생쥐 중간 대뇌 동맥 폐색 모델을 위한 수제 실리콘 코팅 필라멘트

이 프로토콜은 실리콘, 나일론 봉합사 및 주사기 바늘을 사용하여 마우스의 MCAO(Middle Cerebral Artery Occlusion) 모델을 위한 코팅된 필라멘트를 만드는 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 일정한 직경과 실험 요구에 맞는 다양한 실리콘 포장 길이를 가진 필라멘트를 생산할 수 있습니다.

전 세계 인구가 고령화됨에 따라 허혈성 뇌졸중은 전 세계적으로 장애와 사망의 두 번째 주요 원인으로 부상하여 사회와 가족 모두에게 엄청난 부담을 주고 있습니다. 정맥 혈전용해술 및 혈관내 중재술과 같은 치료법이 급성 허혈성 뇌졸중 환자의 결과를 크게 개선할 수 있지만, 이러한 치료법의 혜택을 받는 개인은 소수에 불과합니다. 이 질병에 대한 이해를 높이고 보다 효과적인 치료법을 발견하기 위해 연구자들은 지속적으로 동물 모델을 개발하고 개선하고 있습니다. 이 중 MCAO(Middle Cerebral Artery Occlusion) 모델은 뇌혈관 질환 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 모델로 두드러집니다. 이 모델에 사용된 필라멘트는 개발에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 일관된 직경과 다양한 길이의 실리콘 코팅을 가진 필라멘트를 만드는 방법을 간략하게 설명합니다. C57 마우스에서 이 방법을 사용하여 생산된 MCAO 모델은 높은 성공과 일관성을 입증하여 허혈성 뇌혈관 질환에 대한 맞춤형 조사를 위한 유용한 도구를 제공합니다.

뇌졸중은 전 세계적으로 가장 흔한 사망 및 장애 원인 중 하나입니다. 허혈성 뇌졸중과 출혈성 뇌졸중은 뇌혈관 질환의 주요 유형이며, 허혈성 뇌졸중이 전체 사례의 약 87%를 차지한다 ^1,2,3. 현재 허혈성 뇌졸중 환자를 위한 두 가지 치료 방식이 있습니다: 재조합 조직 플라스미노겐 활성제(rtPA)를 사용한 약물 요법과 기계적 혈전절제술입니다. 그러나 좁은 치료 창과 광범위한 제외 기준은 이러한 치료법의 적용을 제한하여 소수의 환자에게만 혜택을 줍니다. 이는 허혈성 뇌졸중 치료를 개선하기 위한 지속적인 노력의 필요성을 강조한다 ^4,5. 체외 모델은 뇌졸중 후 복잡한 병태생리학적 반응을 재현하는 데 부적절하여 동물 모델을 전임상 뇌졸중 연구의 필수 구성 요소로 만듭니다. 인간 국소 뇌허혈은 중대뇌동맥(MCA)의 혈전성 또는 색전성 폐색에 의해 가장 자주 발생하며, 이로 인해 MCA 폐색(MCAO)을 시뮬레이션하도록 설계된 설치류 모델의 관련성이 매우 높습니다⁶.

뇌졸중 연구에서 가장 널리 채택된 필라멘트 유도 MCAO 모델은 중대뇌동맥(MCA)이 시작될 때 폐색과 그에 따른 재관류를 촉진하여 뇌의 피질하 및 피질 영역에 걸쳐 광범위한 경색을 유발합니다. 이 모델의 장점은 국소 허혈을 유발한 후 혈류를 회복시키는 능력에 있으며, 이를 통해 인간 뇌졸중⁷에서 관찰된 병태생리학적 과정과 유사합니다. 또한, 이 모델은 손상 정도에 중요한 요소인 재관류 손상을 시뮬레이션합니다⁸. 그러나 MCAO 모델에는 경색 용적의 변동성을 포함하여 한계가 있으며, 일부 연구에서는 표준 편차가 평균값의 최대 64%에 도달할 수 있습니다⁹. 30년 이상의 사용에도 불구하고 모델의 신뢰성을 높이기 위한 노력이 진행 중이지만 연구 및 실험실 전반에 걸쳐 허혈성 병변 부피의 상당한 차이가 지속되고 있습니다 10,11,12.

이 기사에서는 신경학적 결손 점수와 뇌경색 영역을 평가하는 모델을 유도하기 위한 자체 제작 필라멘트를 소개합니다. 실리콘으로 코팅된 필라멘트 길이와 MCAO 모델의 성공 및 안정성 간의 상관 관계를 조사합니다. 이 생산 기술은 훌륭한 일관성을 가진 필라멘트를 생성하여 상대적으로 안정적인 MCAO 모델 개발에 기여합니다.

모든 동물 절차는 산시성 인민병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호: 2024년 성급 의료 윤리 위원회 제64호)에서 승인한 실험 절차 및 표준을 준수했습니다. 이 실험에 사용 된 마우스는 8-10 주령의 수컷 C57BL / 6 마우스, 체중 24-26g이었다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 필라멘트 준비

1. 원래 필라멘트 표시: 6-0 나일론 봉합사를 플라스틱 눈금자 플레이트에 고르게 감습니다. 필라멘트 헤드에서 5mm와 10mm 떨어진 곳에 표시를 합니다(코팅 마크 포인트와 삽입 깊이 마크 포인트 포함).
2. 양쪽 끝이 완벽한 원형이 되도록 날로 수직으로 아래쪽으로 절단하면 초기 2cm 길이의 필라멘트가 생성됩니다(그림 1).
3. 코팅 장치 제작: 지혈 겸자를 사용하여 26G 주사기의 바늘 머리를 잘라낸 다음 바늘 구멍을 사포로 완벽한 원형으로 연마합니다. 10mK 주사기로 K-704 실리콘 실란트 2mL를 추출하고 마지막으로 바늘 머리를 주사기에 부착합니다.
4. 필라멘트 코팅: 준비된 바늘 구멍에 표시된 5mm 또는 10mm 위치까지 초기 필라멘트를 삽입합니다. 필라멘트가 실체 현미경으로 완전히 코팅될 때까지 주사기를 천천히 꾸준히 밉니다(그림 2).
5. 코팅된 필라멘트 설정: 코팅된 필라멘트를 접착 테이프로 똑바로 고정하고 실리콘이 완전히 굳을 때까지 약 20분 동안 기다립니다.
6. 살균 및 포장: 준비된 필라멘트를 75% 알코올에 담그고 면봉으로 닦아낸 다음 5mL 원심분리기 튜브에 포장합니다.

2. MCAO 모델

참고: 수술 도구는 고압멸균(121°C, 15psi에서 60분)으로 멸균했습니다. 수술대 및 기타 장비는 75% 에탄올을 사용하여 소독했습니다. 생쥐는 수술 전 8시간 동안 금식했지만 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다.

1. 수술 60분 전에 진통제를 위해 5mg/kg의 meloxicam을 피하로 투여합니다. 마취 중 마우스의 체온을 37°C로 유지하기 위해 열 담요를 연결합니다.
2. 자발적인 움직임과 수염 경련이 멈출 때까지 4% 이소플루란으로 마취를 유도한 다음 1.5%로 마취를 유지합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 양쪽 눈에 안연고를 바릅니다.
3. 마우스를 누운 자세로 눕히고 머리와 팔다리를 고정하고 목과 가슴 위쪽의 털을 면도하고 75% 에탄올로 피부를 안쪽에서 바깥쪽으로 소독합니다.
4. 아래턱에서 흉골까지 목 정중선을 따라 2.5cm 길이의 피부 절개를 만듭니다.
5. 오른쪽 목 근육을 둔탁하게 절개하여 경동맥 덮개를 노출시킵니다. 안과 겸자를 사용하여 덮개를 열고 총경동맥(CCA), 외부 경동맥(ECA) 및 내부 경동맥(ICA)을 분리하고 미주 신경을 방해하지 않도록 주의합니다.
6. 분기 전에 슬립노트로 CCA를 임시로 접합하고 미세 수술 동맥 클램프로 ICA를 고정합니다.
7. 양극성 응고 펜을 사용하여 ECA의 상갑상선 동맥을 소작합니다.
8. 결찰을 위해 ECA에 두 개의 나사산을 남겨 두십시오: 하나는 영구 결찰을 위해 원위 끝에 있고 다른 하나는 나중에 사용할 수 있도록 느슨한 매듭이 있는 근위 끝에 있습니다. 안과 가위를 사용하여 ECA의 두 합자 사이를 약 0.5mm 절개하여 필라멘트를 삽입합니다.
9. 절개 부위를 통해 5mm 또는 10mm 실리콘 코팅 필라멘트를 CCA에 삽입한 다음 느슨한 매듭을 조여 고정합니다.
10. ECA의 말단부를 절단하고 ICA에서 클램프를 제거한 후 필라멘트를 CCA 분기점으로 후퇴시킵니다. 그런 다음 저항이 느껴질 때까지 필라멘트를 뒤집어 깊은 ICA로 전진시킵니다. 필라멘트를 약간 빼내고 매듭을 조여 고정합니다.
11. 3-0 봉합사로 동물의 피부를 봉합하고 상처를 요오드로 소독합니다. 마우스를 회수 챔버에 1시간 동안 넣습니다.
12. 마우스를 다시 마취하고 필라멘트를 부드럽게 제거하고 필라멘트를 고정하는 ECA 결찰실을 묶고 CCA 슬립매듭을 풀어 혈류를 회복하고 중대뇌동맥을 재관류합니다.
13. 여분의 실을 다듬고 목 피부를 봉합하고 해당 부위를 한 번 더 소독합니다.

3. 가짜 운영

1. 가짜 수술의 경우, 7mm 실리콘 코팅 필라멘트를 삽입하여 오른쪽 중대뇌동맥을 폐색한 다음 즉시 빼내어 즉각적인 재관류를 가능하게 합니다.
   참고: 후속 절차는 뇌허혈을 겪는 동물에게 수행된 절차와 동일합니다.

4. 뉴로스코어

1. 각 그룹의 실험 동물을 열린 들판에 놓고 뇌허혈 재관류 후 4시간 후에 수술 후 행동 점수를 매깁니다.
2. 성공적인 모델링을 위해서는 1에서 3 사이의 점수를 고려하십시오. 평가 기준은 표 1에 자세히 설명된 바와 같이 Longa 채점 방법¹⁰을 기반으로 합니다.
3. 재관류 후 24시간 및 72시간에 평가를 수행하여 mNSS(Modified Neurologic Severity Scores)¹³에 따라 신경학적 결손을 평가합니다( 표 2 참조).

5. 경심 관류

1. 1.5% 펜토바르비탈 나트륨으로 마우스를 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 마우스를 케이지에 다시 넣고 10분 동안 기다립니다. 그런 다음 마우스의 발가락을 꼬집어 반사 신경이 없는지 테스트하고 깊은 마취를 확인합니다.
2. 마우스를 폼 스탠드에 누운 자세로 놓고 팔다리를 고정합니다.
3. 25G 바늘의 끝을 잘라 무디게 하면 대동맥 벽이 뚫리는 것을 방지할 수 있습니다. 20mL의 식염수가 채워진 주사기에 바늘을 연결합니다.
4. 흉부의 털을 들어 올리고 가위를 사용하여 피부를 잘라내어 xiphoid 과정을 노출시킵니다. xiphoid process를 잡고 그 아래를 수평으로 절단하여 근육층을 열어 횡격막을 노출시킵니다. 심장이 손상되지 않도록 가위로 횡격막을 조심스럽게 자릅니다.
5. 흉골의 바깥쪽을 따라 잘라 양쪽의 흉곽을 열고 흉곽의 전벽을 뒤집어 지혈기로 고정합니다.
6. 면봉을 사용하여 심장 기저부의 지방을 제거하고 대동맥의 뿌리를 노출시킵니다.
7. 집게로 심장을 고정하고 심장 정점에 바늘을 삽입한 다음 바늘이 대동맥 벽을 통해 보일 때까지 비스듬히 위쪽으로 전진합니다. 바늘을 제자리에 고정합니다.
8. 혈류를 관찰하기 위해 우심방을 작게 절개합니다. 주사기로 식염수를 꾸준히 관류하면서 혈액이 우심방으로 나오는지 지켜봅니다. 폐수가 맑아지면 관류를 중지하십시오¹⁴.
9. 관류 후 마우스의 목을 베어 뇌¹⁵ 를 적출하고 추가 처리를 위해 -20 °C 냉동고에 넣습니다.

6. TTC 염색에 의한 경색 부피 평가

1. 조달한 뇌 조직을 -20°C 냉동고에서 20분 동안 빠르게 동결한 다음 미리 식힌 뇌 슬라이싱 몰드에 놓고 1mm 두께의 조각으로 자릅니다.
2. 얻어진 뇌 절편을 2% TTC 용액에 담그고 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
3. 뇌 절편을 4% 파라포름알데히드에 하룻밤 동안 담그고 다음 날 사진을 찍습니다.
4. ImageJ를 사용하여 각 슬라이스의 경색 부위와 전체 뇌 면적을 측정합니다. 다음 공식을 사용하여 경색 부피 비율을 계산합니다: Infarct Volume % = (경색 면적의 합 / 전체 뇌 면적의 합) × 100%.

MCAO 모델을 만들 때 필라멘트와 완성된 필라멘트를 제작하는 데 사용되는 기본 도구는 그림 3에 나와 있습니다. 필라멘트 생산 후 MCAO 모델은 외부 경동맥을 통해 필라멘트를 삽입하고 수술 기간을 기록하여 확립됩니다. 성공적인 모델링은 필라멘트 철수 후 1-3 4시간의 Longa 점수로 정의됩니다. 체중은 수술 후 매일 모니터링됩니다. 신경학적 결손은 ...

이 연구는 필라멘트를 제작하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 보여주며 MCAO 모델 생성의 타당성을 확인합니다. 필라멘트의 실리콘 코팅의 길이는 실험적 필요에 따라 조정할 수 있어 추가적인 유연성을 제공합니다. 5mm 필라멘트 색전의 준비는 마우스에서 지주막하 출혈(SAH)이 발생하지 않고 100% 성공률을 달성했습니다. 10mm 필라멘트 색전을 사용한 그룹에서는 SAH가 발?...

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 연구는 Wu Jieping Medical Foundation(320.6750.161290)의 지원을 받았습니다.