野崎久 (東京大学)、仲田崇志 (慶應義塾大学)、由香丸川橋本 (日本女子大学)、関本浩之 (日本女子大学) を感謝いたします。我々 は彼らのコメントの校閲者を感謝したいと思います。本研究はあった科学研究 (号 26440223 ・ 15 H 04413) 日本学術振興会科研費により結城 Tsuchikane に新技術開発財団からの助成金でサポートされています。

1. 藻類を含む水試料の収集
注: 単細胞 conjugatophytes は、湖、湿地、水田など、停滞の淡水地域で育ちます。藻類を含む水のサンプルは、文化のひずみを生成するこれらの環境のいずれかから収集されます。プロセスを開始する前に次のアイテムが必要: 水のサンプルを収集するための 50 mL のチューブやボトル使い捨てピペット プランクトン ネット。
<ol><li>プランクトン湖環境でネットを使用すると、水から藻類を収集します。目的に応じて、適切なネットを使用します。 注: ネットの上部は水を通さないです。ネットでキャッチ藻類プランクトン ネットの下にあるコンテナーに集中しています。粗いメッシュでは、小さな藻類を通過することができます。細かいメッシュは簡単に目詰まりを取得します。</li>
	<li>50 mL チューブまたは 100 mL のペットボトルに水 (約 50 mL) を転送します。研究室に濃縮水のサンプルをもたらします。</li>
	<li>単細胞の conjugatophytes はまた沼地や田んぼで育ちます。これらの浅い水域で藻類を含む水試料からスポイトで直接サンプリングすることができます。その後、50 mL のチューブまたは 50 mL のペットボトルに水 (30-50 mL) を転送します。 注: サンプルに任意の土壌が含まれていないので、水を地表上サンプリング慎重に。</li>
</ol>2 藻類の確認
注: 次の項目が必要です: 観察用ルーペや携帯顕微鏡 60 mm 皿します。
<ol><li>使い捨てのピペットの中にサンプルで藻類の存在を確認するのにには、サンプルを直接観察するのにルーペを使用します。 注: 約より大きいセル 400 1,000 μ m 長さ (例えば、ミカヅキモ ehrenbergii) することができます簡単にこのメソッドを使用して観察されます。</li>
	<li>プラスチック実験室の皿で水サンプルを注ぐポータブル顕微鏡下で藻類を確認します。<ol>
<li>上半分の内側の部分のサンプル (約 3 mL) を入れ (ふた) 60 mm シャーレの上に、蓋の内側の部分に直面してその下の部分で、下半分を入れ。 注: このメソッドは移動するからサンプルを保ち、観察が容易になります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. パスツール ピペットからガラス毛細管ピペットの隔離のための準備
メモ: プロセスを開始する前に次のアイテムが必要: 滅菌パスツール ピペット、パスツール ピペット、手袋、ゴム球、アルコール ランプ、アルコール ランプ、ライター、鉗子、ガラス用のゴミ箱のメタノールのラックは、クリーン ルームや層流流フード (必要に応じて)。
<ol><li>アルコール バーナーに火を付けます。<ol>
<li>隔離のための細かいガラス毛細管ピペットを生成、炎が点滅していないことを確認します。炎を削るし、その先端にパスツール ピペットを溶かします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>熱滅菌ガラス炎、鉗子を使用して手で、先端側をゴム球の側面サポートにパスツール ピペット。</li>
	<li>炎をパスツール ピペットを取り出して、それを伸ばします。<ol>
<li>ガラスを溶かすときは、炎からパスツール ピペットをすばやく削除、引き出します。 注: この実験でパスツール ピペット増築によって 15-20 cm 作る確かピペットは、引く時、炎をオフします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ガラス毛細管ピペットの先端を適切な長さに分割します。湾曲部分が最高級いるので先端に最適です。 注: この研究では 5-10 cm の先端のガラス毛細管ピペットが準備されました。<ol>
<li>必ず、それを溶融後キャピラリーを破棄し、炎を出すことを確認してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ガラス毛細管ピペットからでる泡は、先端開放のサイズを示します。分離するセルの適切なサイズを選択します。泡の約 1 mm は 10-20 μ m の細胞幅のミカヅキモ属の分離のために適切。</li>
</ol>4 ガラス毛細管ピペットで単一細胞分離
注: 次の項目は開始する前に必要な: 倒立顕微鏡、時計ガラス、プラスチックの皿と滅菌スレッド試験管 CA 媒体 (表 1) を含んでいるまたは CA 中7を完備します。
<ol><li>いくつかの時計メガネ (22 mm 径、深さ 1 mm)、生殖不能の CA 媒体含む各 1 mL を準備します。</li>
	<li>フィールドで採取された水試料から標的細胞を分離します。<ol>
<li>プラスチックの皿に標的細胞を含む水試料 (約 30-40 mL) を注ぎなさい。</li>
		<li>倒立顕微鏡下でプラスチックの皿にサンプルを観察しながらガラス毛細管ピペットを使用して単一セルを拾います。</li>
		<li>ガラス毛細管ピペットを毛管作用によって細胞の吸引を容易にするセルに寄せます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>生殖不能の CA 媒体 (図 1 a) 1 mL を含む時計ガラスにセルを転送します。</li>
	<li>生殖不能のカリフォルニア州媒体から新しいガラス毛細管ピペットを使用して再度セルをピックアップし、生殖不能の CA 媒体 (図 1 b) を含む 2 番目の時計ガラスにそれを転送します。 注: 単一のセルはスポット プレート (図 1 c) で分離されているまで、このプロセスは繰り返されます。</li>
	<li>新しいガラス毛細管ピペットを使用して 1 つのセルをピックアップし、最終的にカリフォルニア州媒体の馴化 CA 培地 (図 1 d) 14 mL を含むテスト チューブに転送。23 ° C 16 h 光: 8 の下でサンプルをインキュベート-暗い h は 2 週間サイクルします。 注: 周囲の環境に成長している細胞から分泌される細胞増殖の未知の因子は、細胞分裂4を容易にする条件の中に含まれます。クローン培養が確立される場合培地4からエアコンの CA メディアを準備します。文化は、成功した場合は緑色になるでしょう。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wickett, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylotranscriptomic+analysis+of+the+origin+and+early+diversification+of+land+plants.">Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).</li><li>Delwiche, C. F., Cooper, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+origin+of+a+terrestrial+flora.">The evolutionary origin of a terrestrial flora.</a> Current Biology. 25, R899-R910 (2015).</li><li>Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+obtaining+clonal+isolation+of+diatoms.">A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms.</a> British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).</li><li>Pringsheim, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , 119 (1946).</li><li>Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+isolation+techniques+for+microalgae.">Automated isolation techniques for microalgae.</a> Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. , 101-116 (2005).</li><li>Andersen, R. A., Kawachi, M., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+microalgae+isolation+techniques.">Traditional microalgae isolation techniques.</a> Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. , 83-100 (2005).</li><li>Abe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+nuclear+transformation+of+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).</li><li>Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+processes+of+Penium+margaritaceum+(Zygnemophyceae,+Charophyta).">Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta).</a> Phycological Research. 59, 74-82 (2011).</li><li>Kanda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockouts+reveal+that+CpRLP1+is+a+negative+regulator+of+the+sex+pheromone+PR-IP+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Scientific Reports. 7, 17873 (2017).</li><li>Ichimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+types+and+reproductive+isolation+in+Closterium-ehrenbergii+Meneghini.">Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini.</a> Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).</li><li>Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+physiological+properties+of+a+protein+inducing+protoplast+release+during+conjugation+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Planta. 182, 348-354 (1990).</li><li>Ichimura, T., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Closterium+calosporum+complex+from+the+Ryukyu+Islands-Variation+and+taxonomical+problems.">The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems.</a> Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).</li><li>Provasoli, L., Pintner, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+media+for+fresh-water+algae:+problems+and+suggestions+.">Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions .</a> The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , 84-96 (1960).</li><li>Provasoli, L., Tryon, C. A., Hartmann, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media++&amp;+prospects+for+the+cultivation+of+marine+algae.">Media &amp; prospects for the cultivation of marine algae.</a> Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. , 63-75 (1968).</li><li>Guillard, R. R. L., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+methods+for+microalgae.">Purification methods for microalgae.</a> Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. , 117-132 (2005).</li></ol>

現在のメソッドを使用して、ミカヅキモsp 9 クローン培養株は 60% の成功率を表す水のサンプル (Inba1) から分離された 15 のセルから確立されました。種の同定は、形態学的観察と分子系統解析8などの DNA 解析によって将来的に実施するでしょう。
提案の方法では、試料水の鮮度は成功率に重要です。フィールド コレクション後できるだけ早く水サンプルから細胞を分離することをお勧めします。細胞の分離が望ましいが、ミカヅキモ属 (例えば c. ehrenbergii c. 学位論文紹介複雑な) セルは 4-8 ° C で保存することによって約 7 d のサンプルを水で維持できる、コレクションまたは次の日の日。また、洗濯の繰り返しの数を増やすので、標的細胞以外の任意の汚染物質を除去することが重要だ (すなわち、> 3 x) 細胞と土壌微生物による文化の汚染を防ぐことができます。
この技法の制限は、このプロトコル (CA または CA の馴化培地) で使用される文化メディア、必ずしもすべて接合藻類の適切です。いくつかのケースでは、他の媒体と同様、異なる光および温度条件の使用を検討する必要があります。また、文化が 1 つのセルから成長しているかどうかを証明することは困難は、テスト チューブにセルを転送するときだけ 1 つのセルを正確に選択する必要が。したがって、転送すべき新しいガラス毛細管ピペットでそれぞれの時間。
このピペット洗浄法とクローン培養を確立するクラシック/標準の方法を研究に必要な細胞を分離に使用する最も信頼性の高い方法です。多く研究8,9,,1011で使用される藻類の活用のクローンの文化は、現在のメソッドを使用して確立されました。クローン培養せず接合藻類を分析することは困難です。また、近年、 de novo全ゲノム シーケンス (例えば、ミニオン ナノポア sequencer を使用して) 取得、やすくなった、 de novoシーケンスがより一層高まるクローン文化を確立します。つまり、このメソッドは、最初のステップは、将来的にこれらの藻類の生物多様性を理解するための研究です。
安定した培養株を確立するためにプロトコル内で正確に特定の重要な手順を実行する必要は。1 つのセルのみの通過を許可する最適な絞り値とガラス毛細管ピペットの準備の最も重要なステップです。ガラス毛細管ピペットの絞りは興味のセルの短軸長さよりわずかに多くである必要があります。最適なガラス毛細管ピペットは、毛管作用によって単一のセルを吸引できます。ただし、開口部の直径が大きすぎる場合、毛細血管は非生活汚染物質材料やも (、) 他嫌気、ターゲット セルに加えて描画もできます。
最適な絞りとガラス毛細管ピペットを得るためには、次の点が注意してください。まず、ガラス毛細管ピペットを加熱するとき、炎の柱が細い必要があります。次に、パスツール ピペットを引っ張って、それは炎; から削除するがそうでなければ、パスツール ピペットの絞りが崩壊します。
機器とこのプロトコルに示すように容器の基本的な変更することができます。たとえば、1 つも時計メガネではなくウェル プレートを使用して、セル洗浄可能より効率的です。さらに、他の類似のものコンテナーを置き換えることが。最後のステップで培養液中に単一のセルを転送する、クローン培養を確立できます。
滅菌コンテナーを準備し、フードでの作業は無菌 (汚染) 系統を確立します。汚染を防ぐためには、3 倍以上の新しい因数洗浄手順を繰り返す必要は。場合によっては、抗生物質15を追加することによって細菌を殺菌することも。
このメソッドは当ててチリモ (Zygnematales) 分離がガラス毛細管ピペット開口部の大きさを変更すると、それは、異なるサイズのプランクトンの分離に適用できます。

(注文 Zygnematales) の藻類の活用、またとして知られている conjugatophytes、占める土地の植物1,2の即時の祖先の最も近い生活親戚として重要な系統位置です。藻類の確立されたクローン文化は、過去年にわたってさまざまな分類学、生理学、遺伝学的研究につながっています。自然のフィールドからの微生物の分離技術は、長い伝統3,4を持っています。近年、フローサイトメトリーを用いた技術はまたずっと自動分離は5を設立しました。クローン培養の確立のための単一のセルを取得するために使用する最も一般的な方法は、ガラス毛細管ピペット6を使用して単一細胞分離です。この従来の方法では、スキルと正確な実験的プロトコルを必要があります。
この記事で示す藻類のサンプリング フィールド サンプルとミカヅキモ種などの単細胞接合藻類の栄養文化の確立からガラス毛細管ピペットを使用して.栄養細胞を含む水試料は、(例えば湖、池、または水田) 現場から収集されます。セルをガラス毛細管ピペットを用いて試料水から分離して洗浄し。16 h 光: 8 の下の 24 の ° C で窒素添加培地 (CA 中) を含む試験管に培養される細胞-h の暗い政権。このメソッドもクローン文化を生成する他の微細藻類を分離するのに最適です。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Sampling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plankton net</td><td>RIGO, Japan</td><td>N-NO380T</td><td>Mesh size: 32 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE)</td><td>Nikon, Japan</td><td>JAN: 4960759 206725</td><td>Magnification: 20&amp;times;</td></tr><tr><td>Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier)</td><td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan</td><td>1985-20</td><td>Magnification: 20&amp;times;</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan</td><td>Sterile spuit No.4</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps)</td><td>Labcon, USA</td><td>3181-345-008</td><td></td></tr><tr><td>Bottle (100 mL Polycarbonate bottle)</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>1-7403-01</td><td></td></tr><tr><td>60 mm dish</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td><td>1010-060</td><td>&amp;nbsp;For observation of algae.&amp;nbsp; 60 mm/non-treated dish</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Preparation of a micropipette&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes (cotton plugged 9&amp;rdquo; Pasteur Pipettes)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>13-678-8B</td><td>7 &amp;times; 225 mm</td></tr><tr><td>Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc)</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>5-5669-01</td><td>10 &amp;times; 40 mm</td></tr><tr><td>Stainless forceps</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>PT-09</td><td>110 mm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single-cell isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Watch glass (Blood reaction board)</td><td>Sekiya Rika Co., Ltd, Japan</td><td>F14-155-030</td><td>to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth</td></tr><tr><td>Threaded test tubes&amp;nbsp;</td><td>Fujimotorika, Co., Ltd, Japan</td><td>XX142</td><td>18 &amp;Oslash; &amp;times; 170 mm</td></tr><tr><td>Inverted light microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>CKX41N</td><td>for isolation of algae.</td></tr><tr><td>Plastic dish</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td><td>SH90-15E&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;90 &amp;times; 15 mm</td></tr></tbody></table>

establishment of a clonal culture of unicellular conjugating algae

それは生理学、遺伝学、分類学、微生物学などの様々 なトピックの研究に使用する微細藻類の栄養系文化を確立することが欠かせません。したがって、クローンの文化を確立する技術を開発する非常に重要です。この記事では、抱合藻の栄養文化の確立を示しています。水試料は、フィールドから収集されます。その後、セルはガラス毛細管ピペット、メディアに配置され、クローン培養の生成に適した条件下で栽培を使用して分離されます。

50 mL の水サンプル (Inba1) を 1 つのサンプリング ポイント印旛沼で採取した (pH 8.1 24.7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08 です。 2″E) 2016 年 6 月 25 日に千葉県佐倉市に。4-8 ° C で水のサンプルが格納されました。コレクション、ミカヅキモsp の標本が栄養細胞を含む水試料から分離された後の次の日。同一形態の 15 の栄養細胞 (Inba1 1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9,-10,-11、-12、-13、-14 と-15) サンプルから隔離されピペット洗浄法を使用して洗浄し。15 孤立 1 細胞は CA の馴化培地 15 mL を含む独立した試験管で培養しました。9 試験の試験管内培養 2 週間後細胞増殖が観察された [Inba1-1、-3、-4、-5 (図 2 a)、-6、-9、-10、(図 2 b)、-12、-13;表 2]。9 クローン文化は、Inba1 サンプル分離 (図 3) から確立されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg"> 図 1: 単一細胞分離の流れ。(、) 元の水のサンプルから、滅菌への単一ターゲット藻類細胞転送中最初の時計ガラス。(b、 c)次の時計ガラスを洗浄するにセルを再び転送します。培地のターゲットより他の細胞/汚染物質がなくなるまで、この手順を繰り返す必要があります。3 つの時計眼鏡は例として図をここに示します。(d) 最後に、成長のための適切な媒体のテスト チューブを洗浄のセルを転送します。<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg"> 図 2: 植物細胞の写真ミカヅキモsp(、) Inba1 5、Inba1-12 (b) に示します。スケールバー = 50 μ m.<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg"> 図 3: Inba1 サンプルからクローン培養の確立します。2 週間培養試験管は、下から撮影されました。アスタリスクは、細胞増殖を示します。スケール バー = 2 cm<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>メディアの名前</td>
			<td>参照</td>
			<td colspan="2">コメント</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">CA</td>
			<td rowspan="13">市村と渡辺12
</td>
			<td>Ca (3)2·4H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>自演3
</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH43
</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β-Na2glycerophosphate·5H2O</td>
			<td>3 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ビタミン B12</td>
			<td>0.01 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>ビオチン</td>
			<td>0.01 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>チアミン HCl</td>
			<td>1 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>PIV 金属</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe (EDTA; として 1:1 大臼歯)</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL を作るために水を追加します。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">7.2 NaOH で pH を調整します。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">P IV 金属</td>
			<td rowspan="7">Provasoli と Pintner の13
</td>
			<td>ナ2EDTA·2H2O</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>した FeCl3·6H2O</td>
			<td>19.6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2·4 H2O</td>
			<td>3.6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2*</td>
			<td>1.04 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>0.4 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナ2MoO4·2H2O</td>
			<td>0.25 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL を作るために水を追加します。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fe (EDTA; として 1:1 大臼歯)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14
</td>
			<td>Fe (NH4)2(その4)2·6H2O、</td>
			<td>70.2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA·2H2O、</td>
			<td>66 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL を作るために水を追加します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>CA の馴化培地</td>
			<td>阿部ら7
</td>
			<td colspan="2">14-20 日間の新鮮な CA の培地で細胞を孵化させなさい。定性ろ紙を使用してろ過で培地を収集し、オートクレーブ滅菌 (121 ° C で 15 分) によってフィルター処理された培地を殺菌しなさい。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* で、nies 向け 1.04 mg ZnCl2に置き換えは 2.2 mg ZnSO4·7H2o.</td>
		</tr>
</tbody></table>本研究で使用されるメディアの表 1: 配合。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>水のサンプル</td>
			<td>セルの名前</td>
			<td>培養後の状態</td>
			<td>緊張の名前</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>細胞増殖</td>
			<td>Inba1 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>-2</td>
			<td>変更はできません。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-3</td>
			<td>細胞増殖</td>
			<td>inba1 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>-4</td>
			<td>細胞増殖</td>
			<td>inba1 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>-5</td>
			<td>細胞増殖</td>
			<td>inba1 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>-6</td>
			<td>細胞増殖</td>
			<td>inba1 6</td>
		</tr>
<tr>
<td>-7</td>
			<td>変更はできません。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-8</td>
			<td>変更はできません。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-9</td>
			<td>細胞増殖</td>
			<td>inba1 9</td>
		</tr>
<tr>
<td>-10</td>
			<td>細胞増殖</td>
			<td>inba1 10</td>
		</tr>
<tr>
<td>-11</td>
			<td>変更はできません。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-12</td>
			<td>細胞増殖</td>
			<td>inba1 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>-13-</td>
			<td>細胞増殖</td>
			<td>inba1 13</td>
		</tr>
<tr>
<td>-14</td>
			<td>変更はできません。</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-15</td>
			<td>変更はできません。</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 分離試験概要。

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Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

抱合の単細胞藻類の栄養文化の確立

この記事では、自然の現場から採集した単細胞の抱合藻類種のクローンの文化の確立を示しています。

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K ビュー.  Japan Women's University. この記事では、自然の現場から採集した単細胞の抱合藻類種のクローンの文化の確立を示しています。

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The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

海洋モデルとしてフジツボタテジマフジツボ improvisus培養と遺伝子発現

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

環境学

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

中性脂質のバブル列フォトバイオリアクターとアッセイで緑の微細藻類の栽培

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, and trophic interactions primarily due to methodological challenges, including the ability to culture them. This is particularly true for the doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri commonly occurs in productive subtropical continental shelf systems worldwide, often at bloom concentrations capable of consuming a large fraction of daily primary production. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining D. gegenbauri for the purpose of conducting laboratory-based studies. D. gegenbauri and other doliolid species can be captured live using obliquely towed conical 202 &micro;m mesh plankton nets from a drifting ship. Cultures are most reliably established when water temperatures are below 21 &deg;C and are started from immature gonozooids, maturing phorozooids, and large nurses. Cultures can be maintained in rounded culture vessels on a slowly rotating plankton wheel and sustained on a diet of cultured algae in natural seawater for many generations. In addition to the ability to establish laboratory cultures of D. gegenbauri, we demonstrate that the collection condition, algae concentration, temperature, and exposure to naturally conditioned seawater are all critical to the culture establishment, growth, survival, and reproduction of D. gegenbauri.

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

Doliolids, including the species Dolioletta gegenbauri, are small gelatinous marine zooplankton of ecological significance found on productive subcontinental shelf systems worldwide. The difficulty of culturing these delicate organisms limits their investigation. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining the doliolid Dolioletta gegenbauri.

実験研究のための海洋ペラジック・チュニケート・ドリオレッタ・ゲゲンバウリ(ウルジャニン1884)の栽培

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact genome. For these reasons, it is considered a useful model organism for marine ecological studies, evolutionary developmental biology, and genomics. As research often requires a steady supply of animal resources, it is useful to establish a reliable, low-maintenance culture system. Here we describe a step-by-step method for establishing an O. dioica culture. We describe how to select potential sampling sites, collection methods, target animal identification, and the set-up of the culturing system. We provide troubleshooting advice based on our own experiences. We also highlight critical factors that help sustain a robust culture system. Although the culture protocol provided here is optimized for O. dioica, we hope our sampling technique and culture setup will inspire new ideas for maintaining other fragile pelagic invertebrates.

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a tunicate model organism in various fields of biology. We describe sampling methods, species identification, culturing setup, and culturing protocols for the animals and algal feed. We highlight key factors that helped strengthen the culture system and discuss the possible problems and resolutions.

「大子広場」の合理化されたサンプリングと栽培

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

Coupling Carbon Capture from a Power Plant with Semi-automated Open Raceway Ponds for Microalgae Cultivation

In the United States, 35% of the total carbon dioxide (CO2) emissions come from the electrical power industry, of which 30% represent natural gas electricity generation. Microalgae can biofix CO2 10 to 15 times faster than plants and convert algal biomass to products of interest, such as biofuels. Thus, this study presents a protocol that demonstrates the potential synergies of microalgae cultivation with a natural gas power plant situated in the southwestern United States in a hot semi-arid climate. State-of-the-art technologies are used to enhance carbon capture and utilization via the green algal species Chlorella sorokiniana, which can be further processed into biofuel. We describe a protocol involving a semi-automated open raceway pond and discuss the results of its performance when it was tested at the Tucson Electric Power plant, in Tucson, Arizona. Flue gas was used as the main carbon source to control pH, and Chlorella sorokiniana was cultivated. An optimized medium was used to grow the algae. The amount of CO2 added to the system as a function of time was closely monitored. Additionally, other physicochemical factors affecting algal growth rate, biomass productivity, and carbon fixation were monitored, including optical density, dissolved oxygen (DO), electroconductivity (EC), and air and pond temperatures. The results indicate that a microalgae yield of up to 0.385 g/L ash-free dry weight is attainable, with a lipid content of 24%. Leveraging synergistic opportunities between CO2 emitters and algal farmers can provide the resources required to increase carbon capture while supporting the sustainable production of algal biofuels and bioproducts.

A protocol is described to utilize the carbon dioxide in natural gas power plant flue gas to cultivate microalgae in open raceway ponds. Flue gas injection is controlled with a pH sensor, and microalgae growth is monitored with real time measurements of optical density.

発電所からの炭素回収と微細藻類栽培用の半自動オープンレースウェイ池の結合

In the United States, 35% of the total carbon dioxide (CO2) emissions come from the electrical power industry, of which 30% represent natural gas ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

交配との四分子の分離クラミドモナス遺伝子解析用

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

生物学

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable photosynthetic models facilitating the understanding of the basic cellular processes. System wide studies enable comprehensive and in-depth understanding of molecular functions of the organisms. However, multiple independent samples and protocols are required for proteomics, lipidomics and metabolomics studies introducing higher error and variability. A robust high throughput extraction method for the simultaneous extraction of chlorophyll, lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample of the green alga Chlamydomonas reinhardtii is presented here. The illustrated experimental setup is for Chlamydomonas cultures synchronized using 12 h/12 h light/dark conditions. Samples were collected over a 24 h cell cycle to demonstrate that the metabolites, lipids and starch data obtained using various analytical platforms are well conformed. Furthermore, protein samples collected using the same extraction protocol were used to conduct detailed proteomics analysis to evaluate their quality and reproducibility. Based on the data, it can be inferred that the illustrated method provides a robust and reproducible approach to advance understanding of various biochemical pathways and their functions with greater confidence for both basic and applied research.

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

System-wide analysis of multiple biomolecules is crucial to gain functional and mechanistic insights into biological processes. Hereby, an extensive protocol is described for high throughput extraction of lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample harvested from synchronized Chlamydomonas culture.

緑藻クラミドモナス・ラインハルトティの同期培養物の詳細分析のためのマルチオミクス抽出法

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

発生生物学

<meta charset="utf8"></head><body>成長因子の最適化による微細藻類のクロロフィル生産の促進

Evaluation of the Effect of Growth Factors on Chlorophylls a and b Production from Microalgae

Microalgae contain two main groups of pigments: chlorophylls and carotenoids. Chlorophyll is a green pigment that absorbs light energy and transforms it into chemical energy to facilitate the synthesis of organic compounds. This pigment serves as a valuable primary source for biotechnological input products in the food, pharmaceutical, and cosmetic industries due to its high antioxidant properties and coloring capabilities. The objective of this research was to evaluate the effect of growth factors (CO2 concentration, light color, and light intensity) through a Taguchi L4 experimental design on cell growth and the cellular content of chlorophyll a and b in Chlorella sorokiniana, followed by validation of the method using Haematococcus pluvialis microalgae as an additional study model. Cell growth was quantified using the optical density spectrophotometric technique at a wavelength of 550 nm. For the quantification of chlorophylls, a cell extract was obtained using a 90% pure acetone solution, and subsequently, the concentrations of chlorophylls a and b were quantified using spectrophotometric techniques at wavelengths of 647 nm and 664 nm, according to the method described by Jeffrey and Humphrey. The experimental results indicated that controlling conditions of low CO2 addition, purple light, and low light intensity increases both cell growth and the concentration of chlorophylls a and b within the cells. The implementation of this chlorophyll quantification method allows for quick, simple, and precise determination of chlorophyll content, as the wavelengths used are at the absorbance peaks of both types of chlorophylls, making this technique easily reproducible for any microalgae under study.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:バイオテクノロジー関連二次代謝産物の生産のための成長因子の最適化

The present study highlights the advantages of employing the method developed by Jeffrey and Humphrey for extracting and quantifying fat-soluble pigments from microalgae. This method serves as a valuable tool for assessing the influence of growth factors on chlorophyll production and cellular content in these organisms.

微細藻類からのクロロフィル a および b 産生に及ぼす成長因子の影響評価

Microalgae contain two main groups of pigments: chlorophylls and carotenoids. Chlorophyll is a green pigment that absorbs light energy and transforms it ...

抱合の単細胞藻類の栄養文化の確立

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海洋モデルとしてフジツボタテジマフジツボ improvisus培養と遺伝子発現

中性脂質のバブル列フォトバイオリアクターとアッセイで緑の微細藻類の栽培

実験研究のための海洋ペラジック・チュニケート・ドリオレッタ・ゲゲンバウリ(ウルジャニン1884)の栽培

「大子広場」の合理化されたサンプリングと栽培

発電所からの炭素回収と微細藻類栽培用の半自動オープンレースウェイ池の結合

交配との四分子の分離クラミドモナス遺伝子解析用

緑藻クラミドモナス・ラインハルトティの同期培養物の詳細分析のためのマルチオミクス抽出法

微細藻類からのクロロフィル a および b 産生に及ぼす成長因子の影響評価

微細藻類からのクロロフィル a および b 産生に及ぼす成長因子の影響評価

微細藻類からのクロロフィル a および b 産生に及ぼす成長因子の影響評価