 안정화된 가스 코어를 가진 미크론 크기의 초분자 테라노스틱 제제입니다(그림 1A). 혈류량으로 주입될 때, microbubbles는 그들의 가스 중핵 ^1,2의 해체 이전에 분 긴 timeframe 동안 초음파에 의해 검출될 수 있는 가스/액체 공용영역을 유지합니다. 결과적으로, 마이크로버블의 첫 번째 임상적 사용은 실시간 초음파 영상 조영제였다³. 치료용 집속 초음파(FUS)의 발명으로 마이크로 버블 임상 유틸리티가 확장되었습니다. 저주파 FUS에 의해 자극될 때, microbubbles는 진동하고 일시적인 관 투과성에서 국소 조직 절제 ^4,5에 배열하는 표적으로 한, 조정 가능한 기계적인 힘을 생성한다. 그 결과, 지난 20년 동안 마이크로버블-FUS는 혈액뇌장벽(BBB) 개방, 종양(예: 췌장암, 뇌암, 간 전이성 암) 약물 및 이미징 프로브 전달, 신경퇴행성 질환 치료 및 암 절제 6,7,8,9,10,11에 대해 탐구되었습니다.

마이크로버블의 테라노스틱 무기고는 새롭고 흥미로운 방향으로 계속 발전하고 있습니다. 기존의 microbubble-FUS 전달 응용 분야는 상업용 microbubbles와 함께 치료 또는 이미징 화물의 공동 투여에 의존합니다. 마이크로버블 쉘/생물학적 상호 작용을 이해하고, 맞춤형 비상업적 마이크로버블 제형을 탐색하고, 마이크로버블 쉘에 직접 적재된 화물로 올인원 테라노스틱 마이크로버블을 생성함으로써 마이크로버블-FUS 전달 능력을 향상시키는 데 관심이 높아지고 있습니다 12,13,14. 실제로, 지질 microbubble 약 납품 학문의 대략 40%는 그런 포탄 적재된 microbubbles¹⁵를 이용한다. 이미징 및 약물 전달 외에도 microbubble-FUS는 암 방사선 요법을 강화하고(¹⁶), 초음파 역학 요법을 통해 양성 쉘 적재 제제의 항종양 효과를 활성화하는 데 유망한 것으로 나타났습니다^17,18.

microbubble 암 신청에 있는 이 전통적인 그리고 확장된 방향은 microbubble 포탄에 방사성 tracer를 표기해서 전략적으로 전진될 수 있습니다. 올인원(all-in-one) 화물 적재 마이크로버블의 영역에서, 이러한 방사선 라벨링은 1) 이러한 적재된 마이크로버블 쉘의 온/오프 타겟 생체분포의 골드 스탠다드, 정량적 평가를 촉진하고, 2) 온-타겟 전달을 극대화하기 위해 마이크로버블 구성의 최적 선택을 알리는 약동학 구조-활성 관계를 도출하고, 3) 전략적이고 적절한 이미지 유도 적용 및 치료 계획(예: 조직 표적 유형, 선량 측정, off-target 안전 문제를 완화하기 위한 약물 선택, 기존 공동 치료 패러다임과 비교한 유용성) all-in-one 화물 적재 시스템^15,19. 전임상 단계에서 마이크로버블 쉘 운명에 대한 이러한 이해는 더 광범위한 마이크로버블-FUS 작용 메커니즘을 조명할 수도 있습니다. 예를 들어, 마이크로버블 쉘에서 표적 세포로의 지질 전달은 FUS 기반 초음파^{전달 12,20}에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 따라서 이러한 전달을 이해하고 최적화하면 초음파 처리와 관련된 전임상 및 임상 마이크로버블-FUS 요법(체외 형질주입, 약물 전달, 종양 절제, 방사선 감작 및 초음파 역학 요법 20,21,22,23,24,25). 이중 초음파 및 방사선 이미징 시설은 또한 기존의 이중 제제 설계가 아닌 단일 제제에서 FUS 혈관 개방 및 치료 모니터링(예: BBB 개방 역학)을 가능하게 합니다²⁶. 같은 맥락에서, 지질 마이크로버블 방사성 표지는 마이크로버블-FUS + 방사성의약품 공동 전달 플랫폼에 대한 올인원 단일 제제 마이크로버블-FUS/방사선 요법 대안으로 작용할 수 있습니다²⁷.

마이크로 버블의 취약성은 그러한 라벨링에 대한 사소한 도전입니다. 기존의 모든 방사성 표지 전략은 마이크로 버블의 안정성과 크기를 교란시키는 것으로 알려진 정제 방법론에 의해 제한되며, 일부는 비효율적이고 불안정한 방사성 표지 28,29,30,31,32를 특징으로 합니다. 정제 요구 사항으로 인해 프로토콜이 더 길어집니다. 수명이 짧은 방사성 동위원소(예: ¹⁸F t_1/2 1.8 ^{h,28,29 99m}Tc t_1/2 6 ^h,3268Ga t_1/2 1 h³¹)의 사용과 결합하면 방사성 동위원소 붕괴와 관련된 비효율성이 발생하고 방사선 이미징 및 치료 계획 기간이 제한됩니다. 총체적으로 이러한 한계는 짧고 대표성이 없는 방사선 이미징, 부정확한 약동학 데이터, 비효율적인 종양 방사성 동위원소 전달의 위험을 초래합니다.  

이 보고서에서는 포르피린의 강력하고 안정적인 금속 킬레이트 기능을 활용하여 이러한 한계를 극복합니다. 포르피린은 다양한 금속을 수용할 수 있는 고도로 공액된 평면 고리와 중앙 배위 부위를 가진 유기 헤테로사이클릭 거대분자입니다. 여기에는 구리-64(t_1/2 12.7 h)와 같은 수명이 긴 방사성 동위원소, 양전자 방출 단층촬영(PET)을 이용한 방사성 의약품 및 γ 계수 타당성³³이 포함된다. 지질 골격에 접합될 때, 포르피린은 초분자 구조에 쉽게 통합될 수 있으며 이후에 부모의 표지되지 않은 입자^33,34의 특성을 유지하면서 속도, 높은 킬레이트화 효율 및 혈청 안정성으로 구리-64로 표지될 수 있습니다. 또한, 포르피린은 입자 파괴 시 복원되는 나노 및 미세 입자의 모듈식 자체 담금질로 형광 활성입니다. PET 및 γ 계수에 대한 보완적인 판독으로 벌크 및 현미경 껍질 운명 분석을 모두 용이하게 합니다(그림 1A)¹⁵.

포르피린-지질을 킬레이트로 사용함으로써 이러한 특성을 활용하여 기존 마이크로버블 방사성 표지 방법과 관련된 한계를 극복하는 새로운 단일 냄비, 정제가 필요 없는 마이크로버블 방사성 표지 방법(그림 1B, C)을 생성했습니다. 이 프로토콜은 >95%의 구리-64 킬레이트화 효율을 달성하고, 라벨링 후 정제가 필요하지 않으며, 미세버블 물리화학적 특성을 보존합니다. 그것은 그들의 활성화 (숫자 1B) 전에 지질 microbubbles의 "지상 위로" 제작으로 쉽게 통합될 수 있습니다. 그것은 다재다능하 아실 지질 사슬 길이 (C16에 C22), 책임 (중립성과 음이온성), 및 라디오 둘 다 형광 활동을 가진 microbubbles를 생성하는 porphyrin 지질 구성 (1 mol%, 10 mol%, 30 mol%)를 가진 관례와 상업적인 microbubble 정립의 맞은편에 성공적으로 적용될 수 있습니다. 그 적응력은 포르피린을 넘어서기도 합니다. 원-팟 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 대체 킬레이터(예: 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트(DTPA)-지질) 및 형광단(예: DiI)을 사용하도록 수정할 수 있습니다. 또한 "스파이킹" 접근 방식을 통해 미리 만들어진 microbubble 제형에 라벨을 붙이도록 수정할 수 있습니다. 그러므로, 이 방법은 기계론의, 화상 진찰 및 치료 microbubble-FUS 신청 전진을 위해 유용한 맞춤형, traceable (라디오, 형광성, 또는 이중 방사선/형광성 활동적인) microbubbles의 생산을 가능하게 합니다. 아래 프로토콜은 지질 마이크로버블의 제조, 원팟 방사성 표지 프로토콜의 적용, 필요한 방사성 표지 및 물리화학적 특성 특성화, 잠재적 변형에 대해 설명합니다.

그림 1: 마이크로버블 제조 및 방사성 표지 프로토콜. (A) pyropheophorbide-a-lipid 형태의 포르피린 지질은 이 프로토콜 내에서 다중 모드 킬레이터 역할을 합니다. 구리-64(i)에 킬레이트화된 단량체로서 PET 및 이미징 기능이 있습니다. 그것의 형광은 입자 형태 (마이크로 버블 (ii) 및 용해 후 나노 자손 (iii))으로 담금질되고 입자 파괴 (iv)로 담금질됩니다. (B) 이 보고서에 설명된 지질막 수화/활성화 프로토콜은 처음부터 지질 마이크로버블을 생성하고 (C) 지질 현탁액 형성과 마이크로버블 활성화 사이의 원팟 방사성 표지의 통합. 이 그림은 Rajora et ^al.15의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 시약의 준비

1. 아세트산 암모늄 완충액(0.1M, pH 5.5)을 준비합니다.
   1. 분석 저울을 사용하여 770.8mg의 아세트산암모늄을 계량지에 올려 칭량합니다. 계량된 양을 깨끗한 250mL 유리 비커에 옮깁니다.
   2. 눈금이 매겨진 피펫을 통해 측정한 90mL의 이중 증류수(ddH₂O)를 비커에 추가합니다. 교반 막대를 추가하고 비커를 마그네틱 교반 플레이트에 올려 놓아 아세트산 암모늄을 용해시킵니다. 약간의 소용돌이를 생성하지만 용액이 튀지 않는 속도로 저어줍니다.
   3. pH 4 및 7 표준을 사용하여 기기 지침에 따라 pH 측정기를 교정합니다. 보정이 완료되면 pH 프로브를 아세트산 암모늄 버퍼에 삽입합니다.
   4. 용액에 아세트산 104μL를 첨가하고 저어 용해시킨 후 pH를 측정합니다.
      참고: 이 시점에서 pH는 5.5에 가까워야 합니다.
   5. 마이크로피펫을 사용하여 10N 수산화나트륨(또는 완충액이 너무 염기성이 되는 경우 염산)을 5-10μL 단위로 첨가하여 완충액의 pH를 조정합니다. 젓고 pH를 측정하고 필요에 따라 반복합니다. 첨가된 염기/산의 부피를 기록해 두십시오.
   6. ddH₂O를 충분히 추가하여 총 100mL의 완충액을 생성합니다.
      참고: 예를 들어, pH 조정 중에 45μL의 10N 수산화나트륨을 사용한 경우 9.851mL의 ddH_2O를 비커에 추가합니다(100mL [목표 부피]- 90mL [단계 1.1.2] - 0.104mL [단계 1.1.4] - 0.045mL [단계 1.1.5] = 9.851mL).
   7. 뚜껑이 있는 보관 용기로 옮기기 전에 버퍼를 마지막으로 한 번 철저히 저어줍니다.
   8. 기기 지침에 따라 pH 측정기를 청소하십시오.
      주의 : 농축된 수산화나트륨 수성 및 염산은 피부 반응을 일으킬 수 있으므로 장갑을 사용하여 다루어야 합니다.
2. 수화 완충액(PGG) 준비
   1. 인산염 완충 식염수(PBS)를 주사기에 흡입하고 말단에 폴리에테르설폰 0.2μm 공극 크기 주사기 필터를 장착합니다. PBS를 뚜껑이 있는 깨끗한 플라스틱 원심분리기 튜브에 여과합니다.
      참고: 멤브레인이 PBS 및 아세트산암모늄과 호환되는 한 대체 멤브레인 재료(예: 폴리비닐리덴 플루오라이드)의 0.2μm 기공 주사기 필터를 사용할 수 있습니다.
   2. 마이크로피펫을 통해 여과된 PBS, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤을 8:1:1 부피 비율로 결합하여 수화 완충액(PGG라고도 함)을 만듭니다. 프로필렌 글리콜과 글리세롤을 첨가할 때 시약을 PBS에 천천히 피펫팅하기 전에 피펫 팁 표면에서 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤의 잔류 방울을 흡인하고 닦아냅니다. PBS에서 투명한 끈 같은 점성 탁도를 볼 수 있습니다.
      참고: p1000 마이크로피펫을 사용하여 PBS를 먼저 원심분리 튜브에 첨가한 다음 프로필렌 글리콜과 글리세롤을 첨가하는 것이 좋습니다. 따라서 피펫 팁에서 유체의 움직임이 더 이상 보이지 않고 시약에서 피펫 팁을 제거할 때 공기가 흡입되지 않을 때까지 마이크로피펫을 통해 천천히 흡인해야 합니다. 부피 표시가 있는 마이크로피펫 팁을 사용하여 이러한 표시와 일치하는 시약 부피를 선택하는 것이 좋습니다(예: 1mL 또는 5mL PGG를 만들고 각각 마이크로피펫 팁의 0.1mL 또는 0.5mL 표시를 사용하여 프로필렌 글리콜 및 글리세롤의 완전한 흡인을 시각화). 마이크로피펫 팁의 표면을 닦을 때 팁 개구부를 닦지 말고 측면만 닦으십시오.
   3. 시약이 균질하게 용해될 때까지 용액의 피펫 팁을 사용하여 피펫을 위아래로 움직입니다. 용액에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오.
   4. 수화 버퍼의 완전한 혼합을 더욱 보장하려면 원심분리기 튜브에 캡을 씌우고 위아래로 천천히 회전합니다. 소용돌이치지 마십시오.
   5. 1000 x g 미만으로 20-30초(최소 온도 4°C, 최대 RT) 동안 튜브를 돌려 눈에 띄지 않는 기포를 제거합니다.
3. 수화/방사성 표지 완충액(AA-PGG) 준비
   1. 주사기 필터 0.1M, pH 5.5 아세트산 암모늄 완충액(1.1단계) 및 PBS를 1.2.1단계에 따라 별도의 튜브에 넣습니다.
   2. p1000 마이크로피펫을 통해 여과된 아세트산 암모늄 완충액, 여과된 PBS, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤을 5:3:1:1 아세트산 암모늄 완충액의 원심분리 튜브에 결합합니다: PBS: 프로필렌 글리콜: 글리세롤 부피 비율. 나열된 순서에 따라 AA-PGG를 만들려면 1.2.2-1.2.5 단계에 따라 흡입, 혼합 및 원심분리 지침을 따르십시오.
4. 순간 박막 크로마토그래피(iTLC) 용리액
   1. 최대 0.1g의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)의 무게를 측정하고 뚜껑이 있는 바이알에 옮깁니다. EDTA의 2% w/v 용액이 만들어지도록 ddH₂O에 용해시킵니다(예: EDTA 50mg의 경우 ddH_2O2.5mL 추가).
   2. 2% w/v EDTA 용액을 1.1단계의 암모늄 아세테이트 완충액과 9:1 v/v 비율(90% EDTA 용액, 10% 암모늄 아세테이트 완충액)로 결합합니다. 생성된 iTLC 용리액을 뚜껑을 닫고 보관합니다.

2. 지질막의 형성

참고: 이 절차는 포르피린-지질이 숙주 지질을 대체하고 총 지질의 30 mol%를 구성하는 상업용 마이크로버블인 Definity^®를 모방한 조성을 가진 지질 필름의 형성을 간략하게 설명합니다. 그러나 방사성 표지 프로토콜은 다양한 지질 제형(C16, C18, C22 사슬 길이, 중성 또는 음이온 전하, 다양한 포르피린-지질 어금니 조성)에 적용할 수 있습니다. Supplementary Spreadsheet (Supplementary File 1)가 첨부되어 있으며, 이 스프레드시트는 설명된 제형 및 기타 제형에 대한 계산, 구성, 질량 및 재고 볼륨을 제공합니다. 모든 지질은 포르피린-지질, 피로페오포르바이드-a-지질(pyro-lipid)을 제외하고 상업적으로 입수할 수 있으며, 이의 합성은 이전에 상세히 기술되어 있다^35,36.

1. 보충 파일 1을 사용하여 필요한 필름의 수에 따라 각 지질에 필요한 총 질량을 측정합니다.
2. 빈 0.5 드람 유리 바이알을 분석 저울에서 칭량합니다.
   참고: 먼지는 성공적인 미세기포 형성을 방해합니다. 따라서 뚜껑을 닫지 않고 보관하는 경우 먼지/미립자를 제거하기 위해 가압된 공기를 바이알에 불어넣습니다.
3. 계량지에 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC)의 무게를 잰다.
   참고: 계량된 질량은 2.1단계에서 얻어야 하며 이후 단계에서 샘플 취급 중 손실을 설명하기 위해 추가로 0.5-1mg을 얻어야 합니다.
4. DPPC를 계량된 유리 바이알로 옮기고 다시 칭량하여 바이알의 지질 질량을 측정합니다. 이 과정을 통해 유리 바이알로의 지질 전달이 더 쉬워지고, 지질 분말 손실/유출이 감소하며, 지질 질량을 보다 정확하게 측정할 수 있습니다.
5. 다른 지질에 대해 2.2-2-2.4-단계를 반복합니다: 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (DPPE-mPEG), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate (DPPA) 및 C16 pyro-lipid.
   참고: 파이로-지질이 계량 가능한 분말 형태가 아니라 알 수 없는 양의 필름 또는 분취액으로 사용할 수 있는 경우, 클로로포름에 용해시켜 앞서 설명한 바와 같이 Beer-Lambert 법칙을 사용하여 메탄올의 UV-Vis 흡광도 측정을 통해 농도를 계산할 수 있는 스톡을 형성할 수 있습니다³⁵.
6. 마이크로피펫 또는 유리 주사기를 사용하여 유리 시험관에 다음 유기 용매 및 용액을 준비합니다: 1) 클로로포름, 2) 9:1 V/V 클로로포름: 메탄올 및 3) 65:35:8 클로로포름:메탄올:ddH₂O. 마지막으로 성분을 피펫으로 만들고 ddH₂O, 메탄올, 클로로포름 순서로 혼합합니다.
   주의: 메탄올과 클로로포름은 건강에 해롭고 가연성이며 휘발성입니다. 보안경, 장갑, 실험복을 착용하고 흄 후드를 사용하십시오.
7. 보충 파일 1을 사용하여 지질 원료를 만드는 데 필요한 유기 용매/용액의 부피를 계산하고 적절한 부피의 유리 주사기를 선택합니다.
   참고: 이 부피는 25-100μL 유리 마이크로리터 주사기를 사용하여 쉽게 측정할 수 있는 필름당 15-100μL 스톡 분취 부피에 해당하는 스톡 농도를 생성해야 합니다.
8. 유리 주사기를 클로로포름으로 세 번 헹굽니다. 플런저를 앞뒤로 펌핑하여 주사기를 건조시킵니다.
9. 세척된 유리 주사기를 통해 유기 용매/용액을 측정하고 2.7단계의 스프레드시트 계산에 따라 개별 지질 바이알에 추가하여 지질 원을 형성합니다. 클로로포름에 파이로 지질을 용해 (2.5 단계 노트에 따라 이미 용해되지 않은 경우), DPPC 및 DPPE-mPEG를 9 : 1 v / v 클로로포름 : 메탄올 및 DPPA를 65 : 35 : 8 클로로포름 : 메탄올 : ddH₂O. 모든 첨가에 동일한 유리 주사기를 사용하는 경우 각 지질 사이를 헹구고 말리십시오.
   참고: 선택한 제형에 DPPA 또는 C18 사슬 길이 변형체가 포함되어 있지 않은 경우 파이로 지질, 숙주 PC 지질 및 PEG 지질이 모두 클로로포름에 용해될 수 있습니다.
10. 바이알과 소용돌이의 뚜껑을 닫습니다.
11. 계산된 부피의 원천 지질 용액을 유리 마이크로리터 주사기를 통해 새로운 0.5드람 유리 바이알(필름 바이알)에 추가합니다. 첫 번째 지질 스톡의 경우 바늘 끝을 바이알의 하단 중앙에 삽입하고 바이알 벽이 튀지 않도록 천천히 떨어뜨립니다. 후속 첨가를 위해 바늘 끝을 액체 레벨 바로 위에 놓고 바이알 측면을 만져 바늘이 아래의 액체에 노출되지 않는 방식으로 최종 방울을 제거합니다.
    알림: 오염이 발생할 때 지질 첨가물 사이에 유리 주사기를 헹구고 말리십시오. 여러 필름을 만드는 경우 용매 증발을 최소화하기 위해 첨가물 사이에 필름과 스톡 바이알을 모두 덮으십시오.
12. 내용물을 섞기 위해 바이알을 수직으로 수동으로 부드럽게 휘젓습니다. 바이알 벽에 용액이 튀지 않도록 하십시오.
13. 뚜껑을 열고(캡 보관) 바이알의 헤드 스페이스에 질소 라인을 삽입합니다. 질소 흐름을 조정하여 액체 표면에서 약간의 눈에 띄는 방해를 일으키지만 깔때기나 튀는 현상은 없도록 합니다.
14. 질소 라인을 삽입한 직후 바이알을 소용돌이치십시오. 바이알 바닥에서 1cm 이하로 솟아오르는 용매로 깔때기를 형성하기에 충분한 저속으로 시작합니다. 용제가 튀지 않도록 하십시오. 용매가 증발함에 따라 와류 속도를 천천히 그리고 쉬지 않고 증가시켜 모든 액체가 증발할 때까지 용매 높이를 유지합니다. 그 결과 바이알의 아래쪽 1/3에 걸쳐 코팅된 박막이 생성됩니다.
15. 바이알을 진공 설비된 데시케이터에 넣고 진공 상태에서 8-72시간 동안 필름을 계속 건조시킵니다. 바이알(개구부 제외) 또는 건조제를 알루미늄 호일로 덮습니다.
    참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 다음 단계는 필름 건조 후 수행하거나 필름을 파라 필름으로 밀봉 한 아르곤 아래에 -20 ° C 냉동고에서 최대 1 개월 동안 보관할 수 있으며 건조한 상태로 유지하면 더 오래 보관할 수 있습니다.

3. 지질막 수화

참고: 마이크로버블이 in vitro 또는 in vivo에서 사용되는 경우 달리 명시되지 않는 한 3.3-5.4단계에서 멸균 마이크로피펫 팁, 튜브, 주사기 및 바늘을 사용하십시오.

1. 진공 청소기에서 필름을 제거하거나 냉동실에 보관된 경우 RT로 데워지도록 합니다.
2. 250mL 비커에 물을 채우고 물을 70-80°C로 가열합니다.
3. 수조 초음파 처리기를 69 ° C로 가열합니다.
4. 마이크로피펫 1mL의 AA-PGG(1.3단계)를 지질막 바이알의 가장자리 아래로 내려가 기포 생성을 방지합니다.
   알림: 킬레이트되지 않은 제어 또는 형광 전용 미세 기포를 제조할 때는 AA-PGG 대신 PGG(1.2단계)를 사용하십시오.
5. 바이알 입구를 캡으로 부분적으로 덮어 과불화프로판(PFP) 라인을 삽입할 수 있는 충분한 공간을 남겨둡니다. PFP를 액체 위 20초 동안 바이알 헤드 스페이스로 흐르게 하여 액체가 눈에 띄게 방해를 받지만 튀지 않도록 합니다. PFP를 현탁액에 직접 흘려보내지 마십시오. 바이알의 뚜껑을 닫습니다.
   알림: 흐름의 강도와 시간이 적절하면 바이알을 만졌을 때 냉각되기 시작합니다.
6. 바이알의 아래쪽 절반을 70-80°C 수조에 1분 동안 담그십시오. 그런 다음 69°C 수조 초음파 처리기에서 최소 30초 동안 또는 지질 필름이 AA-PGG로 균일하게 분산될 때까지 초음파 처리합니다. 기포를 생성하거나 미세 기포 형성을 조기에 활성화하지 마십시오(조기 활성화는 지질 현탁액에서 유백색/흐린 영역으로 나타납니다). 부유하지 않은 지질이 남아 있는지 더 잘 식별하기 위해 필요할 때 바이알 표면을 닦습니다.
   참고 : 초음파 처리 후 1 분 이내에 지질 필름이 수화되지 않으면 70-80 ° C 수조에서 다시 가열하고 다시 초음파 처리합니다.
7. 지질 필름이 균일하게 현탁되면 마지막으로 1분 동안 가열하고 추가로 30초 동안 초음파 처리합니다.
8. 바이알을 닦고 RT(~5-10분)로 수동적으로 냉각시킵니다.
9. 3.5단계에 따라 바이알 헤드스페이스를 PFP로 다시 채우고, 뚜껑을 씌우고, 파라필름으로 뚜껑을 씌우고 밀봉합니다.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지하고 8시간 이내에 다시 시작할 수 있습니다.

4. 방사선 표지

알림: 킬레이트화되지 않은 제어 또는 형광등 전용 마이크로버블의 경우 프로토콜 섹션 5로 건너뜁니다.

주의: 달리 명시되지 않는 한 방사성 실험실에서 이 프로토콜의 4.4-4.6단계를 수행하십시오. ⁶⁴의CuCl₂ 는 피부 노출, 흡입 또는 섭취를 통한 다계통 독성의 위험이 있는 방사선학적 위험입니다. 가능하면 고무 팁 집게를 사용하여 간접적으로 흄 후드에서 처리하십시오. 취급 시 보호용 실험실 가운, 개인 반지 및 배지 선량계, 이중 장갑을 착용하십시오. ⁶⁴CuCl₂ 가 2인치 리드 차폐에서 처리되는지 확인합니다. 필요한 경우 납으로 덮인 용기에 넣어 운반하십시오. 폐기물 용기를 차폐하고 사용 후 오염에 대한 운영 조사를 수행합니다.

1. 유리 비커 또는 마그네틱 교반 막대가 들어있는 큰 결정화 접시에 60 ° C의 수조를 준비합니다. 물에 삽입된 열 프로브가 장착된 온도 제어 핫/교반 플레이트를 사용하여 약하지만 눈에 띄는 깔때기를 생성하는 속도로 교반하도록 설정합니다.
2. 0.1 N HCl에서 ⁶⁴CuCl₂ 가 들어 있는 밀봉된 바이알을 고무 팁 겸자를 통해 투여 교정기로 옮깁니다.
   참고 : ⁶⁴CuCl₂를 주문할 때 0.1 N HCl의 5-20 μL에 용해되도록 요청하십시오. 더 적은 부피는 마이크로버블 수율을 보존하는 데 중요합니다.
3. 용량 보정기와 시간에서 측정된 구리-64 활성을 주목하십시오. 집게를 사용하여 바이알을 제거하고 납이 함유된 용기에 넣습니다.
4. ⁶⁴CuCl₂ 에 대해 보고된 부피로 기록된 활성을 나누어 MBq·^mL-1 값을 얻습니다.
5. 3.9단계의 지질 현탁액의 캡을 풀고 바이알 홀더에 고정합니다.
6. ⁶⁴CuCl₂ 바이알의 뚜껑을 풀고 집게로 고정합니다.
7. 40-250 MBq의 활성에 해당하는 ⁶⁴CuCl₂ 용액의 부피를 마이크로피펫팅하고 지질 현탁액으로 전달합니다. 피펫 팁이 현탁액에 잠겨 있는지 확인하십시오. 플런지 한 다음 위아래로 피펫을 사용하여 ⁶⁴CuCl₂를 완전히 옮깁니다.
   참고: 추가되는 ⁶⁴CuCl₂ 의 양은 방사성 표지된 마이크로버블에 대한 의도된 응용 분야와 선량 교정기의 감도에 따라 달라집니다. 마우스에서 종방향(주입 후 최대 48시간) PET 및 생체 내 혈액 샘플링의 경우 각각 최소 220MBq 및 50MBq가 권장됩니다.
8. 지질 현탁액과 ⁶⁴CuCl₂ 바이알을 모두 캡으로 닫습니다.
9. 평평한 고무 팁 집게를 사용하여 방사성 지질 현탁액을 수동으로 위아래로 최소 5회 회전하여 현탁액을 통해 ⁶⁴CuCl₂ 를 부드럽게 혼합합니다. 바이알을 흔들거나 떨어뜨리지 말고 기포가 생기지 않도록 하십시오.
10. 오른쪽이 위로 향할 때 현탁액을 안정된 상태로 유지하면서 바이알의 뚜껑을 부드럽게 튕깁니다. 이렇게 하면 캡에 갇힌 액체가 바이알 바닥으로 끌어당기는 데 도움이 됩니다. 바이알의 뚜껑을 조심스럽게 부분적으로 풀고 18G 바늘이 장착된 PFP 라인을 삽입합니다. 3.5단계에 따라 바이알 헤드 공간을 20초 동안 PFP로 채웁니다. 바이알의 뚜껑을 닫고 파라필름으로 밀봉합니다.
11. 용량 보정기에서 바이알 활성을 측정하고 시간을 기록합니다.
    참고: 적절한 활성이 바이알로 전달되지 않은 경우 4.5-4.11단계를 반복하여 ⁶⁴CuCl₂의 적절한 부피를 추가합니다.
12. 바이알을 폼 바이알 홀더에 넣고 바이알의 아래쪽 절반이 열에 노출되도록 밀어 넣습니다. 홀더를 60°C의 교반 수조에 넣고 1시간 동안 가열합니다.
13. 킬레이트 반응이 계속되는 동안 iTLC 플레이트를 준비합니다. 새 장갑을 끼고 유리 극세사 크로마토그래피 용지를 1cm x 8cm 스트립으로 자릅니다. 스트립을 80°C의 유리 건조 오븐에서 가열합니다.
    참고: 이 단계는 비방사성 실험실에서 수행할 수 있습니다.
14. 1시간 후 4.12단계의 바이알을 불에서 제거하고 티슈로 가장자리를 닦습니다.
15. 끝이 고무로 된 집게를 사용하여 바이알을 수동으로 위아래로 회전하여 바이알 벽의 응결을 지질 현탁액으로 재응축합니다.
16. 바이알을 똑바로 세운 상태에서 튜브를 고정하면서 캡을 튕깁니다. 파라필름을 제거하고 캡 주위를 닦아 갇힌 목욕물을 제거합니다.
17. 바이알의 뚜껑을 조심스럽게 열고 지질 현탁액 1-2 μL를 흡입합니다. iTLC 스트립의 하단 중앙에서 1cm 떨어진 곳에서 현탁액을 찾아 바이알의 뚜껑을 다시 닫습니다. 반점을 말리십시오.
    참고: 이상적으로는 반응 혼합물당 최소 2개의 iTLC를 발견하고 확실성을 위해 방사성 표지된 지질 현탁액당 개발해야 합니다.
18. 마이크로피펫 200μL의 iTLC 용리액(단계 1.4에서 준비)을 10mL 시험관 바닥에 넣습니다. 테스트 튜브를 납 용기에 보관합니다. 점박이 iTLC를 튜브에 넣고 용리액이 스트립의 상단 가장자리에서 약 1cm 떨어질 때까지 스트립이 현상되도록 합니다.
19. 집게를 사용하여 현상된 iTLC 스트립을 제거합니다. 스트립을 수직으로 잡고 γ 카운터 및 푸시 캡 호환 원형 기반 5mL 플라스틱 튜브를 통해 각 스트립 3분의 1이 개별 3분의 1에 직접 떨어지도록 합니다. 세 개의 튜브에 푸시 캡을 삽입합니다.
20. γ 카운터에서 스트립이 포함된 튜브와 빈/뚜껑이 있는 제어 튜브를 구리-64 활성으로 측정하고 관련 분당 계수(cpm)를 기록합니다. 배경 활동을 수정하기 위해 다른 판독값에서 제어 튜브 활동을 뺍니다.
    알림: 스트립의 하단 1/3(조각 1)에 대한 수정된 판독값은 구리-64 킬레이트화된 지질 현탁 입자와 관련이 있습니다. 중간 부분(조각 2)에는 비초분자 형태의 유리 구리-64 및 ⁶⁴Cu-pyro-지질 킬레이트 줄무늬가 포함되어 있습니다. 상단 섹션(조각 3)에는 주로 유리 구리-64가 포함되어 있습니다.
21. 방정식 1을 통해 방사화학적 순도를 계산합니다.
    (수식 1)
    참고: 피스 1의 cpm이 불합리하게 낮아 보이거나(예: 피스 2 또는 3보다 낮거나 이에 상응하는 경우) 판독값이 γ-counter 비선형/포화 임계값보다 높은 경우, iTLC에 대한 방사성 표지된 현탁액의 더 낮은 부피 또는 희석된 부분 표본(1-2 μL)을 찾으십시오.
22. 계속하려면 지질 현탁액당 두 iTLC 스트립에서 얻은 방사성 화학적 순도가 ≥ 94%인지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 60°C에서 지질 현탁액을 계속 가열하고 iTLC를 통해 30분 간격으로 킬레이트화를 모니터링합니다.
23. 방사성 표지된 지질 현탁액 바이알과 마이크로피펫 8.89 μL의 1 N NaOH를 현탁액에 넣고 위아래로 피펫팅하여 베이스를 완전히 옮기고 현탁액을 중화합니다. 바이알의 뚜껑을 닫고 집게로 수동으로 돌려 뒤집거나 되돌린 다음 바이알 뚜껑을 부드럽게 두드립니다.
24. 4.10단계에 따라 헤드 스페이스를 PFP로 채우고 파라필름으로 캡을 씌우고 밀봉합니다.

5. 마이크로버블 활성화 및 절연

1. 4530rpm에서 45초 동안 기계식 바이알 셰이커를 통해 지질 현탁액을 활성화하여 유백색 마이크로버블 현탁액을 생성합니다. 바이알을 약 10분 동안 RT로 수동 냉각시킵니다. 그 결과 유백색 현탁액은 시간이 지남에 따라 두 개의 층으로 분리됩니다.
   알림: 바이알 내용물은 활성화 후 유백색으로 보여야 합니다. 활성화 후 중단이 더 명확해지면 활성화가 실패했음을 나타내며, 이에 대한 원인은 이후 섹션에서 논의될 것입니다.
2. RT에 도착하면 바이알을 부드럽게 뒤집거나 되돌려 마이크로 버블 현탁액을 다시 현탁시킵니다. 바이알을 평평한 표면에 놓고 다음과 같이 원하는 마이크로버블 집단을 얻기 위해 디캔팅 전에 2분 동안 기다립니다.
   1. 1mL 플라스틱 주사기에 18G 바늘을 장착하고 공기를 흡입하고 흡입하여 주사기/바늘을 배출합니다. 2분 표시에서 바이알의 뚜껑을 빠르게 열어 한 번의 동작으로 파라필름 밀봉을 뜹습니다.
   2. 바이알 바닥에서 400-550 μL를 추출하여(대상 마이크로버블 집단) 더 큰 원치 않는 마이크로버블 집단의 상단 거품 층의 흡인을 방지합니다.
      알림: 필요한 경우 바이알을 한쪽으로 기울여 거품이 많은/가벼운 층을 흡인하지 않도록 말단 부피를 주사기에 모으십시오.
3. 바늘 가장자리를 조심스럽게 닦아 거품 오염 물질을 제거하고 분리된 마이크로버블 현탁액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 부드럽게 캡을 씌웁니다(캡을 갑자기 열거나 닫지 마십시오). 이것은 방사성 표지된 미세기포의 최종 작동 현탁액입니다.
4. 용량 보정기에서 최종 microbubble 생성물의 활성을 측정하고 시간을 기록합니다. 이 값을 5.2단계에서 디캔팅된 현탁액의 부피로 나누어 MBq·^mL-1 값을 구하고 관심 분야에 따라 주입 부피를 계산합니다.
   참고: 방사성 표지된 마이크로버블은 이제 사용할 준비가 되었습니다. 섹션 6은 최대 24시간 후까지 실행할 수 있습니다. 이러한 방사성 표지된 마이크로버블을 멀티모달(초음파, PET, 형광) 이미징을 통해 생체 내에서 주입 및 추적할 수 있는 방법에 대한 자세한 내용은 Rajora et al.15를 참조하십시오.

6. 방사성 표지 효율성 검증

1. 부드러운 피펫팅 또는 바이알 반전을 통해 microbubble 현탁액을 재현합니다.
   참고: 마이크로 버블 작업 제품을 와류로 만들지 마십시오. 볼텍싱은 마이크로버블 현탁액을 불안정하게 만듭니다.
2. 방사성 표지된 현탁액 10-200μL를 0.5mL 30,000분자량 컷오프(MWCO) 원심분리 필터 장치에 추가합니다. <200 μL 부피를 사용하는 경우 필터 장치에 ddH₂O를 추가하여 총 200 μL 부피를 구성합니다. 필터 장치를 호환 가능한 마이크로 원심분리기 튜브와 캡에 넣습니다.
   참고: 성공적인 프로토콜 완료를 보장하기 위해 방사선 표지된 마이크로버블의 시험관 내 또는 생체 내 사용 전에 그리고 별도로 방사선 표지 테스트를 수행하는 것이 좋습니다. 이 경우, 이 단계에서 더 큰 부피(예: 200μL)를 사용할 수 있습니다. 프로토콜이 이후에 치료 세션에 사용되는 경우, 먼저 치료 볼륨/주사를 준비한 다음 가능한 한 빨리 나머지 방사성 표지된 마이크로버블 현탁액으로 섹션 6을 수행합니다.
3. 상온에서 12,000 x g 에서 10분 동안 원심분리기.
   알림: 마이크로 원심분리기는 납 차폐로 둘러싸여 있어야 합니다.
4. 마이크로 원심분리기 튜브와 캡 사이의 연결을 가위로 자릅니다.
   1. "caps"라고 표시된 20mL 섬광 바이알에 캡을 넣습니다. 필터 장치를 새 마이크로 원심분리기 튜브(튜브 2)로 옮깁니다.
   2. infranatant가 포함된 첫 번째 마이크로 원심분리 튜브를 "tube 1"이라고 표시된 20mL 섬광 바이알에 넣습니다. 튜브 2의 필터 장치에 200μL ddH₂O를 추가합니다.
5. 튜브 2의 필터 장치를 실온에서 12,000 x g 로 원심분리합니다.
6. 6.4단계와 6.5단계를 반복합니다. 튜브 2 캡을 튜브 1 캡이 있는 "캡" 섬광 바이알에 추가합니다. 튜브 2를 새 20mL 섬광 바이알에 넣습니다.
7. 세 번째 마이크로 원심분리기 튜브의 캡을 자르고 6.4단계에 따라 "캡" 바이알에 넣습니다. 필터 장치를 "unit"이라고 표시된 새 20mL 섬광 바이알로 옮기고, 인프라란트가 튜브 3에 남아 있고 "unit" 바이알로 옮겨지지 않도록 합니다. 필터 장치의 가장자리에 방울이 보이면 튜브 3에 다시 넣고 뚜껑을 씌운 다음 10초 동안 스핀다운합니다. 튜브 3을 새 20mL 유리 섬광 바이알에 넣습니다.
8. 5개의 섬광 바이알(튜브 1, 튜브 2, 튜브 3, 캡 및 장치)의 캡을 씌웁니다. 뚜껑이 닫힌 빈 20mL 섬광 바이알 1개를 빈 대조군으로 준비합니다.
9. γ 카운터에서 구리-64 활성을 위해 6개의 섬광 바이알을 측정합니다. 다른 바이알의 활성에서 빈 바이알 활성을 뺍니다. 방정식 2를 사용하여 방사성 표지/킬레이트화 효율을 계산합니다.
   (수식 2)
   알림: 단위 cpm이 비합리적으로 낮거나(예: 튜브보다 낮거나 이에 상응하는 경우) 판독값이 γ-counter 비선형/포화 임계값보다 높은 경우 섬광 바이알을 납 용기에 최대 4일 동안 보관하여 값이 임계값 미만이 될 때까지 활성이 감소할 때까지 감소하고 다시 측정합니다.

7. Microbubble 물리 화학적 특성화

참고: 실험실에서 방사성 시료 처리를 위한 장비를 지정하지 않는 한, 비방사성 "차가운" 구리 킬레이트 시료를 사용하여 미세기포 물리화학적 특성 분석을 수행해야 합니다. 이 "감기" 레테르를 붙이는 것은 one의 예정한 신청에 사용된 microbubbles의 복용량을 사정하기를 위해 생명 인 microbubble 수확량의 평가를 촉진합니다. 게다가, 그것은 통제 unchelated microbubbles와 비교를 허용해서 radiolabeling 과정이 microbubbles의 재산을 교란하지 않다는 것을 지키기 위하여. 이 "저온" 라벨링 및 관련 물리화학적 특성화는 방사성 표지된 마이크로버블을 적용하기 전에 이루어져야 하며 방사성 표지에 대한 수정이 필요한 경우 피드백으로 사용할 수 있습니다(논의 참조).

1. "차가운" 구리 마이크로버블 라벨링
   1. 4.7단계에서 지질 현탁액에 첨가된 ⁶⁴CuCl₂ 용액의 부피, 지질 필름 내 포르피린 어금니 % 조성 및 ⁶⁴CuCl₂ 제품 시트에서 발견된 특정 활성을 사용하여 방사성 표지 중에 달성된 대략적인 금속:포르피린 몰 비율을 계산합니다. 계산 예는 보충 파일 1에서 찾을 수 있습니다.
   2. 현재 프로토콜의 섹션 1-3을 따릅니다.
   3. 0.1 mg · ^mL-1 CuCl₂ 용액을 0.1 N HCl에 준비한다.
   4. 이 CuCl₂ 용액을 7.1.1 단계에서 계산 된 지질 현탁액에 적절한 부피로 마이크로 피펫하고 바이알을 마개합니다.
   5. 바이알을 회전하여 CuCl₂ 를 지질 현탁액에 혼합하고 4.9, 4.10 및 4.12 단계에 따라 헤드 스페이스를 PFP, 밀봉 및 가열로 채웁니다. 바이알 취급에는 고무 집게가 필요하지 않습니다.
   6. 1시간 후 불에서 바이알을 제거하고 외부를 닦아 말리십시오. 바이알을 RT로 식히십시오.
   7. 지질 현탁액을 중화하고, 혼합하고, 헤드 스페이스를 PFP로 채우고, 4.23 및 4.24 단계에 따라 밀봉합니다.
   8. microbubble 현탁액 및 디캔트를 활성화하여 5.1-5.3 단계에 따라 작동하는 제품을 얻습니다.
2. 마이크로버블 사이징
   참고: 마이크로 버블 사이징은 활성화 직후에 수행해야 합니다. 작업 현탁액의 안정성을 평가하는 경우 30분 간격으로 샘플 준비 및 측정을 반복합니다. 일반적으로 1-2시간의 창은 마이크로 버블 작업 현탁액이 활성화 후 사용/투여되는 기간을 나타냅니다. 안정성 측정의 목적은 이 기간 동안 미세 기포 크기와 수율이 유지되도록 하여 작업 용액에서 투여되는 모든 처리에 유사한 미세 기포 집단이 포함되도록 하는 것입니다.
   1. 쿨터 카운터(CC)를 켜고 SOP 편집 도구를 사용하여 다음 매개변수를 설정합니다: 30μm 조리개, 0.6-18μm 크기 범위, 조리개 전류 400-600μA, 프리앰프 게인 4-8, 400bin, 각 실행 전후 플러시, 부피 분석, 5μL 샘플 부피.
   2. 0.2μm 매체 진공 여과 장치를 통해 CC 전해질을 여과합니다. 전해질 용기와 시료 준비를 위한 별도의 용기를 채웁니다.
   3. 백그라운드 측정: 10mL 일회용 큐벳에 10mL 여과된 전해질을 채우고 기준선 측정을 실행합니다. 개수가 400 미만인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 기기를 세척하십시오.
   4. 시료 측정
      1. 여과된 전해질 10mL를 새 큐벳에 추가합니다. 수동으로 반전/되돌리기를 통해 microbubble 현탁액을 재현합니다. 마이크로피펫은 바이알 하단 중앙에서 5μL입니다. 피펫 팁의 가장자리(개구부 제외)를 닦고 시료를 준비된 전해질에 직접 주입합니다.
      2. 서스펜션을 완전히 옮기기 위해 위아래로 피펫을 움직입니다. 피펫 팁을 사용하여 microbubble 현탁액의 "위습"이 분산될 때까지 전해질을 부드럽게 휘젓습니다.
   5. CC에서 샘플을 측정합니다(분석물당 2회 실행).
      참고: 5μL 마이크로버블 샘플 볼륨은 일반적으로 1-5 x 10⁹ 마이크로버블·^mL-1 농도를 포함하는 샘플에 적합합니다. 이 시료 부피는 특정 CC 기기 설정에 따라 그리고 시료 마이크로 버블 수율이 위 범위를 벗어나는 경우 조정해야 할 수 있습니다.
3. 컨포칼 이미징
   참고: 마이크로버블 사이징 직후 및 7.2단계의 메모에 따라 유지된 마이크로버블 안정성이 유지되는 기간 내에 컨포칼 이미징을 수행합니다.
   1. 마이크로버블 현탁액을 재현탁하고 1-5μL를 유리 현미경 슬라이드의 중앙으로 옮깁니다. 기포가 갇히지 않도록 마이크로 버블 서스펜션 방울 위에 커버 슬립을 조심스럽게 놓습니다. 서스펜션은 커버 슬립 아래로 퍼집니다.
   2. 오일 이멀젼 대물렌즈로 60배 배율로 마이크로버블을 이미지화합니다. 명시야 및 633nm 여기/640-765nm 방출 미만의 이미지를 얻을 수 있습니다. 명시야 영상과 형광 영상을 겹쳐 놓습니다.
      알림: 형광 신호는 프로브가 마이크로 버블 껍질 내에 균일하게 통합될 때 보이는 모든 입자의 껍질을 가로질러 겹쳐야 합니다.
4. 분광 형광 측정법
   참고: 분광 형광 측정 측정은 마이크로버블 활성화 후 24시간 이내에 수행할 수 있습니다.
   1. 앞서 설명한 바와 같이 1% Triton X-100을 준비합니다³⁵.
   2. 첫 번째 측정 15-30분 전에 분광형광측정기를 켭니다.
   3. 석영 큐벳에서 410nm 여기 및 600-800nm 방출 범위를 사용하여 1% Triton X-100의 형광 스펙트럼을 측정합니다. 참조 검출기 신호(종종 S1/R1이라고 함)로 신호를 정규화하는 옵션을 선택합니다.
      참고: Triton X-100은 피펫을 넣었을 때 쉽게 거품이 일어납니다. 따라서 큐벳으로 옮길 때는 첫 번째 마이크로피펫 정지까지만 급락하십시오.
   4. 큐벳을 메탄올로 헹구고 샘플 사이에 압축 공기로 건조시킵니다.
   5. 6mL의 1% Triton X-100을 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 마이크로버블 현탁액을 재현탁하고 마이크로피펫을 통해 1μL를 흡입합니다. 개구부를 제외한 피펫 팁의 가장자리를 닦고 시료를 준비된 1% Triton X-100에 옮기고 위아래로 피펫팅하여 전달을 완료합니다. 용액을 소용돌이치고 석영 큐벳으로 옮깁니다.
      참고: 샘플의 비율을 조정하십시오: 기기 감도 및 비선형 포화 임계값에 따라 1% Triton X-100.
   6. 7.4.3단계의 파라미터를 사용하여 이 샘플을 측정합니다. 이 측정은 "파괴된" 입자에 해당합니다.
   7. PBS를 사용하여 7.4.3-7.4.6단계를 반복합니다. 이 측정은 "온전한" 입자에 해당합니다.
   8. 각각 1% Triton X-100 및 PBS 측정을 사용하여 중단된 시료 스펙트럼과 손상되지 않은 시료 스펙트럼을 기준선으로 보정합니다.
   9. PBS(F_PBS) 및 1% Triton X-100(F_Tx)의 온전한 샘플에 대한 통합 베이스라인 보정 형광 신호를 사용하여 방정식 3을 통해 담금질 효율(QE)을 계산합니다.
      (수식 3)
5. UV-Vis 분광도계
   참고: 분광학 측정은 마이크로버블 활성화 후 최대 72시간까지 수행할 수 있습니다.
   1. 현탁액이 투명해질 때까지 RT에서 수조 초음파 처리기를 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에서 microbubble 현탁액의 부분 표본을 초음파 처리합니다. 이렇게 하면 분광학 중 산란 효과가 줄어듭니다.
   2. 첫 번째 측정 10분 전에 분광 광도계를 켭니다. 0.25nm의 스캐닝 간격과 200-800nm의 획득 범위를 선택합니다. 기준선 빼기를 사용하도록 설정합니다.
   3. 측정을 위해 1cm 경로 길이의 석영 큐벳을 사용합니다. 측정 사이에 큐벳을 메탄올로 헹구고 압축 공기로 건조시킵니다.
   4. 메탄올의 기준선 측정값을 얻습니다.
   5. 초음파 처리된 투명한 마이크로버블 현탁액을 소용돌이치고 10-50μL를 200-1000μL의 메탄올을 포함하는 미세 원심분리기 튜브로 전달합니다. 메탄올 부피가 측정되고 깨끗한 유리 마이크로리터 주사기를 통해 튜브에 추가되었는지 확인합니다. Vortex는 "중단된" 샘플을 얻기 위한 솔루션입니다.
      참고: 샘플 희석은 포르피린 로딩 효율과 어금니 % 구성에 따라 달라집니다. 20배 희석은 30 mol% pyro-lipid microbubble 조성에 적합합니다.
   6. UV-Vis 스펙트럼을 수집합니다.
   7. 메탄올 대신 PBS를 사용하여 7.5.4-7.5.6단계를 반복합니다.
      참고: 유리 마이크로리터 주사기 대신 마이크로피펫을 사용하여 PBS 부피를 측정할 수 있습니다.

8. 프로토콜 수정

1. 대체 킬레이터
   1. 대안적인 지질 접합 구리 킬레이트(예: 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid, 이하 DTPA-지질이라고 함)를 pyro-lipid로 대체하여 섹션 2에 따라 지질 필름을 준비합니다. 보충 파일 1 을 사용하여 필요한 질량 및 재고 부피를 계산합니다.
      참고: 대체 킬레이터의 다양한 어금니 구성을 테스트하는 것은 높은 수율을 가진 안정적인 미세 기포가 생성될 수 없는 상한을 결정하는 데 필요할 수 있습니다.
   2. 섹션 3에서 6을 따라 방사성 표지된 마이크로버블을 생성하고 특성화합니다.
   3. 7.1단계부터 7.3단계까지 단계를 수행하여 "차가운" 구리 킬레이트 마이크로버블을 특성화합니다. 입자 형태를 평가하기 위해서는 명시야 컨포칼 현미경 이미지 획득만 필요합니다. 대체 킬레이터가 형광성인 경우 7.4 및 7.5 단계 외에도 관련 여기 및 방출 파장을 사용하여 컨포칼 현미경 검사를 수행합니다.
2. 대체 형광단
   1. 섹션 2에 따라 지질 필름을 준비하고, 파이로 지질을 대체 지질 접합 또는 간간 형광단(예: DiI)으로 대체합니다. 보충 파일 1 을 사용하여 필요한 질량 및 재고 부피를 계산합니다.
      참고: 양자택일 형광단의 다양한 어금니 구성을 테스트하는 것은 높은 수율을 가진 안정적인 미세 기포가 생성될 수 없는 상한을 결정하는 데 필요할 수 있습니다.
   2. AA-PGG 대신 PGG를 사용하여 섹션 3을 따릅니다.
   3. 5.1-5.3단계와 7.2-7.5단계를 완료합니다.
3. "스파이킹(Spiking)" 접근법: 사전 형성된 마이크로버블 지질 현탁액 라벨링
   1. 다른 지질 성분이 없는 파이로-지질만 사용하여 섹션 2에 따라 포르피린-지질 필름을 생성합니다. 파이로 지질의 양에 대해서는 Supplementary File 1 을 참조하십시오.
   2. 1mL의 수화 완충액 대신 100-200μL의 AA-PGG(또는 방사선 표지가 필요하지 않은 경우 PGG)를 사용하여 섹션 3에 따라 파이로 지질 필름을 수화합니다.
   3. 전체 파이로 지질 현탁액을 미리 만들어진 지질 마이크로버블 현탁액으로 옮깁니다.
   4. 헤드 스페이스를 PFP로 채우고, 가열하고, 3.4-3.9 단계에 따라 PFP 아래에서 서스펜션과 씰을 초음파 처리합니다. 사전 제작된 지질 마이크로버블 현탁액으로의 pyro-lipid 현탁액의 분산을 모니터링하고 완전히 분산될 때까지 가열/초음파 처리 주기를 수행합니다.
      참고: 격막으로 밀봉된 상업용 마이크로버블 바이알을 사용하는 경우, 바이알 헤드 스페이스를 PFP로 다시 채우지 않고도 주사기/바늘을 통해 파이로 지질 현탁액을 바이알에 주입할 수 있습니다.
   5. 섹션 4에서 7까지 방사성 라벨링(아래 8.3.5.1 단계 참조), 활성화, 격리(아래 참고 참조) 및 관련 특성화를 수행합니다.
      1. 대안적인 접근법은 먼저 수화된 파이로 지질 현탁액을 방사 표지하고, >94% 방사성 화학적 순도를 모니터링하고, 1 N NaOH로 중화하고(파이로 지질 필름을 수화하는 데 사용되는 AA-PGG 부피에 따라 부피 수정), 그런 다음 8.3.3 단계에 따라 사전 제작된 마이크로 버블 지질 현탁액에 방사성 표지된 파이로 지질 현탁액을 도입하는 것입니다.
         참고: 이 수정된 접근 방식은 지질 수화 중에 생성되었지만 미세 기포에 통합되지 않은 서브미크론 다층 소포를 제거하는 분리 프로세스를 따르는 경우에만 형광 또는 다중 모드 방사성 표지 마이크로버블을 생성하는 데 사용해야 합니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.

방사성 표지된 마이크로버블을 제조할 때 정량화할 수 있는 주요 결과는 방사성 화학적 순도와 방사성 표지 효율입니다. 이 프로토콜은 각각 iTLC와 검증된 원심 절차를 사용하여 각각을 특성화합니다. 그림 2A 는 총 지질의 1 mol%, 10 mol% 또는 30 mol%의 조성에서 숙주 지질이 pyro-lipid를 치환한 상용 마이크로버블 모방 제형에서 평균 방사화학적 순도와 ?...

현재의 지질 마이크로버블 방사성 표지 프로토콜은 >95%의 방사화학적 순도, >95%의 킬레이트화 효율 및 사후 라벨링 정제 없이 마이크로버블 물리화학적 특성의 유지를 달성합니다. 이러한 성과는 기존 라벨링 프로토콜에서 이전에는 달성할 수 없었던 발전을 나타냅니다. 정제 단계가 없기 때문에 방사성 동위원소(이 경우 구리-64)를 더 빠르게 사용할 수 있으므로 방사성 ...

저자는 이해 상충을 보고하지 않습니다.

기술 서비스와 지도를 제공해 주신 Deborah Scollard와 Teesha Komal(온타리오주 토론토 소재 STTARR(University Health Network Stake-Temporal Targeting and Amplification of Radiation Response) 프로그램)에게 감사드립니다. 또한 컨포칼 현미경 검사 중 기술 지원을 해주신 Mark Zheng과 Alex Dhaliwal 박사님, 그리고 관련 장비를 제공해 주신 Advanced Optical Microscopy Facility(온타리오주 토론토)에 감사드립니다. 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research), 테리 폭스 연구소(Terry Fox Research Institute), 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada), 캐나다 혁신 재단(Canada Foundation for Innovation), 프린세스 마가렛 암 재단(Princess Margaret Cancer Foundation), 캐나다 연구 의자 프로그램(Canada Research Chairs Program), 맥러플린 센터(McLaughlin Centre), 바니에 장학금 프로그램(Vanier Scholarship Program), 온타리오 대학원생 장학금 프로그램(Ontario Graduate Student Scholarship Program), 캐나다 전립선암협회(Prostate Cancer Canada), 피터버러 K. M. 헌터 자선 재단(Peterborough K. M. Hunter Charitable Foundation)을 통해 자금을 지원받습니다.