נימה מצופה סיליקון בעבודת יד לעכברים דגמי חסימת עורק המוח האמצעי

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ליצירת חוטים מצופים למודל חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO) בעכברים באמצעות סיליקון, תפרי ניילון ומחטי מזרק. שיטה זו מאפשרת ייצור חוטים בקוטר עקבי ואורכי עטיפת סיליקון שונים המותאמים לצרכי הניסוי.

ככל שהאוכלוסייה העולמית מזדקנת, שבץ איסכמי עלה והפך לגורם השני המוביל לנכות ותמותה ברחבי העולם, מה שמטיל נטל עצום הן על החברה והן על המשפחות. למרות שטיפולים כגון פקקת תוך ורידית והתערבויות אנדווסקולריות יכולים לשפר באופן משמעותי את התוצאות עבור חולים עם שבץ איסכמי חריף, רק אחוז קטן מהאנשים מפיקים תועלת מטיפולים אלה. כדי לקדם את הבנתנו את המחלה ולגלות טיפולים יעילים יותר, חוקרים מפתחים ומשכללים ללא הרף מודלים של בעלי חיים. בין אלה, מודל חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO) בולט כמודל הנפוץ ביותר בחקר מחלות כלי דם במוח. החוט המשמש במודל זה חיוני להתפתחותו. פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת חוטים בקטרים עקביים ואורכים משתנים של ציפוי סיליקון. מודל MCAO המיוצר בשיטה זו בעכברי C57 הוכיח הצלחה ועקביות גבוהות, ומציע כלי רב ערך לחקירות מותאמות אישית של מחלות כלי דם במוח איסכמיות.

שבץ מוחי הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר לתמותה ונכות ברחבי העולם. שבץ איסכמי ודימום הם הסוגים העיקריים של אירועים במוח, כאשר שבץ איסכמי מהווה כ-87% מהמקרים ^1,2,3. נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות טיפול לחולים עם שבץ איסכמי: טיפול תרופתי עם מפעיל פלסמינוגן רקמות רקומביננטי (rtPA) וכריתת פקקת מכנית. עם זאת, חלון הטיפולים הצר וקריטריוני ההדרה הנרחבים מגבילים את יישום הטיפולים הללו, ומועילים רק למיעוט מהמטופלים. זה מדגיש את הצורך במאמצים מתמשכים לשיפור הטיפולים בשבץ איסכמי ^4,5. מודלים במבחנה אינם מספיקים לשכפול התגובות הפתופיזיולוגיות המורכבות לאחר שבץ מוחי, מה שהופך מודלים של בעלי חיים למרכיב הכרחי במחקר שבץ פרה-קליני. איסכמיה מוחית מוקדית אנושית נגרמת לרוב על ידי חסימה טרומבוטית או תסחיפית של עורק המוח האמצעי (MCA), מה שהופך מודלים של מכרסמים שנועדו לדמות חסימת MCA (MCAO) לרלוונטיים ביותר⁶.

מודל MCAO המושרה על ידי נימה, המאומץ ביותר בחקר שבץ מוחי, מקל על חסימה בתחילת עורק המוח האמצעי (MCA) ורפרפוזיה לאחר מכן, מה שמוביל לאוטמים נרחבים באזורים תת-קורטיקליים וקליפת המוח של המוח. היתרון של מודל זה טמון ביכולתו להחזיר את זרימת הדם לאחר גרימת איסכמיה מוקדית, ובכך מקביל לתהליכים הפתופיזיולוגיים שנצפו בשבץ מוחי אנושי⁷. בנוסף, המודל מדמה פגיעה ברפרפוזיה, גורם קריטי בהיקף הנזק⁸. עם זאת, למודל MCAO יש מגבלות, כולל שונות בנפח האוטם, כאשר סטיית התקן עשויה להגיע עד 64% מהערך הממוצע בחלק מהמחקרים⁹. למרות למעלה משלושה עשורים של שימוש, המאמצים לשפר את אמינות המודל נמשכים, אך שינויים משמעותיים בנפח הנגע האיסכמי נמשכים במחקרים ובמעבדות 10,11,12.

מאמר זה מציג נימה בייצור עצמי ליצירת מודלים המעריכים ציוני גירעון נוירולוגי ואזורי אוטם מוחי. הוא בוחן את המתאם בין אורכי נימה מצופים סיליקון לבין ההצלחה והיציבות של מודל MCAO. טכניקת ייצור זו מניבה חוטים בעלי עקביות ראויה לשבח, ותורמת לפיתוח מודל MCAO יציב יחסית.

כל ההליכים בבעלי חיים עמדו בהליכי הניסוי ובתקנים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים העממי של מחוז שאנשי (מספר אישור: ועדת האתיקה הרפואית המחוזית מס' 64 לשנת 2024). העכברים ששימשו בניסוי זה היו עכברים זכרים C57BL/6, בני 8-10 שבועות, במשקל 24-26 גרם. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת נימה

1. סימון החוט המקורי: סובב את תפר הניילון 6-0 באופן שווה סביב לוחית סרגל פלסטיק. סמן סימנים במרחק של 5 מ"מ ו-10 מ"מ מראש החוט (כולל נקודת סימון הציפוי ונקודת סימון עומק ההכנסה).
2. חותכים אנכית כלפי מטה עם להב כדי להבטיח ששני הקצוות עגולים לחלוטין, וכתוצאה מכך חוט ראשוני באורך 2 ס"מ (איור 1).
3. ייצור מכשיר הציפוי: השתמש במלקחיים המוסטטיים כדי לנתק את ראש המחט של מזרק 26 גרם, ולאחר מכן לטש את חור המחט לעיגול מושלם עם נייר זכוכית. צייר 2 מ"ל של איטום סיליקון K-704 עם מזרק 10 mK, ולבסוף, חבר את ראש המחט למזרק.
4. ציפוי הנימה: הכנס את החוט הראשוני לחור המחט המוכן עד למצב המסומן של 5 מ"מ או 10 מ"מ. דחפו לאט ובהתמדה את המזרק עד שהחוט מצופה במלואו תחת סטריאומיקרוסקופ (איור 2).
5. הגדרת החוט המצופה: קבע את החוט המצופה זקוף בעזרת סרט דבק והמתן כ-20 דקות עד שהסיליקון יתייצב במלואו.
6. עיקור ואריזה: משרים את החוטים המוכנים באלכוהול 75%, מנגבים אותם יבשים בעזרת צמר גפן ואז אורזים אותם בצינורות צנטריפוגה של 5 מ"ל.

2. דגם MCAO

הערה: כלים כירורגיים עוקרו על ידי חיטוי (121 מעלות צלזיוס ב-15 psi למשך 60 דקות). שולחן הניתוחים וציוד אחר עברו חיטוי באמצעות 75% אתנול. העכברים הוצמו במשך 8 שעות לפני הניתוח, אך אפשרו להם גישה חופשית למים.

1. יש לתת 5 מ"ג/ק"ג של מלוקסיקם תת עורי לשיכוך כאבים 60 דקות לפני הניתוח. חבר שמיכת חום כדי לשמור על טמפרטורת גוף העכבר על 37 מעלות צלזיוס במהלך ההרדמה.
2. יש לעורר הרדמה עם איזופלורן 4% עד להפסקת התנועות הספונטניות ועוויתות השפם, ולאחר מכן לשמור על הרדמה ברמה של 1.5% (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים.
3. הניחו את העכבר במצב שכיבה, אבטחו את ראשו וגפיו, גלחו את השיער על צווארו וחזהו העליון וחטאו את העור ב-75% אתנול מבפנים החוצה.
4. בצע חתך עור באורך 2.5 ס"מ לאורך קו האמצע של הצוואר, מהלסת התחתונה ועד עצם החזה.
5. נתח בצורה בוטה את שרירי הצוואר הימני כדי לחשוף את מעטפת הצוואר. השתמש במלקחיים עיניים כדי לפתוח את הנדן ולהפריד בין עורק הצוואר המשותף (CCA), עורק הצוואר החיצוני (ECA) ועורק הצוואר הפנימי (ICA), תוך הקפדה על הפרעה לעצב התועה.
6. קשר זמנית את ה-CCA עם קשר החלקה לפני ההסתעפות והדק את ה-ICA עם מהדק עורק מיקרו-כירורגי.
7. צרבו את עורק בלוטת התריס העליון מה-ECA באמצעות עט קרישה דו קוטבי.
8. השאירו שני חוטים על ה-ECA לקשירה: אחד בקצה הדיסטלי לקשירה קבועה והשני בקצה הפרוקסימלי עם קשר רופף לשימוש עתידי. בצע חתך של כ-0.5 מ"מ בין שתי הקשרים ב-ECA באמצעות מספריים עיניים כדי להחדיר את החוטים.
9. הכנס את החוט המצופה סיליקון בגודל 5 מ"מ או 10 מ"מ לתוך ה-CCA דרך החתך ולאחר מכן אבטח אותו על ידי הידוק הקשר הרופף.
10. לאחר כריתת הקצה הדיסטלי של ה-ECA והוצאת המהדק מה-ICA, משוך את החוט לפיצול ה-CCA. לאחר מכן, הפוך וקדם את החוט לתוך ה-ICA העמוק עד שמרגישים התנגדות. משוך מעט את החוט ואבטח אותו על ידי הידוק הקשר.
11. לתפור את עור החיה בתפר 3-0 ולחטא את הפצע ביוד. הנח את העכבר בתא התאוששות למשך שעה.
12. הרדמו שוב את העכבר, הסירו בעדינות את החוטים, קשרו את חוט קשירת ה-ECA המאבטח את החוט ושחררו את קשר ה-CCA כדי להחזיר את זרימת הדם ולהחזיר את עורק המוח האמצעי.
13. חתוך את החוטים העודפים, תפר את עור הצוואר וחטא את האזור פעם נוספת.

3. מבצע מזויף

1. לפעולות דמה, הכנס חוט מצופה סיליקון בגודל 7 מ"מ כדי לחסום את עורק המוח האמצעי הימני ולאחר מכן משוך אותו מיד כדי לאפשר עירוי מיידי.
   הערה: ההליך הבא זהה לזה המבוצע בבעלי חיים הסובלים מאיסכמיה מוחית.

4. נוירוסקור

1. מקם חיות ניסוי מכל קבוצה בשדה פתוח ובצע ניקוד התנהגותי לאחר הניתוח 4 שעות לאחר רפרפוזיה של איסכמיה מוחית.
2. לדוגמנות מוצלחת, שקול ציונים בין 1 ל-3. קריטריוני ההערכה מבוססים על שיטת הניקוד של לונגה¹⁰, כמפורט בטבלה 1.
3. להעריך ליקויים נוירולוגיים על פי ציוני החומרה הנוירולוגית המותאמים (mNSS)¹³, עם הערכות שבוצעו 24 שעות ו-72 שעות לאחר הרפרפוזיה (ראה טבלה 2).

5. זלוף טרנס-קרדיולוגי

1. להרדים את העכבר עם 1.5% נתרן פנטוברביטל (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). החזר את העכבר לכלוב שלו והמתן 10 דקות. לאחר מכן, צבט את אצבעות העכבר כדי לבדוק אם אין רפלקסים ולהבטיח הרדמה עמוקה.
2. מקם את העכבר במצב שכיבה על מעמד קצף ואבטח את גפיו.
3. חותכים את קצה המחט של 25 גרם כדי להקהות אותה, ולמנוע ניקוב של דופן אבי העורקים. חבר את המחט למזרק מלא ב-20 מ"ל מי מלח.
4. הרם את פרוות בית החזה והשתמש במספריים כדי לחתוך את העור כדי לחשוף את תהליך ה-xiphoid. אחוז בתהליך ה-xiphoid וחתוך אופקית מתחתיו כדי לחשוף את הסרעפת על ידי פתיחת שכבת השריר. חותכים בזהירות את הסרעפת במספריים, והימנעו מפגיעה בלב.
5. חותכים לאורך הצד החיצוני של עצם החזה כדי לפתוח את כלוב הצלעות משני הצדדים, להפוך את הדופן הקדמית של בית החזה ולאבטח אותו עם המוסטטים.
6. השתמש בצמר גפן כדי להסיר את השומן בבסיס הלב, ולחשוף את שורש אבי העורקים.
7. אבטח את הלב בעזרת מלקחיים, הכנס את המחט בקודקוד הלב והתקדם באלכסון כלפי מעלה עד שהמחט נראית דרך דופן אבי העורקים. מהדק את המחט למקומה.
8. בצע חתך קטן באטריום הימני כדי לצפות בזרימת הדם. הזרמת מי מלח בהתמדה עם המזרק, תוך צפייה בדם שיוצא מהפרוזדור הימני. לאחר שהקולחים צלולים, עצור את הזלוף¹⁴.
9. לאחר הזלוף, ערפו את ראשו של העכבר כדי לקצור את המוח¹⁵ והניחו אותו במקפיא של -20 מעלות צלזיוס להמשך עיבוד.

6. הערכת נפח אוטם על ידי צביעת TTC

1. הקפיאו את רקמות המוח שנרכשו במהירות במקפיא של -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואז הניחו אותן על תבנית חיתוך מוח מקוררת מראש וחתכו אותן לפרוסות בעובי 1 מ"מ.
2. טבלו את חלקי המוח שהתקבלו בתמיסת TTC 2% ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
3. טבלו את פרוסות המוח ב-4% פרפורמלדהיד למשך הלילה וצלמו למחרת.
4. מדדו את האזור המוקטם עבור כל פרוסה ואת האזור הכולל במוח באמצעות ImageJ. חשב את יחס נפח האוטם באמצעות הנוסחה: נפח האוטם % = (סכום אזורי האוטם / סכום סך אזורי המוח) × 100%.

ביצירת מודל MCAO, הכלים העיקריים המשמשים לייצור החוטים והחוטים המוגמרים מוצגים באיור 3. לאחר ייצור נימה, מודל ה-MCAO נוצר על ידי החדרת החוט דרך עורק הצוואר החיצוני, כאשר משך הניתוח נרשם. דוגמנות מוצלחת מוגדרת על ידי ציון לונגה של 1-3 4 שעות לאחר נסיגת נימה. משקל ה...

מחקר זה מדגים שיטה פשוטה וחסכונית לייצור נימה, המאשרת את היתכנותה ביצירת מודל MCAO. ניתן לכוונן את אורך מעיל הסיליקון של החוט בהתאם לצרכי הניסוי, מה שמציע גמישות נוספת. הכנת תסחיף נימה 5 מ"מ השיגה שיעור הצלחה של 100% ללא כל התרחשויות של דימום תת-עכבישי (SAH) בעכברים. בקבוצה שהשתמ?...

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הרפואית וו ג'י-פינג (320.6750.161290).