用于小鼠的手工硅胶涂层细丝大脑中动脉闭塞模型

该协议描述了一种使用硅胶、尼龙缝合线和注射器针头为小鼠大脑中动脉闭塞 （MCAO） 模型创建涂层细丝的简单方法。这种方法可以生产具有一致直径和各种硅胶缠绕长度的细丝，以满足实验需求。

随着全球人口老龄化，缺血性中风已上升为全球残疾和死亡的第二大原因，给社会和家庭带来了巨大的负担。尽管静脉溶栓和血管内介入治疗等治疗可以显着改善急性缺血性卒中患者的预后，但只有一小部分人从这些疗法中受益。为了加深我们对这种疾病的理解并发现更有效的治疗方法，研究人员正在不断开发和完善动物模型。其中，大脑中动脉闭塞 （MCAO） 模型是脑血管疾病研究中最常用的模型。该模型中使用的细丝对其开发至关重要。该协议概述了一种制造具有一致直径和不同长度的硅涂层细丝的方法。使用这种方法在 C57 小鼠中生成的 MCAO 模型已显示出很高的成功率和一致性，为缺血性脑血管疾病的定制研究提供了有价值的工具。

中风是全世界最普遍的死亡和残疾原因之一。缺血性和出血性卒中是脑血管事件的主要类型，缺血性卒中约占病例的 87% ^1,2,3。目前，缺血性卒中患者有两种治疗方式：重组组织纤溶酶原激活剂 （rtPA） 药物治疗和机械血栓切除术。然而，狭窄的治疗窗口和广泛的排除标准限制了这些治疗的应用，仅使少数患者受益。这强调了继续努力改进缺血性卒中治疗的必要性 ^4,5。体外模型不足以复制中风后复杂的病理生理反应，这使得动物模型成为临床前中风研究中不可或缺的组成部分。人类局灶性脑缺血最常见的原因是大脑中动脉 （MCA） 的血栓形成或栓塞性闭塞，这使得旨在模拟 MCA 闭塞 （MCAO） 的啮齿动物模型具有高度相关性⁶。

细导的 MCAO 模型是中风研究中应用最广泛的模型，有助于大脑中动脉 （MCA） 开始时的闭塞和随后的再灌注，导致大脑皮质下和皮质区域的广泛梗死。该模型的优点在于它能够在诱导局灶性缺血后恢复血流，从而与在人类中风中观察到的病理生理过程相似⁷。此外，该模型还模拟了再灌注损伤，这是损伤程度的一个关键因素⁸。然而，MCAO 模型存在局限性，包括梗死体积的可变性，在一些研究中，标准差可能达到平均值的 64%⁹。尽管使用了三十多年，但不断提高该模型可靠性的努力仍在进行中，但缺血病灶体积在研究和实验室中仍然存在显着变化 10,11,12。

本文介绍了一种自制的细丝，用于评估神经功能缺损评分和脑梗死区域的诱导模型。它研究了涂有硅胶的细丝长度与 MCAO 模型的成功和稳定性之间的相关性。这种生产技术产生的细丝具有值得称道的一致性，有助于开发相对稳定的 MCAO 模型。

所有动物作均遵守山西省人民医院机构动物护理与使用委员会批准的实验程序和标准（批准文号：2024 省医管委第64号）。本实验中使用的小鼠为雄性 C57BL/6 小鼠，8-10 周龄，体重 24-26 g。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 细丝准备

1. 标记原始细丝：将 6-0 尼龙缝合线均匀缠绕在塑料尺板上。在距灯丝头 5 mm 和 10 mm 处（包括涂层标记点和插入深度标记点）处做标记。
2. 用刀片垂直向下切割，以确保两端完全圆形，从而产生初始 2 厘米长的细丝（图 1）。
3. 涂层装置的制作：用止血钳折断 26 G 注射器的针头，然后用砂纸将针孔打磨成完美的圆圈。用 2 mK 注射器吸取 704 mL 的 K-10 硅酮密封胶，最后，将针头连接到注射器上。
4. 涂布细丝：将初始细丝插入准备好的针孔中，直至标记的 5 毫米或 10 毫米位置。缓慢而稳定地推动注射器，直到细丝在立体显微镜下完全涂覆（图 2）。
5. 设置涂层耗材：用胶带将涂层耗材直立固定，等待约 20 分钟，让硅胶完全凝固。
6. 灭菌和包装：将制备好的细丝浸泡在 75% 酒精中，用棉签擦干，然后包装在 5 mL 离心管中。

2. MCAO 模型

注：手术工具通过高压灭菌（121 °C ，15 psi 60 分钟）灭菌。手术台和其他设备使用 75% 乙醇进行消毒。小鼠术前禁食 8 h，但允许自由饮水。

1. 手术前 60 分钟皮下注射 5 mg/kg 美洛昔康用于镇痛。连接加热毯，在麻醉期间将小鼠的体温保持在 37 °C。
2. 用 4% 异氟醚诱导麻醉，直到自发运动和胡须抽搐停止，然后将麻醉维持在 1.5%（遵循机构批准的方案）。将眼药膏涂抹在双眼上。
3. 将鼠标仰卧放置，固定头部和四肢，剃掉脖子和上胸部的毛发，用 75% 乙醇从内到外对皮肤进行消毒。
4. 沿着颈部中线，从下颌到胸骨，做一个 2.5 厘米长的皮肤切口。
5. 钝器解剖右颈部肌肉，露出颈动脉鞘。使用眼镊打开鞘，将颈总动脉 （CCA）、颈外动脉 （ECA） 和颈内动脉 （ICA） 分开，小心避免干扰迷走神经。
6. 在分叉前用活结暂时结扎 CCA，并用显微外科动脉夹夹住 ICA。
7. 使用双极凝血笔烧灼 ECA 的甲状腺上动脉。
8. 在 ECA 上留下两条线用于结扎：一根在远端用于永久结扎，另一根在近端，打一个松散的结以备将来使用。使用眼科剪刀在 ECA 上的两个结扎线之间做一个大约 0.5 毫米的切口，以插入细丝。
9. 通过切口将 5 毫米或 10 毫米的硅胶涂层细丝插入 CCA，然后通过拧紧松散的结将其固定。
10. 切断 ECA 的远端并从 ICA 上取下夹子后，将细丝缩回 CCA 分叉处。然后，将细丝翻转并推进到深 ICA 中，直到感觉到阻力。稍微抽出细丝并通过收紧结来固定它。
11. 用 3-0 缝合线缝合动物的皮肤，并用碘消毒伤口。将鼠标置于恢复室中 1 小时。
12. 再次麻醉小鼠，轻轻取出细丝，系上固定细丝的 ECA 结扎线，松开 CCA 活结以恢复血流并重新灌注大脑中动脉。
13. 修剪多余的线，缝合颈部皮肤，并再次对该区域进行消毒。

3. 假手术

1. 对于假手术，插入一根 7 毫米的硅胶涂层细丝以阻塞右大脑中动脉，然后立即将其撤回以允许立即再灌注。
   注意：随后的程序与对经历脑缺血的动物进行的程序相同。

4. 神经评分

1. 将每组实验动物置于空旷场地，脑缺血再灌注后 4 小时进行术后行为评分。
2. 为了成功建模，请考虑 1 到 3 之间的分数。评估标准基于 Longa 评分方法¹⁰，详见 表 1。
3. 根据改良的神经严重程度评分 （mNSS） ¹³ 评估神经功能缺损，在再灌注后 24 小时和 72 小时进行评估（见 表 2）。

5. 经心灌注

1. 用 1.5% 戊巴比妥钠麻醉小鼠（遵循机构批准的方案）。将鼠标放回笼子中并等待 10 分钟。然后，捏住鼠标的脚趾以测试是否有反射并确保深度麻醉。
2. 将鼠标仰卧在泡沫支架上并固定其四肢。
3. 剪掉 25 G 针的尖端以使其变钝，防止穿刺主动脉壁。将针头连接到装满 20 mL 生理盐水的注射器上。
4. 提起胸部的皮毛，用剪刀剪掉皮肤，露出剑突。抓住剑突并在其下方水平切割，通过打开肌肉层来露出横膈膜。用剪刀小心地剪断隔膜，以免损伤心脏。
5. 沿胸骨外侧切开两侧的胸腔，翻转胸前壁，用止血钳固定。
6. 用棉签去除心脏底部的脂肪，露出主动脉的根部。
7. 用镊子固定心脏，将针头插入心脏的顶点，然后斜向上推进，直到透过主动脉壁可以看到针头。将针夹在适当的位置。
8. 在右心房做一个小切口以观察血流。用注射器稳定灌注生理盐水，观察血液是否流出右心房。流出物清除后，停止灌注¹⁴.
9. 灌注后，将小鼠斩首以收获大脑¹⁵ 并将其置于 -20 °C 冰箱中进行进一步处理。

6. 通过 TTC 染色评估梗死体积

1. 将获得的脑组织在 -20 °C 冰箱中快速冷冻 20 分钟，然后将它们放在预冷的脑切片模具上，并将它们切成 1 毫米厚的切片。
2. 将获得的脑切片浸入 2% TTC 溶液中，并在 37 °C 下孵育 20 分钟。
3. 将脑切片浸入 4% 多聚甲醛中过夜，第二天拍照。
4. 使用 ImageJ 测量每个切片的梗塞面积和总脑面积。使用以下公式计算梗塞体积比：梗塞体积 % =（梗塞面积总和 / 总脑面积总和）× 100%。

在创建 MCAO 模型时，用于制造细丝和成品细丝的主要工具如图 3 所示。细丝产生后，通过将细丝穿过颈外动脉来建立 MCAO 模型，并记录手术持续时间。成功的建模定义为细丝撤退后 4 小时 1-3 的 Longa 评分。手术后每天监测体重。在术后 24 小时和 72 小时使用改良的神经严重程度评分 （mNSS） 评估神经功能缺损。通过 TTC 染色评估缺血性损伤。

本研究展示了一种简单且经济高效的制造细丝的方法，证实了其创建 MCAO 模型的可行性。细丝的硅胶涂层的长度可以根据实验需要进行调整，从而提供额外的灵活性。制备 5 mm 细丝栓子的成功率为 100%，小鼠未发生任何蛛网膜下腔出血 （SAH）。在使用 10 mm 细丝栓子的组中，存在 SAH 实例，而其余小鼠在 MCA 区域显示明显的梗死。减少 SAH 的一个关键步骤是在手术过程中遇?...

作者没有需要声明的利益冲突。

这项工作得到了吴阶平医学基金会 （320.6750.161290） 的支持。