Filamento rivestito in silicone artigianale per topi modelli di occlusione dell'arteria cerebrale media

Questo protocollo descrive un metodo semplice per la creazione di filamenti rivestiti per il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) nei topi utilizzando silicone, suture di nylon e aghi per siringa. Questo metodo consente la produzione di filamenti con un diametro costante e varie lunghezze di avvolgimento del silicone su misura per le esigenze sperimentali.

Con l'invecchiamento della popolazione globale, l'ictus ischemico è diventato la seconda causa di disabilità e mortalità in tutto il mondo, ponendo un onere immenso sia sulla società che sulle famiglie. Sebbene trattamenti come la trombolisi endovenosa e gli interventi endovascolari possano migliorare sostanzialmente gli esiti per i pazienti con ictus ischemico acuto, solo una piccola percentuale di individui beneficia di queste terapie. Per far progredire la nostra comprensione della malattia e scoprire trattamenti più efficaci, i ricercatori sviluppano e perfezionano continuamente modelli animali. Tra questi, il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) si distingue come il modello più comunemente utilizzato nella ricerca sulle malattie cerebrovascolari. Il filamento utilizzato in questo modello è fondamentale per il suo sviluppo. Questo protocollo delinea un metodo per creare filamenti con diametri coerenti e lunghezze variabili di rivestimento in silicone. Il modello MCAO prodotto utilizzando questo metodo nei topi C57 ha dimostrato un elevato successo e coerenza, offrendo uno strumento prezioso per indagini su misura nelle malattie cerebrovascolari ischemiche.

L'ictus è una delle cause più diffuse di mortalità e disabilità in tutto il mondo. Gli ictus ischemici ed emorragici sono i principali tipi di evento cerebrovascolare, con ictus ischemici che rappresentano circa l'87% dei casi ^1,2,3. Attualmente, esistono due modalità di trattamento per i pazienti con ictus ischemico: terapia farmacologica con attivatore tissutale ricombinante del plasminogeno (rtPA) e trombectomia meccanica. Tuttavia, la finestra terapeutica ristretta e gli ampi criteri di esclusione limitano l'applicazione di questi trattamenti, a beneficio solo di una minoranza di pazienti. Ciò sottolinea la necessità di continuare gli sforzi per migliorare le terapie per l'ictus ischemico ^4,5. I modelli in vitro sono inadeguati per replicare le complesse risposte fisiopatologiche a seguito di un ictus, rendendo i modelli animali una componente indispensabile della ricerca preclinica sull'ictus. L'ischemia cerebrale focale umana è più frequentemente causata dall'occlusione trombotica o embolica dell'arteria cerebrale media (MCA), il che rende altamente rilevanti i modelli di roditori progettati per simulare l'occlusione MCA (MCAO)⁶.

Il modello MCAO indotto da filamenti, il più ampiamente adottato nella ricerca sull'ictus, facilita l'occlusione all'inizio dell'arteria cerebrale media (MCA) e la successiva riperfusione, portando a estese infarti nelle aree sottocorticali e corticali del cervello. Il vantaggio di questo modello risiede nella sua capacità di ripristinare il flusso sanguigno dopo aver indotto un'ischemia focale, parallelamente ai processi fisiopatologici osservati nell'ictus umano⁷. Inoltre, il modello simula il danno da riperfusione, un fattore critico nell'entità del danno⁸. Tuttavia, il modello MCAO presenta dei limiti, tra cui la variabilità del volume dell'infarto, con la deviazione standard che in alcuni studi raggiunge potenzialmente il 64% del valore medio⁹. Nonostante oltre tre decenni di utilizzo, gli sforzi per migliorare l'affidabilità del modello sono in corso, ma persistono variazioni significative nel volume delle lesioni ischemiche negli studi e nei laboratori 10,11,12.

Questo articolo introduce un filamento autoprodotto per l'induzione di modelli che valutano i punteggi di deficit neurologico e le aree di infarto cerebrale. Esamina la correlazione tra le lunghezze dei filamenti rivestiti di silicone e il successo e la stabilità del modello MCAO. Questa tecnica di produzione produce filamenti con una consistenza encomiabile, contribuendo allo sviluppo di un modello MCAO relativamente stabile.

Tutte le procedure per gli animali hanno aderito alle procedure sperimentali e agli standard approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Ospedale Provinciale del Popolo dello Shanxi (numero di approvazione: 2024 Comitato Etico Medico Provinciale n. 64). I topi utilizzati in questo esperimento erano topi maschi C57BL/6, di 8-10 settimane, del peso di 24-26 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione del filamento

1. Marcatura del filamento originale: avvolgere la sutura di nylon 6-0 in modo uniforme attorno a una piastra righello di plastica. Tracciare dei segni a 5 mm e 10 mm dalla testa del filamento (compreso il punto di segno di rivestimento e il punto di segno di profondità di inserimento).
2. Tagliare verticalmente verso il basso con una lama per assicurarsi che entrambe le estremità siano perfettamente circolari, ottenendo un filamento iniziale lungo 2 cm (Figura 1).
3. Fabbricazione del dispositivo di rivestimento: utilizzare una pinza emostatica per staccare la testa dell'ago di una siringa da 26 G, quindi lucidare il foro dell'ago in un cerchio perfetto con carta vetrata. Aspirare 2 ml di sigillante siliconico K-704 con una siringa da 10 mK e, infine, collegare la testa dell'ago alla siringa.
4. Rivestimento del filamento: Inserire il filamento iniziale nel foro dell'ago preparato fino alla posizione contrassegnata di 5 mm o 10 mm. Spingere lentamente e costantemente la siringa fino a quando il filamento non è completamente rivestito sotto uno stereomicroscopio (Figura 2).
5. Impostazione del filamento rivestito: Fissare il filamento rivestito in posizione verticale con del nastro adesivo e attendere circa 20 minuti affinché il silicone si solidifichi completamente.
6. Sterilizzazione e confezionamento: immergere i filamenti preparati in alcol al 75%, asciugarli con un batuffolo di cotone e quindi confezionarli in provette da centrifuga da 5 ml.

2. Modello MCAO

NOTA: Gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave (121 °C a 15 psi per 60 minuti). Il tavolo operatorio e le altre attrezzature sono state sanificate utilizzando etanolo al 75%. I topi sono stati digiunati per 8 ore prima dell'intervento, ma è stato loro permesso di accedere liberamente all'acqua.

1. Somministrare 5 mg/kg di meloxicam per via sottocutanea per l'analgesia 60 minuti prima dell'intervento chirurgico. Collegare una coperta termica per mantenere la temperatura corporea del topo a 37 °C durante l'anestesia.
2. Indurre l'anestesia con isoflurano al 4% fino a quando i movimenti spontanei e le contrazioni dei baffi cessano, quindi mantenere l'anestesia all'1,5% (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente). Applicare l'unguento per gli occhi su entrambi gli occhi.
3. Metti il topo in posizione supina, fissa la testa e gli arti, rade i peli sul collo e sulla parte superiore del torace e disinfetta la pelle con etanolo al 75% dall'interno verso l'esterno.
4. Praticare un'incisione cutanea lunga 2,5 cm lungo la linea mediana del collo, dalla mascella inferiore allo sterno.
5. Sezionare senza mezzi termini i muscoli del collo destro per esporre la guaina carotidea. Utilizzare una pinza oftalmica per aprire la guaina e separare l'arteria carotide comune (CCA), l'arteria carotide esterna (ECA) e l'arteria carotide interna (ICA), facendo attenzione a non disturbare il nervo vago.
6. Legare temporaneamente il CCA con un nodo scorsoio prima della biforcazione e bloccare l'ICA con un morsetto microchirurgico dell'arteria.
7. Cauterizzare l'arteria tiroidea superiore dall'ECA utilizzando una penna per coagulazione bipolare.
8. Lasciare due fili sull'ECA per la legatura: uno sull'estremità distale per la legatura permanente e un altro sull'estremità prossimale con un nodo sciolto per un uso futuro. Praticare un'incisione di circa 0,5 mm tra le due legature sull'ECA utilizzando le forbici oftalmiche per inserire il filamento.
9. Inserire il filamento rivestito di silicone da 5 mm o 10 mm nel CCA attraverso l'incisione e poi fissarlo stringendo il nodo sciolto.
10. Dopo aver tagliato l'estremità distale dell'ECA e rimosso il morsetto dall'ICA, ritrarre il filamento fino alla biforcazione CCA. Quindi, capovolgere e far avanzare il filamento nell'ICA profondo finché non si avverte resistenza. Ritira leggermente il filamento e fissalo stringendo il nodo.
11. Suturare la pelle dell'animale con sutura 3-0 e disinfettare la ferita con iodio. Metti il mouse in una camera di recupero per 1 ora.
12. Anestetizzare nuovamente il topo, rimuovere delicatamente il filamento, legare il filo di legatura ECA che fissa il filamento e rilasciare il nodo scorsoio CCA per ripristinare il flusso sanguigno e riperfondere l'arteria cerebrale media.
13. Taglia i fili in eccesso, sutura la pelle del collo e disinfetta nuovamente l'area.

3. Operazione fittizia

1. Per le operazioni fittizie, inserire un filamento rivestito di silicone da 7 mm per occludere l'arteria cerebrale media destra e quindi ritirarlo immediatamente per consentire la riperfusione istantanea.
   NOTA: La procedura successiva è identica a quella eseguita su animali sottoposti a ischemia cerebrale.

4. Punteggio neurologico

1. Posizionare gli animali da esperimento di ciascun gruppo in campo aperto e condurre un punteggio postoperatorio comportamentale 4 ore dopo la riperfusione dell'ischemia cerebrale.
2. Per una modellazione di successo, prendere in considerazione punteggi compresi tra 1 e 3. I criteri di valutazione si basano sul metodo di punteggio Longa¹⁰, come dettagliato nella Tabella 1.
3. Valutare i deficit neurologici in base ai punteggi di gravità neurologica modificata (mNSS)¹³, con valutazioni effettuate a 24 ore e 72 ore dopo la riperfusione (vedere Tabella 2).

5. Perfusione transcardiaca

1. Anestetizzare il topo con pentobarbital sodico all'1,5% (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Rimetti il mouse nella sua gabbia e attendi 10 minuti. Quindi, pizzica le dita dei piedi del topo per verificare l'assenza di riflessi e garantire un'anestesia profonda.
2. Posizionare il mouse in posizione supina su un supporto in schiuma e fissarne gli arti.
3. Tagliare la punta di un ago da 25 G per smussarlo, prevenendo la puntura della parete aortica. Collegare l'ago a una siringa riempita con 20 mL di soluzione fisiologica.
4. Solleva la pelliccia del torace e usa le forbici per tagliare via la pelle per esporre il processo xifoideo. Afferrare il processo xifoideo e tagliare orizzontalmente sotto di esso per esporre il diaframma aprendo lo strato muscolare. Tagliare con cura il diaframma con le forbici, evitando danni al cuore.
5. Tagliare lungo il lato esterno dello sterno per aprire la gabbia toracica su entrambi i lati, capovolgere la parete anteriore del torace e fissarla con emostatici.
6. Usa un batuffolo di cotone per rimuovere il grasso alla base del cuore, esponendo la radice dell'aorta.
7. Fissare il cuore con una pinza, inserire l'ago all'apice del cuore e avanzare obliquamente verso l'alto fino a quando l'ago è visibile attraverso la parete aortica. Bloccare l'ago in posizione.
8. Fai un piccolo taglio nell'atrio destro per osservare il flusso sanguigno. Perfondere costantemente la soluzione salina con la siringa, osservando che il sangue esca dall'atrio destro. Una volta che l'effluente è limpido, fermare la perfusione¹⁴.
9. Dopo la perfusione, decapitare il topo per raccogliere il cervello¹⁵ e metterlo in un congelatore a -20 °C per un'ulteriore lavorazione.

6. Valutazione del volume dell'infarto mediante colorazione TTC

1. Congelare rapidamente i tessuti cerebrali prelevati in un congelatore a -20 °C per 20 minuti, quindi posizionarli su uno stampo per affettare il cervello pre-raffreddato e sezionarli in fette spesse 1 mm.
2. Immergere le sezioni cerebrali ottenute in una soluzione TTC al 2% e incubare a 37 °C per 20 minuti.
3. Immergere le fette di cervello in paraformaldeide al 4% per una notte e scattare fotografie il giorno successivo.
4. Misurare l'area infartuata per ogni fetta e l'area cerebrale totale utilizzando ImageJ. Calcola il rapporto del volume dell'infarto utilizzando la formula: Volume dell'infarto % = (Somma delle aree infartuate / Somma delle aree cerebrali totali) × 100%.

Nella creazione del modello MCAO, gli strumenti principali utilizzati per fabbricare i filamenti e i filamenti finiti sono mostrati nella Figura 3. Dopo la produzione del filamento, il modello MCAO viene stabilito inserendo il filamento attraverso l'arteria carotide esterna, con la durata dell'operazione registrata. Il successo della modellazione è definito da un punteggio Longa di 1-3 4 ore dopo il ritiro del filamento. Il peso corporeo viene monitorato qu...

Questo studio dimostra un metodo semplice ed economico per la fabbricazione del filamento, confermando la sua fattibilità nella creazione di un modello MCAO. La lunghezza del rivestimento in silicone del filamento può essere regolata in base alle esigenze sperimentali, offrendo ulteriore flessibilità. La preparazione di un embolo filamentoso da 5 mm ha raggiunto un tasso di successo del 100% senza alcuna insorgenza di emorragia subaracnoidea (SAH) nei topi. Nel gruppo che utilizzava e...

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Wu Jieping Medical Foundation (320.6750.161290).