Handgefertigtes silikonbeschichtetes Filament für Modelle zum Verschluss der mittleren Hirnarterie von Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Herstellung von beschichteten Filamenten für das Modell des Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO) bei Mäusen unter Verwendung von Silikon, Nylonnähten und Spritzennadeln. Dieses Verfahren ermöglicht die Herstellung von Filamenten mit einem gleichbleibenden Durchmesser und verschiedenen Silikonummantelungslängen, die auf die experimentellen Bedürfnisse zugeschnitten sind.

Mit der Alterung der Weltbevölkerung ist der ischämische Schlaganfall zur zweithäufigsten Ursache für Behinderungen und Mortalität weltweit geworden und stellt sowohl für die Gesellschaft als auch für die Familien eine immense Belastung dar. Obwohl Behandlungen wie intravenöse Thrombolyse und endovaskuläre Eingriffe die Ergebnisse für Patienten mit akutem ischämischem Schlaganfall erheblich verbessern können, profitiert nur ein kleiner Prozentsatz der Personen von diesen Therapien. Um das Verständnis der Krankheit zu verbessern und wirksamere Behandlungen zu entdecken, entwickeln und verfeinern Forscher kontinuierlich Tiermodelle. Unter diesen sticht das Modell des Verschlusses der mittleren Hirnarterie (MCAO) als das am häufigsten verwendete Modell in der Erforschung zerebrovaskulärer Erkrankungen hervor. Das Filament, das in diesem Modell verwendet wird, ist entscheidend für seine Entwicklung. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Filamenten mit gleichbleibenden Durchmessern und unterschiedlichen Längen der Silikonbeschichtung. Das mit dieser Methode an C57-Mäusen hergestellte MCAO-Modell hat einen hohen Erfolg und eine hohe Konsistenz gezeigt und bietet ein wertvolles Werkzeug für maßgeschneiderte Untersuchungen ischämischer zerebrovaskulärer Erkrankungen.

Schlaganfall ist eine der häufigsten Ursachen für Tod und Behinderung weltweit. Ischämische und hämorrhagische Schlaganfälle sind die primären Arten von zerebrovaskulären Ereignissen, wobei ischämische Schlaganfälle etwa 87 % der Fälle ausmachen ^1,2,3. Derzeit gibt es zwei Behandlungsmodalitäten für Patienten mit ischämischem Schlaganfall: die pharmakologische Therapie mit rekombinantem Gewebeplasminogenaktivator (rtPA) und die mechanische Thrombektomie. Das enge therapeutische Fenster und die umfangreichen Ausschlusskriterien schränken jedoch die Anwendung dieser Behandlungen ein, von denen nur eine Minderheit der Patienten profitiert. Dies unterstreicht die Notwendigkeit kontinuierlicher Anstrengungen zur Verbesserung der Therapien ischämischer Schlaganfälle ^4,5. In-vitro-Modelle sind ungeeignet, um die komplexen pathophysiologischen Reaktionen nach einem Schlaganfall zu replizieren, so dass Tiermodelle ein unverzichtbarer Bestandteil der präklinischen Schlaganfallforschung sind. Die fokale zerebrale Ischämie beim Menschen wird am häufigsten durch einen thrombotischen oder embolischen Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCA) verursacht, was Nagetiermodelle, die zur Simulation eines MCA-Verschlusses (MCAO) entwickelt wurden, sehr relevant macht⁶.

Das filamentinduzierte MCAO-Modell, das in der Schlaganfallforschung am weitesten verbreitet ist, erleichtert den Verschluss zu Beginn der mittleren Hirnarterie (MCA) und die anschließende Reperfusion, was zu ausgedehnten Infarkten in subkortikalen und kortikalen Bereichen des Gehirns führt. Der Vorteil dieses Modells liegt in seiner Fähigkeit, den Blutfluss nach Induktion einer fokalen Ischämie wiederherzustellen und damit den pathophysiologischen Prozessen zu entsprechen, die beim menschlichen Schlaganfall beobachtet wurden⁷. Darüber hinaus simuliert das Modell eine Reperfusionsverletzung, ein kritischer Faktor für das Ausmaß der Schädigung⁸. Das MCAO-Modell weist jedoch Einschränkungen auf, einschließlich der Variabilität des Infarktvolumens, wobei die Standardabweichung in einigen Studien möglicherweise bis zu 64 % des Mittelwerts erreichen^{kann 9}. Trotz über drei Jahrzehnten der Anwendung sind die Bemühungen um eine Verbesserung der Zuverlässigkeit des Modells noch nicht abgeschlossen, dennoch gibt es in den Studien und Labors nach wie vor signifikante Unterschiede im Volumen der ischämischen Läsionen 10,11,12.

In diesem Artikel wird ein selbst hergestelltes Filament zur Induktion von Modellen zur Bewertung von neurologischen Defizitwerten und Hirninfarktbereichen vorgestellt. Es wird der Zusammenhang zwischen mit Silikon beschichteten Filamentlängen und dem Erfolg und der Stabilität des MCAO-Modells untersucht. Diese Produktionstechnik liefert Filamente mit lobenswerter Konsistenz und trägt zur Entwicklung eines relativ stabilen MCAO-Modells bei.

Alle tierischen Verfahren entsprachen den experimentellen Verfahren und Standards, die vom Komitee für institutionelle Tierpflege und -verwendung des Shanxi Provincial People's Hospital genehmigt wurden (Genehmigungsnummer: 2024 Provincial Medical Ethics Committee No. 64). Bei den in diesem Experiment verwendeten Mäusen handelte es sich um männliche C57BL/6-Mäuse, 8-10 Wochen alt und mit einem Gewicht von 24-26 g. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Filamente

1. Markieren des Originalfilaments: Wickeln Sie die Naht 6-0 Nylon gleichmäßig um eine Zollstockplatte aus Kunststoff. Markieren Sie in einem Abstand von 5 mm und 10 mm zum Filamentkopf (einschließlich des Markierungspunkts der Beschichtung und des Markierungspunkts für die Einführtiefe).
2. Schneiden Sie mit einer Klinge vertikal nach unten, um sicherzustellen, dass beide Enden perfekt kreisförmig sind, was zu einem anfänglich 2 cm langen Filament führt (Abbildung 1).
3. Herstellung des Beschichtungsgeräts: Brechen Sie mit einer hämostatischen Pinzette den Nadelkopf einer 26 G Spritze ab und polieren Sie das Nadelloch mit Schleifpapier zu einem perfekten Kreis. Ziehen Sie 2 mL des Silikondichtstoffs K-704 mit einer 10 mK-Spritze auf und befestigen Sie schließlich den Nadelkopf an der Spritze.
4. Beschichten des Filaments: Führen Sie das Ausgangsfilament bis zur markierten Position von 5 mm oder 10 mm in das vorbereitete Nadelloch ein. Drücken Sie die Spritze langsam und gleichmäßig, bis das Filament unter einem Stereomikroskop vollständig beschichtet ist (Abbildung 2).
5. Abbinden des beschichteten Filaments: Fixieren Sie das beschichtete Filament aufrecht mit Klebeband und warten Sie ca. 20 min, bis das Silikon vollständig ausgehärtet ist.
6. Sterilisation und Verpackung: Weichen Sie die vorbereiteten Filamente in 75%igem Alkohol ein, wischen Sie sie mit einem Wattestäbchen trocken und verpacken Sie sie dann in 5 mL Zentrifugenröhrchen.

2. MCAO-Modell

HINWEIS: Die chirurgischen Instrumente wurden durch Autoklavieren (121 °C bei 15 psi für 60 Minuten) sterilisiert. Der Operationstisch und andere Geräte wurden mit 75 % Ethanol desinfiziert. Die Mäuse wurden präoperativ 8 Stunden lang nüchtern, hatten aber freien Zugang zu Wasser.

1. 5 mg/kg Meloxicam subkutan zur Analgesie 60 Minuten vor der Operation verabreichen. Schließen Sie eine Wärmedecke an, um die Körpertemperatur der Maus während der Narkose auf 37 °C zu halten.
2. Induzieren Sie die Anästhesie mit 4 % Isofluran, bis spontane Bewegungen und Schnurrhaarzuckungen aufhören, und halten Sie dann die Anästhesie bei 1,5 % (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen). Tragen Sie die Augensalbe auf beide Augen auf.
3. Bringen Sie die Maus in Rückenlage, sichern Sie den Kopf und die Gliedmaßen, rasieren Sie die Haare am Hals und an der oberen Brust und desinfizieren Sie die Haut mit 75% Ethanol von innen nach außen.
4. Machen Sie einen 2,5 cm langen Hautschnitt entlang der Mittellinie des Halses, vom Unterkiefer bis zum Brustbein.
5. Präparieren Sie stumpf die rechten Nackenmuskeln, um die Halsschlagaderscheide freizulegen. Verwenden Sie eine Augenzange, um die Scheide zu öffnen und die Arteria carotis communis (CCA), die Arteria carotis externa (ECA) und die Arteria carotis interna (ICA) zu trennen, wobei Sie darauf achten sollten, den Vagusnerv nicht zu stören.
6. Ligatur des CCA vorübergehend mit einem Slipknot vor der Bifurkation und Klemmen des ICA mit einem mikrochirurgischen Arterienklemmer.
7. Verätzen Sie die obere Schilddrüsenarterie aus der ECA mit einem bipolaren Gerinnungsstift.
8. Lassen Sie zwei Fäden für die Ligatur auf der ECA: einen am distalen Ende für die permanente Ligatur und einen weiteren am proximalen Ende mit einem losen Knoten für die zukünftige Verwendung. Machen Sie mit einer Augenschere einen etwa 0,5 mm großen Schnitt zwischen den beiden Ligaturen auf der ECA, um das Filament einzuführen.
9. Führen Sie das 5 mm oder 10 mm silikonbeschichtete Filament durch den Schnitt in das CCA ein und sichern Sie es dann, indem Sie den losen Knoten festziehen.
10. Nachdem Sie das distale Ende des ECA abgeschnitten und die Klemme vom ICA entfernt haben, ziehen Sie das Filament in die CCA-Bifurkation zurück. Drehen Sie dann das Filament um und schieben Sie es in den tiefen ICA, bis Sie einen Widerstand spüren. Ziehen Sie das Filament leicht zurück und sichern Sie es, indem Sie den Knoten festziehen.
11. Nähen Sie die Haut des Tieres mit 3-0 Naht und desinfizieren Sie die Wunde mit Jod. Legen Sie die Maus für 1 h in eine Auffangkammer.
12. Betäuben Sie die Maus erneut, entfernen Sie vorsichtig das Filament, binden Sie den ECA-Ligaturfaden ab, mit dem das Filament befestigt ist, und lösen Sie den CCA-Slipknot, um den Blutfluss wiederherzustellen und die mittlere Hirnarterie wiederherzustellen.
13. Schneiden Sie die überschüssigen Fäden ab, nähen Sie die Halshaut und desinfizieren Sie den Bereich erneut.

3. Scheinbetrieb

1. Bei Scheinoperationen wird ein 7 mm silikonbeschichtetes Filament eingeführt, um die rechte mittlere Hirnarterie zu verschließen, und dann sofort zurückgezogen, um eine sofortige Reperfusion zu ermöglichen.
   HINWEIS: Das anschließende Verfahren ist identisch mit demjenigen, das bei Tieren durchgeführt wird, die sich einer zerebralen Ischämie unterziehen.

4. Neuroscore

1. Platzieren Sie Versuchstiere aus jeder Gruppe auf einem offenen Feld und führen Sie 4 Stunden nach der Reperfusion der zerebralen Ischämie eine postoperative Verhaltensbewertung durch.
2. Für eine erfolgreiche Modellierung sollten Sie Bewertungen zwischen 1 und 3 in Betracht ziehen. Die Bewertungskriterien basieren auf der Longa-Scoring-Methode¹⁰, wie in Tabelle 1 dargestellt.
3. Beurteilung neurologischer Defizite gemäß den Modified Neurologic Severity Scores (mNSS)¹³, wobei die Auswertungen 24 h und 72 h nach der Reperfusion durchgeführt werden (siehe Tabelle 2).

5. Transkardiale Perfusion

1. Betäuben Sie die Maus mit 1,5% Pentobarbital-Natrium (nach institutionell anerkannten Protokollen). Setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig ein und warten Sie 10 Minuten. Kneifen Sie dann die Zehen der Maus zusammen, um zu testen, ob keine Reflexe vorhanden sind, und sorgen Sie für eine tiefe Anästhesie.
2. Positionieren Sie die Maus in Rückenlage auf einem Schaumstoffständer und sichern Sie ihre Gliedmaßen.
3. Schneiden Sie die Spitze einer 25-G-Nadel ab, um sie abzustumpfen und ein Durchstechen der Aortenwand zu verhindern. Verbinden Sie die Nadel mit einer Spritze, die mit 20 ml Kochsalzlösung gefüllt ist.
4. Heben Sie das Fell des Brustkorbs an und schneiden Sie die Haut mit einer Schere ab, um den Xiphoid-Prozess freizulegen. Fassen Sie den Xiphoid-Prozess und schneiden Sie horizontal darunter, um das Zwerchfell freizulegen, indem Sie die Muskelschicht öffnen. Schneiden Sie das Zwerchfell vorsichtig mit einer Schere ab, um Schäden am Herzen zu vermeiden.
5. Schneiden Sie entlang der Außenseite des Brustbeins, um den Brustkorb auf beiden Seiten zu öffnen, drehen Sie die Vorderwand des Brustkorbs um und sichern Sie ihn mit Hämostaten.
6. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um das Fett an der Basis des Herzens zu entfernen und die Wurzel der Aorta freizulegen.
7. Sichern Sie das Herz mit einer Pinzette, führen Sie die Nadel an der Spitze des Herzens ein und bewegen Sie sich schräg nach oben, bis die Nadel durch die Aortenwand sichtbar ist. Klemmen Sie die Nadel fest.
8. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof, um den Blutfluss zu beobachten. Perfundieren Sie die Kochsalzlösung gleichmäßig mit der Spritze und achten Sie darauf, dass das Blut aus dem rechten Vorhof austritt. Sobald das Abwasser klar ist, stoppen Sie die Perfusion¹⁴.
9. Nach der Perfusion wird die Maus geköpft, um das Gehirn¹⁵ zu entnehmen, und zur weiteren Verarbeitung in einen -20 °C-Gefrierschrank gelegt.

6. Bestimmung des Infarktvolumens durch TTC-Färbung

1. Frieren Sie das beschaffte Hirngewebe in einem -20 °C Gefrierschrank für 20 min schnell ein, legen Sie es dann auf eine vorgekühlte Gehirnschneideform und schneiden Sie es in 1 mm dicke Scheiben.
2. Tauchen Sie die erhaltenen Hirnschnitte in 2%ige TTC-Lösung und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 37 °C.
3. Tauchen Sie die Gehirnschnitte über Nacht in 4% Paraformaldehyd und fotografieren Sie am nächsten Tag.
4. Messen Sie den Infarktbereich für jeden Schnitt und den gesamten Hirnbereich mit ImageJ. Berechnen Sie das Verhältnis des Infarktvolumens mit der Formel: Infarktvolumen % = (Summe der Infarktgebiete / Summe der gesamten Hirnareale) × 100%.

Bei der Erstellung des MCAO-Modells sind die primären Werkzeuge, die für die Herstellung der Filamente verwendet werden, und die fertigen Filamente in Abbildung 3 dargestellt. Nach der Filamentproduktion wird das MCAO-Modell erstellt, indem das Filament durch die Arteria carotis externa eingeführt wird, wobei die Dauer der Operation aufgezeichnet wird. Eine erfolgreiche Modellierung wird durch einen Longa-Score von 1-3 4 h nach der Filamententnahme defini...

Diese Studie demonstriert eine einfache und kostengünstige Methode zur Herstellung von Filamenten und bestätigt ihre Machbarkeit bei der Erstellung eines MCAO-Modells. Die Länge der Silikonschicht des Filaments kann je nach experimentellem Bedarf angepasst werden, was zusätzliche Flexibilität bietet. Die Präparation eines 5 mm Filamentembolus erzielte eine Erfolgsquote von 100% ohne Auftreten von Subarachnoidalblutungen (SAB) bei Mäusen. In der Gruppe, die 10-mm-Filamentembolien v...

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Diese Arbeit wurde von der Wu Jieping Medical Foundation (320.6750.161290) unterstützt.