우리 감사 히사요 노자 키 (도쿄 대학), 오 나카 다 (게이오 대학), 유카 Marukawa 하시 모토 (일본 여자 대학교), 히로유키 Sekimoto (일본 여자의 대학). 그들의 의견에 대 한 검토자에 게 감사 하 길. 이 연구는 과학의 승진, 일본, 일본 사회에서 과학 연구 (No. 26440223 및 15 H 04413)에 대 한 특정 고 유키 Tsuchikane에 새로운 기술 개발 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 해 조류를 포함 하는 물 샘플의 수집
참고: 단 세포 conjugatophytes 호수, 늪, 논 등 정체 민물 지역에서 성장 한다. 조류-포함 된 물 샘플은 문화 긴장을 생산 하기 위해 이러한 환경 중 하나에서 수집 됩니다. 프로세스를 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 플랑크톤 넷, 일회용 피 펫, 그리고 병 또는 50 mL 튜브 물 샘플을 수집.
<ol><li>플랑크톤 호수 환경에서 인터넷을 사용 하 여 물에서 조류를 수집. 사용 목적에 따라 적절 한 net. 참고: 그물의 상부는 물 침투성. 그물에 의해 조류 그물 플랑크톤의 하단 컨테이너에 집중 된다. 굵고 메쉬 작은 조류를를 통해 전달할 수 있습니다. 좋은 메쉬 쉽게 막힌 가져옵니다.</li>
	<li>50 mL 튜브 또는 100 mL 플라스틱 병에 물 (약 50ml)을 전송 합니다. 실험실에 집중된 물 샘플을가지고.</li>
	<li>단 세포 conjugatophytes는 또한 늪 이나 논에서 성장 한다. 이 얕은 물 지역에서 조류를 포함 하는 물 샘플 직접 스포이드와 함께 샘플링 될 수 있습니다. 그런 다음, 전송 (30-50 mL) 물 50 mL 튜브 또는 50 mL 플라스틱 병. 참고: 물은 신중 하 게 샘플링 토양 표면 위의 샘플 어떤 토양을 포함 하지 않습니다.</li>
</ol>2입니다. 조류의 확인
참고: 다음 항목은 필요 시는 루 페 또는 휴대용 현미경 및 60 m m 관찰에 대 한 접시.
<ol><li>일회용 피 펫에는 샘플에 조류의 존재를 확인, 샘플을 직접 관찰 하는 루 페를 사용 합니다. 참고: 약의 더 큰 셀 400-1000 µ m 길이 (예를 들어, Closterium ehrenbergii)에 쉽게 수 있습니다이 방법을 사용 하 여 관찰.</li>
	<li>휴대용 현미경 조류를 확인 하려면 플라스틱 실험실 접시에 물 샘플을 붓는 다.<ol>
<li>윗부분의 안쪽 부분에 샘플 (약 3 mL)을 넣어 (뚜껑) 60 mm 페 트리 접시의 위에 뚜껑의 안쪽 부분을 직면 하 고 그것의 바닥 부분과 아래쪽 절반 장소. 참고:이 메서드는 이동에서 샘플을 유지 하 고 관찰을 쉽게.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 격리 한 유리 모 세관 피 펫 파스퇴르 피 펫에서의 준비
참고: 프로세스를 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 살 균 파스퇴르 펫, 파스퇴르 펫, 장갑, 고무 전구, 정신 램프, 유리, 쓰레기통, 집게, 라이터, 정신 램프에 대 한 메탄올에 대 한 랙 및 클린 룸 또는 층 류 흐름 후드 (필요한 경우)입니다.
<ol><li>알콜 버너 점화.<ol>
<li>격리에 대 한 정밀한 유리 모 세관 피펫은 생산, 불꽃은 경 경 하지 있는지 확인 합니다. 불꽃을 날카롭게 하 고 파스퇴르 피 펫의 끝을 녹여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지원 되는 고무 전구 측면에 손으로 및 팁 사이드에 집게를 사용 하 여 불꽃에 파스퇴르 피 펫 멸 균 유리 열.</li>
	<li>불꽃에서 파스퇴르 피 펫을가지고 고 그것을 스트레칭.<ol>
<li>유리 용 해, 신속 하 게 불꽃에서 파스퇴르 피 펫을 제거 하 고 키를 누릅니다. 참고:이 실험에서 파스퇴르 피펫으로 확장 되었다에 의해 15-20 cm. 확인 확실을 피펫으로 불꽃을 당기는 동안.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 길이를 유리 모 세관 피 펫의 끝을 휴식. 때문에 굴복 부분은 최고의 팁에 이상적입니다. 참고:이 연구에서 5-10 cm의 팁과 유리 모 세관 피펫은 준비 되었다.<ol>
<li>그것을 용융 후 모 세관을 삭제 하 고 불꽃 나오는 것을 확인 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>거품 유리 모 세관 피 펫에서 발표 여 팁의 크기를 나타냅니다. 격리 되어야 하는 셀에 대 한 적절 한 크기를 선택 합니다. 약 1 m m 거품의 셀 폭이 10-20 µ m의 Closterium 종의 격리에 대 한 적절 한입니다.</li>
</ol>4. 단일 셀 격리 유리 모 세관 피 펫
참고: 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 거꾸로 가벼운 현미경, 시계 안경, 플라스틱 접시, 그리고 메 마른 스레드 시험관 CA 매체 (표 1)를 포함 하거나 CA 중간7조건.
<ol><li>몇 가지 시계 안경 (22 m m 직경에서 및 깊이 1 m m), 살 균 CA 매체의 각 포함 1 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>현장에서 수집 물 샘플에서 목표 셀을 격리 합니다.<ol>
<li>플라스틱 그릇에 대상 셀을 포함 하는 물 샘플 (약 30-40 mL)를 따르십시오.</li>
		<li>거꾸로 가벼운 현미경 플라스틱 접시에 샘플을 관찰 하는 동안 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 단일 셀을 선택 합니다.</li>
		<li>모 세관 작용에 의해 세포의 포부를 촉진 하기 위하여 셀 근처 유리 모 세관 피 펫을가지고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 CA 매체 (그림 1a)의 1 mL를 포함 하는 시계 유리에 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>다시 새로운 유리 모 세관 피펫은 멸 균 CA 매체에서를 사용 하 여 셀을 선택 하 고 메 마른 캘리포니아 매체 (그림 1b)를 포함 하는 두 번째 시계 유리에 그것을 전송. 참고:이 프로세스는 단일 셀 자리 플레이트 (그림 1c)에 격리 될 때까지 반복 됩니다.</li>
	<li>새로운 유리 모 세관 피펫은를 사용 하 여 단일 셀을 선택 하 고 마지막으로 CA 매체 또는 조건된 CA 매체 (그림 1의 d)의 14 mL를 포함 하는 테스트 튜브에 전송. 16 h 빛: 8에서 23 ° C에서 샘플을 품 어-어두운 h 2 주 주기. 참고: 주변 환경으로 성장 하는 세포에서 분 비 되는 세포 증식에 대 한 알 수 없는 factor(s)4세포 분열 촉진 하기 위하여 조절된 매체에 포함 됩니다. 클론 문화를 설립 하는 경우 배양4에서 바른된 CA 매체를 준비 합니다. 문화 성공 하면 녹색을 돌 것 이다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wickett, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylotranscriptomic+analysis+of+the+origin+and+early+diversification+of+land+plants.">Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).</li><li>Delwiche, C. F., Cooper, E. 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현재 메서드를 사용 하 여 Closterium sp.의 9 클론 문화 긴장 15 셀 60%의 성공률을 나타내는 물 샘플 (Inba1)에서 고립에서 설립 되었다. 종 식별 밖으로 미래에 형태학 관찰 분자 계통 발생 분석8같은 DNA 분석에 의해 실행 될 것 이다.
현재의 방법에서 물 샘플의 신선도 성공률에 중요 하다. 필드 컬렉션 후 즉시 물 샘플에서 세포를 분리 하는 것이 낫다. Closterium 종 (예를 들어, C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale 복잡 한)의 세포는 4-8 ° C에서 그것을 저장 하 여 약 7 d 물 샘플에서 유지 될 수, 세포의 분리는 바람직한 컬렉션 또는 다음 날의 하루. 그것은 또한 세척 반복의 수를 증가 하는 그래서 대상 셀 이외의 어떤 오염 물질을 제거 하는 것이 중요 (즉, > 3 x) 미생물 토양과 셀에 의해 문화의 오염 되지 않을 수 있습니다.
이 기술은 한계 (CA 또는 CA 매체 조절된)이이 프로토콜에 사용 된 문화 미디어는 항상 모든 conjugating 조류에 대 한 적절 한입니다. 경우에 따라 그것은 다른 매체 뿐 아니라 다른 빛과 온도 조건을 사용 하 여 필요할 수 있습니다. 또한, 그것은 하나의 단일 셀에서 문화 성장 여부를 증명 하기 어려운, 그것은 테스트 튜브에 세포를 전송할 때 정확 하 게 1 셀을 선택 하는 데 필요한. 따라서, 전송 할 수 새로운 유리 모 세관 피 펫을 각 시간.
이 피 펫 세척 방법 클론 문화 수립 클래식/표준 방법 이며, 연구에 대 한 원하는 셀을 사용 하는 가장 신뢰할 수 있는 방법입니다. 많은 연구8,9,,1011 에 사용 되는 조류를 동산의 클론 문화는 현재 메서드를 사용 하 여 설치 되었다. 클론 문화 없이 변화 조류를 분석 하는 것이 어렵습니다. 또한, 최근 몇 년 동안, 드 노 보 전체 게놈 시퀀스를 (예를 들어, 미니 언 nanopore 시퀀서를 사용 하 여), 쉽게 되었고 클론 문화 구축 더 드 노 보 시퀀싱을 촉진 한다. 즉,이 메서드는 첫 번째 단계는 미래에 더 그들의 생물 다양성을 이해 하는 것이 조류의 연구.
안정적인 문화 긴장을 설정 하기 위해 그것은 정확 하 게는 프로토콜 내에서 특정 중요 한 단계를 수행 하는 데 필요한입니다. 가장 중요 한 단계는 단일 셀만의 통과 허용 하는 최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫의 준비 합니다. 유리 모 세관 피 펫의 조리개의 셀의 작은 축 길이 보다 약간 더 있어야 합니다. 최적의 유리 모 세관 피펫은 모 세관 작용에 의해 단일 셀을 발음 수 있습니다. 그러나, 조리개의 직경이 너무 크면, 모 세관 비 생활 오염 물질 또는 심지어 (는) 다른 organism(s), 목표 셀 외에 그릴 것입니다.
최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫을 얻기 위해 다음 사항을 주의 하는 중요 하다. 첫째, 불꽃의 기둥 유리 모 세관 피 펫을가 열 하는 때 좁은 수 있어야 합니다. 다음, 파스퇴르 피 펫, 당기는 불꽃;에서 제거 그렇지 않으면, 파스퇴르 피 펫의 조리개 붕괴 됩니다.
장비 및 컨테이너가이 프로토콜에 표시 된 기본은 하 고 수정할 수 있습니다. 예를 들어 사용 하 여 멀티 잘 플레이트 한 잘 시계 안경 대신, 셀 세척 할 수 있다 더 효율적. 또한, 기타 유사한 것 들에 대 한 컨테이너를 교체하실 수 있습니다. 마지막 단계에서 문화 매체에 단일 셀을 전송 하 여 클론 문화를 설정할 수 있습니다.
멸 균된 용기를 준비 하 고 후드에서 axenic (오염된) 긴장을 설정 합니다. 오염을 방지 하기 위해, 그것은 이상 3 x 신선한 aliquots와 세척 단계를 반복 해야 합니다. 가끔은, 박테리아는 또한 항생제15을 추가 하 여 멸 균.
이 방법에 초점을 맞춘 desmid (Zygnematales) 절연, 하지만 유리 모 세관 피펫은 조리개의 크기를 바꾸어 서, 그것은 다르게 크기의 플랑크톤의 고립에 적용할 수 있습니다.

동산 (의 주문 Zygnematales) 조류, 일컬어 conjugatophytes, 차지 토지 식물1,2의 즉시 조상의 가장 가까운 살아있는 친척으로 주요 계통 발생 위치. 설립된 클론 문화 조류의 분류학, 생리, 그리고 유전자 연구의 광범위 한 지난 몇 년간 끌고있다. 자연적인 분야에서 미생물의 절연 기술을 오랜 전통3,4있다. 최근 몇 년 동안, cytometry 사용 하는 기술도 있다 자동화 된 격리 설립5. 클론 문화의 설립에 대 한 단일 셀을 가져오는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법이입니다 유리 모 세관 피펫은6을 사용 하 여 단일 셀 격리. 이 전통적인 방법 기술과 정확한 실험 프로토콜에 필요합니다.
이 문서에서 설명 해 조류의 샘플링 필드 샘플 및 Closterium 종 같은 단 세포의 변화 조류의 클론 문화의 설립에서 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 합니다. 식물 세포를 포함 하는 물 샘플 필드 사이트 (예를 들면, 호수, 연못, 또는 논)에서 수집 됩니다. 세포는 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 물 샘플에서 격리 하 고 씻어. 셀 16 h 빛: 8에서 24 ° C에서 질소 보충 매체 (CA 중간)를 포함 하는 테스트 튜브에 교양-h 어두운 정권. 이 메서드는 또한 클론 문화 생성 하 다른 미세 분리에 적합.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Sampling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plankton net</td><td>RIGO, Japan</td><td>N-NO380T</td><td>Mesh size: 32 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE)</td><td>Nikon, Japan</td><td>JAN: 4960759 206725</td><td>Magnification: 20&amp;times;</td></tr><tr><td>Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier)</td><td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan</td><td>1985-20</td><td>Magnification: 20&amp;times;</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan</td><td>Sterile spuit No.4</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps)</td><td>Labcon, USA</td><td>3181-345-008</td><td></td></tr><tr><td>Bottle (100 mL Polycarbonate bottle)</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>1-7403-01</td><td></td></tr><tr><td>60 mm dish</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td><td>1010-060</td><td>&amp;nbsp;For observation of algae.&amp;nbsp; 60 mm/non-treated dish</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Preparation of a micropipette&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes (cotton plugged 9&amp;rdquo; Pasteur Pipettes)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>13-678-8B</td><td>7 &amp;times; 225 mm</td></tr><tr><td>Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc)</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>5-5669-01</td><td>10 &amp;times; 40 mm</td></tr><tr><td>Stainless forceps</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>PT-09</td><td>110 mm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single-cell isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Watch glass (Blood reaction board)</td><td>Sekiya Rika Co., Ltd, Japan</td><td>F14-155-030</td><td>to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth</td></tr><tr><td>Threaded test tubes&amp;nbsp;</td><td>Fujimotorika, Co., Ltd, Japan</td><td>XX142</td><td>18 &amp;Oslash; &amp;times; 170 mm</td></tr><tr><td>Inverted light microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>CKX41N</td><td>for isolation of algae.</td></tr><tr><td>Plastic dish</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td><td>SH90-15E&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;90 &amp;times; 15 mm</td></tr></tbody></table>

establishment of a clonal culture of unicellular conjugating algae

다양 한 주제, 생리학, 유전학, 분류학, 미생물학 등의 연구에 사용 하기 위해 미세 클론 문화 확립에 필수적 이다. 따라서, 매우 클론 문화를 구축 하는 기술을 개발 하는 것이 중요 하다. 이 문서에서는, conjugating 조류의 클론 문화의 설립을 설명합니다. 물 샘플은 현장에서 수집 됩니다. 그 후, 세포를 유리 모 세관 피 펫, 미디어에 배치 하 고 클론 문화 생성을 위해 적당 한 조건 하에서 재배를 사용 하 여 격리 됩니다.

50 mL의 물 샘플 (Inba1) 한 샘플링 지점 호수 바 numa에서에서 수집 (pH 8.1 24.7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E)에 사쿠라 시, 치 바, 일본, 6 월 25 일, 2016. 물 샘플은 4-8 ° c.에 저장 된 Closterium sp.의 표본 수집 후 다음날 식물 세포를 포함 하는 물 샘플에서 분리 했다. 동일한 형태학의 15 식물 세포 (Inba1-1,-2,-3,-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14, 및-15) 샘플에서 고립 되었고 다음 세척 방법 피 펫을 사용 하 여 세척. 15 고립 된 단일 셀 조건된 CA 매체의 15 mL를 포함 하는 독립적인 테스트 튜브에 교양 있었다. 2 주 후 부 화, 세포 증식 9 테스트 튜브에서 관찰 되었다 [Inba1-1,-3,-4,-5 (그림 2a),-6,-9,-10,-(그림 2b), 12와-13; 표 2]입니다. 9 클론 문화 Inba1 샘플 분리 (그림 3)에서 설립 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg"> 그림 1 : 단일 셀 격리의 흐름. 첫 번째 시계 유리에서 (은)는 살 균을 원래 물 샘플에서 단일 대상 조류 셀 전송 매체. (b, c) 씻어 다음 시계 유리 셀을 다시 전송 합니다. 없는 다른 셀/오염 매체; 대상 보다는 때까지이 절차를 반복 해야 합니다. 3 개의 시계 유리는 예를 들어 여기에 다이어그램에 표시 됩니다. (d) 마지막으로, 성장에 대 한 적절 한 매체의 테스트 튜브를 씻어 셀을 전송. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg"> 그림 2 : 식물 세포의 사진 Closterium sp. (한) Inba1-5와 (b) Inba1-12 여기에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg"> 그림 3 : Inba1 샘플에서 클론 문화의 설립. 2 주 동안 배양 시험관 바닥에서 촬영 했다. 별표는 셀 확산을 나타냅니다. 눈금 막대 = 2 cm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>미디어의 이름</td>
			<td>참조</td>
			<td colspan="2">코멘트</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">CA</td>
			<td rowspan="13">Ichimura와 와타나베12
</td>
			<td>캘리포니아 (3)2·4H2O</td>
			<td>2 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>알 것3
</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH43
</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β-나2glycerophosphate·5H2O</td>
			<td>3 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>2 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>비타민 B12</td>
			<td>0.01 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>비타민 b 복합체</td>
			<td>0.01 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>티 아민 HCl</td>
			<td>1 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>PIV 금속</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe (EDTA;로 1:1 어 금 니)</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">pH 7.2 NaOH로 조정</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">P 4 금속</td>
			<td rowspan="7">Provasoli 및 Pintner13
</td>
			<td>나2EDTA·2H2O</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl3·6H2O</td>
			<td>19.6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2· 4 H2O</td>
			<td>3.6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2*</td>
			<td>1.04 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>0.4 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>나2무4·2H2O</td>
			<td>0.25 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fe (EDTA;로 1:1 어 금 니)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14
</td>
			<td>Fe (NH4)2(이렇게4)2·6H2O,</td>
			<td>70.2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA·2H2O,</td>
			<td>66 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다</td>
		</tr>
<tr>
<td>바른된 CA 매체</td>
			<td>아베 외7
</td>
			<td colspan="2">14-20 일에 대 한 신선한 CA 매체에 세포를 품 어. 교양된 매체 여과 질적 필터 종이 사용 하 여 수집 하 고 압력가 마로 소독 (15 분 동안 121 ° C)에 의해 필터링 된 매체를 소독.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*에 NIES 1.04 mg ZnCl2 2.2 mg ZnSO4·7H2o.에 의해 대체 됩니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1:이 연구에 사용 된 미디어의 공식.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>물 샘플</td>
			<td>셀의 이름</td>
			<td>문화 후 상태</td>
			<td>스트레인 이름</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>Inba1-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>-2</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-3</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>-4</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>-5</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>-6</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>-7</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-8</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-9</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-9</td>
		</tr>
<tr>
<td>-10</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>-11</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-12</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-12</td>
		</tr>
<tr>
<td>-13</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-13</td>
		</tr>
<tr>
<td>-14</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-15</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2:에서 격리 시험 요약입니다.

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Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

단 세포 변화 조류의 클론 문화 설립

이 문서에서는, 종의 단 세포 변화 조류 자연 필드 사이트에서 수집 된 클론 문화의 설립을 설명 합니다.

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

establishment-of-a-clonal-culture-of-unicellular-conjugating-algae

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K 조회수.  Japan Women's University. 이 문서에서는, 종의 단 세포 변화 조류 자연 필드 사이트에서 수집 된 클론 문화의 설립을 설명 합니다.

비디오: Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

해양 모델-따개 비 Balanus improvisus 경작 및 유전자 발현

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

연구

환경과학

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

중립 지질에 대 한 녹색 미세 거품 열 Photobioreactors에 시험 재배

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, and trophic interactions primarily due to methodological challenges, including the ability to culture them. This is particularly true for the doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri commonly occurs in productive subtropical continental shelf systems worldwide, often at bloom concentrations capable of consuming a large fraction of daily primary production. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining D. gegenbauri for the purpose of conducting laboratory-based studies. D. gegenbauri and other doliolid species can be captured live using obliquely towed conical 202 &micro;m mesh plankton nets from a drifting ship. Cultures are most reliably established when water temperatures are below 21 &deg;C and are started from immature gonozooids, maturing phorozooids, and large nurses. Cultures can be maintained in rounded culture vessels on a slowly rotating plankton wheel and sustained on a diet of cultured algae in natural seawater for many generations. In addition to the ability to establish laboratory cultures of D. gegenbauri, we demonstrate that the collection condition, algae concentration, temperature, and exposure to naturally conditioned seawater are all critical to the culture establishment, growth, survival, and reproduction of D. gegenbauri.

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

Doliolids, including the species Dolioletta gegenbauri, are small gelatinous marine zooplankton of ecological significance found on productive subcontinental shelf systems worldwide. The difficulty of culturing these delicate organisms limits their investigation. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining the doliolid Dolioletta gegenbauri.

실험 연구를 위한 해양 펠라기 투니케이트 돌리오레타 게겐바우리 재배 (울자닌 1884)

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact genome. For these reasons, it is considered a useful model organism for marine ecological studies, evolutionary developmental biology, and genomics. As research often requires a steady supply of animal resources, it is useful to establish a reliable, low-maintenance culture system. Here we describe a step-by-step method for establishing an O. dioica culture. We describe how to select potential sampling sites, collection methods, target animal identification, and the set-up of the culturing system. We provide troubleshooting advice based on our own experiences. We also highlight critical factors that help sustain a robust culture system. Although the culture protocol provided here is optimized for O. dioica, we hope our sampling technique and culture setup will inspire new ideas for maintaining other fragile pelagic invertebrates.

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a tunicate model organism in various fields of biology. We describe sampling methods, species identification, culturing setup, and culturing protocols for the animals and algal feed. We highlight key factors that helped strengthen the culture system and discuss the possible problems and resolutions.

펠라곤 코스모폴리탄 라르바천, 오이코플레우라 디오이카의 간소화된 샘플링 및 재배

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

Coupling Carbon Capture from a Power Plant with Semi-automated Open Raceway Ponds for Microalgae Cultivation

In the United States, 35% of the total carbon dioxide (CO2) emissions come from the electrical power industry, of which 30% represent natural gas electricity generation. Microalgae can biofix CO2 10 to 15 times faster than plants and convert algal biomass to products of interest, such as biofuels. Thus, this study presents a protocol that demonstrates the potential synergies of microalgae cultivation with a natural gas power plant situated in the southwestern United States in a hot semi-arid climate. State-of-the-art technologies are used to enhance carbon capture and utilization via the green algal species Chlorella sorokiniana, which can be further processed into biofuel. We describe a protocol involving a semi-automated open raceway pond and discuss the results of its performance when it was tested at the Tucson Electric Power plant, in Tucson, Arizona. Flue gas was used as the main carbon source to control pH, and Chlorella sorokiniana was cultivated. An optimized medium was used to grow the algae. The amount of CO2 added to the system as a function of time was closely monitored. Additionally, other physicochemical factors affecting algal growth rate, biomass productivity, and carbon fixation were monitored, including optical density, dissolved oxygen (DO), electroconductivity (EC), and air and pond temperatures. The results indicate that a microalgae yield of up to 0.385 g/L ash-free dry weight is attainable, with a lipid content of 24%. Leveraging synergistic opportunities between CO2 emitters and algal farmers can provide the resources required to increase carbon capture while supporting the sustainable production of algal biofuels and bioproducts.

A protocol is described to utilize the carbon dioxide in natural gas power plant flue gas to cultivate microalgae in open raceway ponds. Flue gas injection is controlled with a pH sensor, and microalgae growth is monitored with real time measurements of optical density.

발전소의 탄소 포집과 미세조류 재배를 위한 반자동 개방형 경마장 연못 결합

In the United States, 35% of the total carbon dioxide (CO2) emissions come from the electrical power industry, of which 30% represent natural gas ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

번식과 Tetrad 분리 Chlamydomonas reinhardtii 유전자 분석을위한

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

생물학

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable photosynthetic models facilitating the understanding of the basic cellular processes. System wide studies enable comprehensive and in-depth understanding of molecular functions of the organisms. However, multiple independent samples and protocols are required for proteomics, lipidomics and metabolomics studies introducing higher error and variability. A robust high throughput extraction method for the simultaneous extraction of chlorophyll, lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample of the green alga Chlamydomonas reinhardtii is presented here. The illustrated experimental setup is for Chlamydomonas cultures synchronized using 12 h/12 h light/dark conditions. Samples were collected over a 24 h cell cycle to demonstrate that the metabolites, lipids and starch data obtained using various analytical platforms are well conformed. Furthermore, protein samples collected using the same extraction protocol were used to conduct detailed proteomics analysis to evaluate their quality and reproducibility. Based on the data, it can be inferred that the illustrated method provides a robust and reproducible approach to advance understanding of various biochemical pathways and their functions with greater confidence for both basic and applied research.

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

System-wide analysis of multiple biomolecules is crucial to gain functional and mechanistic insights into biological processes. Hereby, an extensive protocol is described for high throughput extraction of lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample harvested from synchronized Chlamydomonas culture.

녹색 조류 클라미도모나스 린하르티의 동기화 된 배양의 심층 분석을위한 다중 Omics 추출 방법

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

발생학

<meta charset="utf8"></head><body>Enhancing Chlorophyll production in Microalgae via Growth Factor Optimization(성장 인자 최적화를 통한 미세조류의 엽록소 생산 향상)

Evaluation of the Effect of Growth Factors on Chlorophylls a and b Production from Microalgae

Microalgae contain two main groups of pigments: chlorophylls and carotenoids. Chlorophyll is a green pigment that absorbs light energy and transforms it into chemical energy to facilitate the synthesis of organic compounds. This pigment serves as a valuable primary source for biotechnological input products in the food, pharmaceutical, and cosmetic industries due to its high antioxidant properties and coloring capabilities. The objective of this research was to evaluate the effect of growth factors (CO2 concentration, light color, and light intensity) through a Taguchi L4 experimental design on cell growth and the cellular content of chlorophyll a and b in Chlorella sorokiniana, followed by validation of the method using Haematococcus pluvialis microalgae as an additional study model. Cell growth was quantified using the optical density spectrophotometric technique at a wavelength of 550 nm. For the quantification of chlorophylls, a cell extract was obtained using a 90% pure acetone solution, and subsequently, the concentrations of chlorophylls a and b were quantified using spectrophotometric techniques at wavelengths of 647 nm and 664 nm, according to the method described by Jeffrey and Humphrey. The experimental results indicated that controlling conditions of low CO2 addition, purple light, and low light intensity increases both cell growth and the concentration of chlorophylls a and b within the cells. The implementation of this chlorophyll quantification method allows for quick, simple, and precise determination of chlorophyll content, as the wavelengths used are at the absorbance peaks of both types of chlorophylls, making this technique easily reproducible for any microalgae under study.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Optimizing Growth Factors for Production of Biotechically Relevant Secondary Metabolites (생명공학적으로 관련된 2차 대사산물 생산을 위한 성장 인자 최적화)

The present study highlights the advantages of employing the method developed by Jeffrey and Humphrey for extracting and quantifying fat-soluble pigments from microalgae. This method serves as a valuable tool for assessing the influence of growth factors on chlorophyll production and cellular content in these organisms.

미세조류로부터의 엽록소 a 및 b 생산에 대한 성장 인자의 영향 평가

Microalgae contain two main groups of pigments: chlorophylls and carotenoids. Chlorophyll is a green pigment that absorbs light energy and transforms it ...

단 세포 변화 조류의 클론 문화 설립

요약

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이 비디오의 챕터

해양 모델-따개 비 Balanus improvisus 경작 및 유전자 발현

중립 지질에 대 한 녹색 미세 거품 열 Photobioreactors에 시험 재배

실험 연구를 위한 해양 펠라기 투니케이트 돌리오레타 게겐바우리 재배 (울자닌 1884)

펠라곤 코스모폴리탄 라르바천, 오이코플레우라 디오이카의 간소화된 샘플링 및 재배

발전소의 탄소 포집과 미세조류 재배를 위한 반자동 개방형 경마장 연못 결합

번식과 Tetrad 분리 Chlamydomonas reinhardtii 유전자 분석을위한

녹색 조류 클라미도모나스 린하르티의 동기화 된 배양의 심층 분석을위한 다중 Omics 추출 방법

미세조류로부터의 엽록소 a 및 b 생산에 대한 성장 인자의 영향 평가

미세조류로부터의 엽록소 a 및 b 생산에 대한 성장 인자의 영향 평가

미세조류로부터의 엽록소 a 및 b 생산에 대한 성장 인자의 영향 평가