Ringraziamo Hisayoshi Nozaki (Università di Tokyo), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Università femminile del Giappone) e Hiroyuki Sekimoto (Università femminile del Giappone). Desideriamo ringraziare gli utenti per i loro commenti. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione per la ricerca scientifica (n. 26440223 e H 15 04413) della Japan Society per la promozione della scienza, Giappone e da una sovvenzione della Fondazione di sviluppo di tecnologia nuova per Yuki Tsuchikane.

1. raccolta di un campione di acqua contenente alghe
Nota: Conjugatophytes unicellulari crescere nelle aree di acqua dolce stagnante, come laghi, paludi e risaie. Un campione di acqua contenente alghe raccolti da uno di questi ambienti per la produzione di un ceppo di cultura. I seguenti elementi sono necessari prima di iniziare il processo: un plancton netto, una pipetta monouso e una bottiglia o un tubo da 50 mL per la raccolta di campioni di acqua.
<ol><li>Utilizzare un plancton netto in un ambiente di lago per raccogliere le alghe dall'acqua. Utilizzare una rete appropriata, a seconda dello scopo. Nota: La parte superiore della rete è permeabile all'acqua. Le alghe catturate dalla rete sono concentrate nel contenitore inferiore del plancton netto. Un grossolano permette piccole alghe di passare attraverso. Una maglia fine intasarsi facilmente.</li>
	<li>Trasferire l'acqua (circa 50 mL) per il tubo da 50 mL o una bottiglia di plastica di 100 mL. Portare il campione di acqua concentrata al laboratorio.</li>
	<li>Conjugatophytes unicellulari anche crescere in paludi o campi di risaia. In queste zone di acque basse, campione di acqua contenente alghe può campionare direttamente con un contagocce. Quindi, trasferire l'acqua (30-50 mL) per il tubo da 50 mL o una bottiglia di plastica di 50 mL. Nota: L'acqua viene campionata attentamente sopra la superficie del terreno, affinché il campione non contiene alcun terreno.</li>
</ol>2. conferma delle alghe
Nota: Sono necessari i seguenti elementi: una lente di ingrandimento o microscopio portatile e un 60 mm piatto per l'osservazione.
<ol><li>Per confermare la presenza di alghe nel campione mentre è nella pipetta usa e getta, è possibile utilizzare la lente di ingrandimento per osservare il campione direttamente. Nota: Più grandi cellule di circa 400-1.000 µm di lunghezza (ad es., Closterium trifasciata) può essere facilmente osservato utilizzando questo metodo.</li>
	<li>Per confermare le alghe al microscopio portatile, versare il campione di acqua in un piatto di plastica di laboratorio.<ol>
<li>Mettere il campione (3 mL circa) sulla parte interna della metà superiore (coperchio) di 60 mm di Petri, quindi posizionare la metà inferiore, con la sua parte inferiore rivolta verso la parte interna del coperchio, sulla parte superiore. Nota: Questo metodo conserva il campione da movimento e rende più facile l'osservazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparazione di una pipetta capillare di vetro da una pipetta Pasteur per l'isolamento
Nota: Prima di iniziare il processo, sono necessari i seguenti elementi: sterilizzato pipette Pasteur, un rack per le pipette Pasteur, guanti, un bulbo di gomma, una lampada a spirito, metanolo per la lampada di spirito, un accendino, forcipe, un bidone per il vetro e una camera pulita o laminare Cappa a flusso (se necessario).
<ol><li>Accendere un bruciatore ad alcool.<ol>
<li>Per produrre una pipetta capillare di vetro fine per l'isolamento, assicurarsi che la fiamma non è tremolante. Affilare la fiamma e fate sciogliere la pipetta di Pasteur alla sua punta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Un vetro sterile pipetta di Pasteur sulla fiamma, supportata dal lato del bulbo di gomma a mano e sul lato di punta usando il forcipe di calore.</li>
	<li>Prendere la pipetta di Pasteur spegne la fiamma e allungarlo.<ol>
<li>Quando il vetro si sta sciogliendo, rimuovere rapidamente la pipetta di Pasteur dalla fiamma e poi tirare. Nota: In questo esperimento, la pipetta di Pasteur è stata estesa da 15-20 cm. Make sicuro che la pipetta è spento la fiamma durante il tiro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rompere la punta della pipetta capillare di vetro alla lunghezza corretta. Poiché la parte di curvatura è la più bella, è ideale per la punta. Nota: In questo studio, è stata preparata una pipetta capillare di vetro con una mancia di 5-10 cm.<ol>
<li>Assicurarsi di eliminare il capillare dopo fusione esso e confermare che la fiamma è messo fuori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le bolle rilasciate dalla pipetta capillare di vetro indicano le dimensioni della punta di apertura. Selezionare il formato corretto per la cella di essere isolato. Circa 1 mm di bolle è corretto per l'isolamento di specie Closterium , con larghezze di cella di 10-20 µm.</li>
</ol>4. single-cell isolamento mediante una pipetta capillare di vetro
Nota: I seguenti elementi sono necessari prima di iniziare: un microscopio ottico invertito, vetri da orologio, un piatto di plastica e sterile filettati provette contenenti CA mezzo (tabella 1) o condizionata CA media7.
<ol><li>Preparare alcuni vetri da orologio (22 mm di diametro e profondità di 1 mm), ciascuno contenente 1 mL di mezzo sterile di CA.</li>
	<li>Isolare una cellula bersaglio del campione di acqua raccolti sul campo.<ol>
<li>Versare il campione di acqua (circa 30-40 mL) contenenti cellule bersaglio nel piatto in plastica.</li>
		<li>Osservando l'esempio nel piatto di plastica sotto un microscopio ottico invertito, raccogliere singole cellule con la pipetta capillare di vetro.</li>
		<li>Portare la pipetta capillare di vetro accanto alla cella per facilitare l'aspirazione della cellula per azione capillare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire le cellule in un vetro da orologio contenente 1 mL di mezzo di CA sterile (Figura 1a).</li>
	<li>Pick up le celle utilizzando nuovamente una nuova pipetta capillare di vetro dal mezzo CA sterile e trasferirlo in un vetro da orologio secondo contenente mezzo sterile di CA (Figura 1b). Nota: Questo processo viene ripetuto fino a quando una singola cellula è isolata nella piastra di spot (Figura 1C).</li>
	<li>Pick up la singola cella usando una nuova pipetta capillare di vetro e infine di trasferirlo in una provetta contenente 14 mL di medium di CA o medium condizionato di CA (Figura 1D). Incubare il campione a 23 ° C sotto una luce: 8 16-h-h scuro ciclo per 2 settimane. Nota: I fattore sconosciuti per proliferazione delle cellule, che sono secreti dalle cellule crescenti nell'ambiente circostante, sono inclusi nel medium condizionato per facilitare la divisione cellulare4. Se viene stabilita una cultura clonale, preparare il medium condizionato di CA dal terreno di coltura4. La cultura diventa verde se l'operazione riesce.</li>
</ol>

<ol>
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Utilizzando il presente metodo, ceppi 9 cultura clonale di SP. Closterium sono stati stabiliti da 15 cellule isolate dal campione di acqua (Inba1), che rappresenta un tasso di successo del 60%. Identificazione di specie avverrà in futuro di osservazione morfologica, come pure le analisi del DNA, ad esempio analisi filogenetica molecolare8.
Nel presente metodo, la freschezza del campione d'acqua è importante per il tasso di successo. Si consiglia di isolare le cellule dai campioni di acqua appena possibile dopo la raccolta di campi. Anche se le cellule della specie Closterium (ad es., c. trifasciata, c. peracerosum-strigosum-littorale complessi) possono essere mantenute nel campione d'acqua per circa 7 d memorizzandolo a 4-8 ° C, l'isolamento delle cellule è auspicabile il giorno di raccolta o il giorno successivo. È anche importante rimuovere eventuali contaminanti diversi da cellule bersaglio, aumentando così il numero di ripetizioni di lavaggio (cioè, > 3 x) può impedire una contaminazione delle colture di microrganismi nel suolo e nelle cellule.
Una limitazione di questa tecnica è che i mezzi di coltura utilizzati in questo protocollo (CA o medium condizionato di CA) non sono sempre appropriati per coniugare tutte le alghe. In alcuni casi, può essere necessario considerare l'utilizzo di un altro supporto, come pure luce diversa e condizioni di temperatura. Inoltre, come è difficile dimostrare se una cultura è cresciuta da una singola cella, è necessario raccogliere con precisione solo 1 cella durante il trasferimento di cellule in una provetta. Di conseguenza, il trasferimento deve essere effettuato con una pipetta capillare di vetro nuovo ogni volta.
Creazione di una cultura clonale con questa pipetta metodo di lavaggio è un metodo standard di classico/ed è il metodo più affidabile per utilizzare per isolare le cellule desiderate per uno studio. Le culture clonale di alghe utilizzate in molti studi8,9,10,11 di coniugazione sono state stabilite utilizzando il presente metodo. È difficile analizzare la coniugazione alghe senza una cultura clonale. Inoltre, negli ultimi anni, de novo intero genoma sequenze sono diventato facile da ottenere (ad esempio, utilizzando il MinION nanopore sequencer) e instaurazione delle colture clonali faciliterà ulteriormente sequenziamento de novo . In altre parole, questo metodo è il primo passo in futuro lo studio di queste alghe per capire meglio la loro biodiversità.
Al fine di stabilire un ceppo stabile di cultura, è necessario eseguire alcuni passaggi critici con precisione all'interno del protocollo. Il passo più importante è la preparazione di una pipetta capillare di vetro con un'apertura ottima per permettere il passaggio di una singola cella solo. L'apertura della pipetta capillare di vetro deve essere leggermente superiore alla lunghezza di asse minore della cellula di interesse. La pipetta capillare di vetro ottimale può aspirare a una singola cella per azione capillare. Tuttavia, se il diametro del diaframma è troppo grande, il capillare si baserà anche in materiali contaminanti non viventi o anche (un) altro microrganismo, oltre alla cella di destinazione.
Per ottenere una pipetta capillare di vetro con un'apertura ottimale, i seguenti punti sono importanti da notare. In primo luogo, il pilastro della fiamma deve essere stretto durante il riscaldamento la pipetta capillare di vetro. Successivamente, quando si tira la pipetta di Pasteur, deve essere rimosso dalla fiamma; in caso contrario, l'apertura della pipetta Pasteur crollerà.
Le attrezzature e i contenitori mostrati in questo protocollo sono essenziali e possono essere modificati. Ad esempio, utilizzando piastre multi-pozzetto anziché vetri da orologio con un pozzo, il lavaggio della cella possa essere resi più efficiente. Inoltre, i contenitori possono essere sostituiti per altri simili. Con il trasferimento di una singola cella al terreno di coltura nell'ultima fase, può essere stabilita una cultura clonale.
Preparare un contenitore sterile e lavorando in un cappuccio stabilirà axeniche ceppi (incontaminate). Per evitare la contaminazione, è necessario ripetere la fase di lavaggio con aliquote fresche più di 3 volte. A volte, i batteri sono anche sterilizzati aggiungendo antibiotici15.
Questo metodo focalizzato su desmid (Zygnematales) isolamento, ma modificando le dimensioni dell'apertura di pipetta capillare di vetro, può essere applicato per l'isolamento di plancton di dimensioni diverse.

Coniugando le alghe (dell'ordine Zygnematales), noto anche come conjugatophytes, occupano una posizione filogenetica chiave come i parenti viventi più vicini degli antenati immediati di terra piante1,2. Stabilito culture clonale di alghe hanno portato a una vasta gamma di studi tassonomici, fisiologici e genetici negli ultimi anni. Le tecniche di isolamento di microrganismi da un campo naturale hanno una lunga tradizione3,4. Negli ultimi anni, automatizzato isolamento tecniche mediante citometria a flusso sono stati stabiliti5. Il metodo più comune utilizzato per ottenere una singola cella per la creazione di una cultura clonale è l'isolamento di singole cellule utilizzando una pipetta capillare di vetro6. Questo metodo tradizionale richiede abilità e un preciso protocollo sperimentale.
In questo articolo, dimostriamo il campionamento di alghe da campioni del campo e la creazione di culture clonale di alghe unicellulari coniugazione, come le specie di Closterium , utilizzando una pipetta capillare di vetro. Un campione di acqua contenente cellule vegetative è raccolti da un sito di campo (ad es., un lago, stagno o campo di risaia). Le cellule sono isolate dal campione acqua utilizzando una pipetta capillare di vetro e poi lavate. Le cellule sono coltivate in una provetta contenente azoto-completati medio (CA medio) a 24 ° C sotto una luce: 8 16-h-h regime scuro. Questo metodo è anche adatto per l'isolamento di altre microalghe per generare colture clonali.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Sampling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plankton net</td><td>RIGO, Japan</td><td>N-NO380T</td><td>Mesh size: 32 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE)</td><td>Nikon, Japan</td><td>JAN: 4960759 206725</td><td>Magnification: 20&amp;times;</td></tr><tr><td>Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier)</td><td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan</td><td>1985-20</td><td>Magnification: 20&amp;times;</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan</td><td>Sterile spuit No.4</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps)</td><td>Labcon, USA</td><td>3181-345-008</td><td></td></tr><tr><td>Bottle (100 mL Polycarbonate bottle)</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>1-7403-01</td><td></td></tr><tr><td>60 mm dish</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td><td>1010-060</td><td>&amp;nbsp;For observation of algae.&amp;nbsp; 60 mm/non-treated dish</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Preparation of a micropipette&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes (cotton plugged 9&amp;rdquo; Pasteur Pipettes)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>13-678-8B</td><td>7 &amp;times; 225 mm</td></tr><tr><td>Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc)</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>5-5669-01</td><td>10 &amp;times; 40 mm</td></tr><tr><td>Stainless forceps</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>PT-09</td><td>110 mm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single-cell isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Watch glass (Blood reaction board)</td><td>Sekiya Rika Co., Ltd, Japan</td><td>F14-155-030</td><td>to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth</td></tr><tr><td>Threaded test tubes&amp;nbsp;</td><td>Fujimotorika, Co., Ltd, Japan</td><td>XX142</td><td>18 &amp;Oslash; &amp;times; 170 mm</td></tr><tr><td>Inverted light microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>CKX41N</td><td>for isolation of algae.</td></tr><tr><td>Plastic dish</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td><td>SH90-15E&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;90 &amp;times; 15 mm</td></tr></tbody></table>

establishment of a clonal culture of unicellular conjugating algae

È essenziale stabilire colture clonali di microalghe per uso negli studi di vari argomenti, quali fisiologia, genetica, tassonomia e microbiologia. Pertanto, è estremamente importante sviluppare tecniche per stabilire culture clonale. In questo articolo, dimostriamo l'istituzione delle culture clonale di un'alga coniugazione. Campioni di acqua sono raccolti dal campo. Successivamente, le cellule sono isolate utilizzando una pipetta capillare di vetro, inseriti nei media e coltivate in condizioni idonee per la generazione di una cultura clonale.

Un campione di acqua (Inba1) da 50 mL è stato raccolto da un punto di campionamento nel lago Inba-numa (pH 8.1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) al Sakura-shi, Chiba, Giappone, il 25 giugno 2016. Il campione è stato conservato a 4-8 ° C. Il giorno successivo dopo la raccolta, un esemplare di Closterium SP. è stato isolato dal campione di acqua contenente cellule vegetative. Quindici cellule vegetative di morfologia identica (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 e -15) sono stati isolati dal campione e poi lavati con la pipetta metodo di lavaggio. Quindici isolate singole cellule sono state coltivate in provette indipendente contenente 15 mL di medium condizionato di CA. Dopo 2 settimane di incubazione, la proliferazione delle cellule è stata osservata in 9 provette [Inba1-1, -3, -4, -5 (Figura 2a), -6, -9, -10, -12 (Figura 2b) e -13; Tabella 2]. Nove culture clonali sono state stabilite dagli isolati di campione Inba1 (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg"> Figura 1 : Il flusso di isolamento di singole cellule. (un) trasferimento delle cellule algali il singolo bersaglio da campione originale alla sterile medie il primo vetro d'orologio. (b, c) Trasferire di nuovo la cella per il vetro d'orologio prossimo a lavare. Questa procedura deve essere ripetuta fino a quando non ci sono nessun altre cellule/contaminanti rispetto l'obiettivo nel medio; tre vetri da orologio sono mostrati nel diagramma qui come esempio. (d) Infine, trasferire la cella lavata in una provetta del mezzo appropriato per la crescita. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg"> Figura 2 : Fotografie di cellule vegetative di Closterium SP. (un) Inba1-5) e (b) Inba1-12 sono mostrati qui. La barra della scala = 50 µm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg"> Figura 3 : Creazione di una cultura clonale del campione di Inba1. Le provette per 2 settimane in coltura sono state fotografate dal basso. Un asterisco indica la proliferazione delle cellule. La barra della scala = 2 cm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome del supporto</td>
			<td>Riferimento</td>
			<td colspan="2">Commenti</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">CA</td>
			<td rowspan="13">Ichimura e Watanabe12
</td>
			<td>CA (NO3)2·4H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>KNO3
</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4NO3
</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β-Na2glycerophosphate·5H2O</td>
			<td>3 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vitamina B12</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotina</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiamina HCl</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metalli PIV</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe (come EDTA; molare 1:1)</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Aggiungere acqua per fare 100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">pH regolare con NaOH per 7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">Metalli di P IV</td>
			<td rowspan="7">Provasoli e oviducal13
</td>
			<td>Na2EDTA·2H2O</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl3·6H2O</td>
			<td>19,6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2· 4H2O</td>
			<td>3,6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2*</td>
			<td>1,04 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>0,4 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>4·2H na2MoO2, O</td>
			<td>0,25 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Aggiungere acqua per fare 100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fe (come EDTA; molare 1:1)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14
</td>
			<td>Fe (NH4)2(quindi4)2·6H2O,</td>
			<td>70,2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA·2H2O,</td>
			<td>66 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Aggiungere acqua per fare 100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medium condizionato di CA</td>
			<td>Abe et al.7
</td>
			<td colspan="2">Incubare le cellule in medium CA fresco per 14 – 20 giorni. Raccogliere il mezzo di colto mediante filtrazione utilizzando carta da filtro qualitativa e sterilizzare il mezzo filtrato in autoclave (121 ° C per 15 min).</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* Il NIES, 1,04 mg ZnCl2 è sostituito dal 2,2 mg ZnSO4·7H2O.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Formulazioni i supporti utilizzati in questo studio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Campione di acqua</td>
			<td>Nome della cella</td>
			<td>Stato dopo cultura</td>
			<td>Nome della razza</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>Inba1-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>-2</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-3</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>-4</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>-5</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>-6</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>-7</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-8</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-9</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-9</td>
		</tr>
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<td>-10</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>-11</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-12</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-12</td>
		</tr>
<tr>
<td>-13</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-13</td>
		</tr>
<tr>
<td>-14</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-15</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Il riassunto prova di isolamento.

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Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Creazione di una cultura clonale di alghe unicellulari coniugazione

In questo articolo, dimostriamo l'istituzione delle culture clonale di specie algali coniugazione unicellulari raccolti da un sito di campo naturale.

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Views.  Japan Women's University. In questo articolo, dimostriamo l'istituzione delle culture clonale di specie algali coniugazione unicellulari raccolti da un sito di campo naturale.

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The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

Il Barnacle Balanus BalanUs come modello Marine - coltura e l'espressione genica

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Ricerca

Ambiente

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, and trophic interactions primarily due to methodological challenges, including the ability to culture them. This is particularly true for the doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri commonly occurs in productive subtropical continental shelf systems worldwide, often at bloom concentrations capable of consuming a large fraction of daily primary production. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining D. gegenbauri for the purpose of conducting laboratory-based studies. D. gegenbauri and other doliolid species can be captured live using obliquely towed conical 202 &micro;m mesh plankton nets from a drifting ship. Cultures are most reliably established when water temperatures are below 21 &deg;C and are started from immature gonozooids, maturing phorozooids, and large nurses. Cultures can be maintained in rounded culture vessels on a slowly rotating plankton wheel and sustained on a diet of cultured algae in natural seawater for many generations. In addition to the ability to establish laboratory cultures of D. gegenbauri, we demonstrate that the collection condition, algae concentration, temperature, and exposure to naturally conditioned seawater are all critical to the culture establishment, growth, survival, and reproduction of D. gegenbauri.

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

Doliolids, including the species Dolioletta gegenbauri, are small gelatinous marine zooplankton of ecological significance found on productive subcontinental shelf systems worldwide. The difficulty of culturing these delicate organisms limits their investigation. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining the doliolid Dolioletta gegenbauri.

Coltivazione del Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) per studi sperimentali

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact genome. For these reasons, it is considered a useful model organism for marine ecological studies, evolutionary developmental biology, and genomics. As research often requires a steady supply of animal resources, it is useful to establish a reliable, low-maintenance culture system. Here we describe a step-by-step method for establishing an O. dioica culture. We describe how to select potential sampling sites, collection methods, target animal identification, and the set-up of the culturing system. We provide troubleshooting advice based on our own experiences. We also highlight critical factors that help sustain a robust culture system. Although the culture protocol provided here is optimized for O. dioica, we hope our sampling technique and culture setup will inspire new ideas for maintaining other fragile pelagic invertebrates.

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a tunicate model organism in various fields of biology. We describe sampling methods, species identification, culturing setup, and culturing protocols for the animals and algal feed. We highlight key factors that helped strengthen the culture system and discuss the possible problems and resolutions.

Campionamento semplificato e coltivazione del LarvaENo Cosmopolita Pelagico, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

Coupling Carbon Capture from a Power Plant with Semi-automated Open Raceway Ponds for Microalgae Cultivation

In the United States, 35% of the total carbon dioxide (CO2) emissions come from the electrical power industry, of which 30% represent natural gas electricity generation. Microalgae can biofix CO2 10 to 15 times faster than plants and convert algal biomass to products of interest, such as biofuels. Thus, this study presents a protocol that demonstrates the potential synergies of microalgae cultivation with a natural gas power plant situated in the southwestern United States in a hot semi-arid climate. State-of-the-art technologies are used to enhance carbon capture and utilization via the green algal species Chlorella sorokiniana, which can be further processed into biofuel. We describe a protocol involving a semi-automated open raceway pond and discuss the results of its performance when it was tested at the Tucson Electric Power plant, in Tucson, Arizona. Flue gas was used as the main carbon source to control pH, and Chlorella sorokiniana was cultivated. An optimized medium was used to grow the algae. The amount of CO2 added to the system as a function of time was closely monitored. Additionally, other physicochemical factors affecting algal growth rate, biomass productivity, and carbon fixation were monitored, including optical density, dissolved oxygen (DO), electroconductivity (EC), and air and pond temperatures. The results indicate that a microalgae yield of up to 0.385 g/L ash-free dry weight is attainable, with a lipid content of 24%. Leveraging synergistic opportunities between CO2 emitters and algal farmers can provide the resources required to increase carbon capture while supporting the sustainable production of algal biofuels and bioproducts.

A protocol is described to utilize the carbon dioxide in natural gas power plant flue gas to cultivate microalgae in open raceway ponds. Flue gas injection is controlled with a pH sensor, and microalgae growth is monitored with real time measurements of optical density.

Accoppiamento della cattura del carbonio da una centrale elettrica con stagni semi-automatizzati Open Raceway per la coltivazione di microalghe

In the United States, 35% of the total carbon dioxide (CO2) emissions come from the electrical power industry, of which 30% represent natural gas ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

Accoppiamento e di separazione Tetrade Chlamydomonas reinhardtii Per l&#39;analisi genetica

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Biologia

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable photosynthetic models facilitating the understanding of the basic cellular processes. System wide studies enable comprehensive and in-depth understanding of molecular functions of the organisms. However, multiple independent samples and protocols are required for proteomics, lipidomics and metabolomics studies introducing higher error and variability. A robust high throughput extraction method for the simultaneous extraction of chlorophyll, lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample of the green alga Chlamydomonas reinhardtii is presented here. The illustrated experimental setup is for Chlamydomonas cultures synchronized using 12 h/12 h light/dark conditions. Samples were collected over a 24 h cell cycle to demonstrate that the metabolites, lipids and starch data obtained using various analytical platforms are well conformed. Furthermore, protein samples collected using the same extraction protocol were used to conduct detailed proteomics analysis to evaluate their quality and reproducibility. Based on the data, it can be inferred that the illustrated method provides a robust and reproducible approach to advance understanding of various biochemical pathways and their functions with greater confidence for both basic and applied research.

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

System-wide analysis of multiple biomolecules is crucial to gain functional and mechanistic insights into biological processes. Hereby, an extensive protocol is described for high throughput extraction of lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample harvested from synchronized Chlamydomonas culture.

Un metodo di estrazione multi-omics per l'analisi approfondita delle culture sincronizzate dell'Alga verde Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

Biologia dello sviluppo

<meta charset="utf8"></head><body>Migliorare la produzione di clorofilla nelle microalghe attraverso l'ottimizzazione del fattore di crescita

Evaluation of the Effect of Growth Factors on Chlorophylls a and b Production from Microalgae

Microalgae contain two main groups of pigments: chlorophylls and carotenoids. Chlorophyll is a green pigment that absorbs light energy and transforms it into chemical energy to facilitate the synthesis of organic compounds. This pigment serves as a valuable primary source for biotechnological input products in the food, pharmaceutical, and cosmetic industries due to its high antioxidant properties and coloring capabilities. The objective of this research was to evaluate the effect of growth factors (CO2 concentration, light color, and light intensity) through a Taguchi L4 experimental design on cell growth and the cellular content of chlorophyll a and b in Chlorella sorokiniana, followed by validation of the method using Haematococcus pluvialis microalgae as an additional study model. Cell growth was quantified using the optical density spectrophotometric technique at a wavelength of 550 nm. For the quantification of chlorophylls, a cell extract was obtained using a 90% pure acetone solution, and subsequently, the concentrations of chlorophylls a and b were quantified using spectrophotometric techniques at wavelengths of 647 nm and 664 nm, according to the method described by Jeffrey and Humphrey. The experimental results indicated that controlling conditions of low CO2 addition, purple light, and low light intensity increases both cell growth and the concentration of chlorophylls a and b within the cells. The implementation of this chlorophyll quantification method allows for quick, simple, and precise determination of chlorophyll content, as the wavelengths used are at the absorbance peaks of both types of chlorophylls, making this technique easily reproducible for any microalgae under study.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ottimizzazione dei fattori di crescita per la produzione di metaboliti secondari biotecnologicamente rilevanti

The present study highlights the advantages of employing the method developed by Jeffrey and Humphrey for extracting and quantifying fat-soluble pigments from microalgae. This method serves as a valuable tool for assessing the influence of growth factors on chlorophyll production and cellular content in these organisms.

Valutazione dell'effetto dei fattori di crescita sulla produzione di clorofille a e b dalle microalghe

Microalgae contain two main groups of pigments: chlorophylls and carotenoids. Chlorophyll is a green pigment that absorbs light energy and transforms it ...

Creazione di una cultura clonale di alghe unicellulari coniugazione

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Il Barnacle Balanus BalanUs come modello Marine - coltura e l'espressione genica

Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

Coltivazione del Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) per studi sperimentali

Campionamento semplificato e coltivazione del LarvaENo Cosmopolita Pelagico, Oikopleura dioica

Accoppiamento della cattura del carbonio da una centrale elettrica con stagni semi-automatizzati Open Raceway per la coltivazione di microalghe

Accoppiamento e di separazione Tetrade Chlamydomonas reinhardtii Per l'analisi genetica

Un metodo di estrazione multi-omics per l'analisi approfondita delle culture sincronizzate dell'Alga verde Chlamydomonas reinhardtii

Valutazione dell'effetto dei fattori di crescita sulla produzione di clorofille a e b dalle microalghe

Valutazione dell'effetto dei fattori di crescita sulla produzione di clorofille a e b dalle microalghe

Valutazione dell'effetto dei fattori di crescita sulla produzione di clorofille a e b dalle microalghe